Revista Electrnica Granma Ciencia. Vol.12, No.

3, Septiembre - Diciembre 2008 ISSN 1027-975X

Ttulo: Utilizacin de cepas bacterianas para el control Phytophthora Nicotianae Breda de Haan en el cultivo del tabaco (Nicotiana tabacum L.). Autores: Carlos Ros Araluce Norge Gonzlez Ochoa Raquel Arvalo Arvalo Ana Puertas Arias. Institucin: Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal Granma. Carretera Central Va Holgun # 371. Bayamo. Granma. Cuba. E-mail: labsanveg@eimagr.cu cros@udg.co.cu RESUMEN

Phytophthora nicotianae Breda de Haan es el agente causal de La Pata Prieta en el cultivo del tabaco (Nicotiana tabacum L), la enfermedad se presenta tanto en semilleros como en las plantaciones y anualmente provoca daos considerables en la provincia Granma. El uso de controles biolgicos e n el cultivo del tabaco, posibilit una reduccin del 50% de los productos qumicos aplicados, en la ltima dcada. El objetivo de esta investigacin fue buscar cepas autctonas del gnero Bacillus con propiedades antagnicas a Phytophthora nicotianae. Se realiz el aislamiento del hongo y de varias cepas bacterianas del gnero Bacillus. Se realiz enfrentamiento in vitro ante Phytophthora nicotianae determinndose el porcentaje de inhibicin y la velocidad de crecimiento del hongo. Se obtuvo un total de 106 cepas bacterianas del gnero Bacillus. C4 fue la cepa de mejores resultados, inhibi el crecimiento del hongo por encima del 80%, afectando tambin de manera sensible su velocidad de crecimiento.
INTRODUCCIN

El tabaco (Nicotiana tabacum L.) se encuentra entre los cultivos de mayor importancia econmica para la provincia Granma y es objeto de una atencin fitosanitaria priorizada. La pata prieta ( Phytophthora nicotianae Breda de Haan), es la enfermedad que ms afecta al cultivo, tanto en la fase de semillero como en la plantacin. Para su control se emplea un sistema de manejo donde se incluyen diferentes medidas como las prcticas culturales, aplicacin de Trichoderma harzianum Rifai, cepa A53 y de productos qumicos, entre otras (TABACUBA, 2003). A pesar del desarrollo de diferentes mtodos de control, P. nicotianae se considera uno de los patgenos del suelo ms dainos al tabaco, debido a la

falta de fungicidas efectivos a nivel de suelo y races, a la resistencia a los fungicidas sistmicos y a la aparicin de nuevas razas fisiolgicas del hongo (Blancard, 1998). Entre los microorganismos ms importantes para el control de enfermedades se encuentran las bacterias de los gneros Pseudomonas y Bacillus y entre los hongos los ms representativos pertenecen a los gneros Gliocladium y Trichoderma. (Fernndez-Larrea 2006). El incremento continuo de las afectaciones en el cultivo y el control deficiente de la enfermedad con los mtodos de lucha establecidos en el pas indic la necesidad de abordar diferentes investigaciones, desarrollar mtodos cuantitativos para su deteccin en el suelo y determinar la efectividad de alternativas de control. Estos aspectos permitirn adquirir los conocimientos bsicos para aplicar nuevas estrategias de lucha, dismi nuir la incidencia de la enfermedad, evitar el riesgo de epidemias y las prdidas, fundamentalmente en semilleros de tabaco (Fernndez et. al., 2002).
MATERIALES Y MTODOS Aislamiento de Phytophthora nicotianae en el cultivo del tabaco.

El aislamiento se realiz a partir de muestras de provenientes de reas tabacaleras de la CCS Camilo Cienfuegos del poblado de Veguitas, municipio Yara, provincia Granma en la campaa tabacalera 2006 -2007. Los muestreos se realizaron segn la meto dologa de Fernndez, (1997) citada por Arvalo, (2005). A partir de esta muestras se realizaron diluciones seriadas hasta 10 3 . Se tomaron 2 ml de cada dilucin y se inocularon en 20 orificios de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se coloc sobre la superficie de cada orificio un fragmento de 5 mm de dimetro, de una hoja de tabaco variedad Corojo. Las placas se incubaron a una temperatura de 28 + 20C en foto perodos de 12 horas luz y 12 horas oscuridad durante 7 das. Posteriormente cada fragmento se observ bajo el lente del microscopio ptico para determinar el nmero de hojas con infeccin del patgeno, lo cual se logr observando la formacin de esporangios sobre y/o en el borde del disco. Con ayuda de un asa enmangada se retir el cr ecimiento del hongo y se sembr en placas de Petri de 9 cm de dimetro que contenan Papa Dextrosa Agar (PDA). Las placas fueron incubadas durante 15 das a una temperatura de 26 + 20C. Se realiz la identificacin del patgeno mediante la observacin de las caractersticas culturales y estructurales con ayuda de los microscopios estereoscpico y ptico respectivamente y la clave de identificacin. La especie se identific segn la clave de Commonwealth Mycological Institute (CMI), 1978.
Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus. Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus a partir de muestras de suelo .

Se tomaron muestras de suelos provenientes de reas tabacaleras de la CCS Camilo Cienfuegos del poblado de Veguitas, municipio Yara, provincia Granma siguiendo la metodologa descrita en el epgrafe 3.1.

En el laboratorio se tomaron 10 gramos de la muestra, se le aadi suero fisiolgico esterilizado y se mantuvo en agitacin d urante 5 minutos. Luego se realizaron diluciones seriadas hasta 10 6 y se aplic un choque trmico para eliminar las bacterias no esporuladas, Se tom 1 ml de cada dilucin, se sembr con ayuda de la esptula de Drigalski, en placas de Petri de 9 cm de dimetro que contenan Agar Nutriente. Las placas se incubaron durante 48 horas a 28+2C, segn la metodologa citada por Torres (2001). Mediante observacin al microscopio estereoscpico se seleccionaron las colonias con caractersticas similares a las pertenecientes al gnero Bacillus segn el Bergey (1986), se sembraron en placas con agar nutriente y se incubaron a 28+2C durante 24 horas y se les realiz la tincin de Gram. Fueron seleccionadas las bacterias Grampositivas, productoras de esporas y con morfologa bacilar segn Bergey (1986). Los aislamientos con las caractersticas requeridas fueron sembrados en tubos con agar nutriente e incubados durante 72 horas, luego se conservaron a 4 +2 C.
Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus a partir de muestras del cultivo in vitro de plantas.

Los aislamientos se llevaron a cabo en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal a partir de frascos de vitroplantas de ame contaminados con bacterias, provenientes del laboratorio de Biotecnologa de la Universidad de Granma. Se realizaron aislamientos de bacterias que aparecan contaminando el medio de cultivo donde se propagaban vitroplantas de ame (Dioscorea alata L.) clon Caraqueo. Con ayuda de un asa enm angada, en condiciones de asepsia, se sembraron estas bacterias en placas de Petri de 9cm de dimetro que contenan Agar nutriente y se incubaron a 28 +2 C durante 24 horas. Mediante la observacin al microscopio estereoscpico se seleccionaron las colonias pertenecientes al gnero Bacillus siguiendo las caractersticas descritas en el acpite 3.2.1. Los aislamientos con las caractersticas requeridas fueron sembrados en tubos con agar nutriente e incubados durante 72 horas, luego se conservaron a 4+2C.
Seleccin in vitro de cepas de Bacillus spp. promisorias como agentes de control biolgico de P. nicotianae. Antagonismo in vitro

Para evaluar la accin antagnica de las bacterias sobre el crecimiento del hongo se tomaron discos de 5 mm de dimetro de un cultivo de siete das de Phytophthora nicotianae y se colocaron en el centro de una placa de 9 mm de dimetro con el medio PDA. Las cepas bacterianas se sembraron por puncin alrededor del hongo, a razn de tres por placa. Se efectuaron cinco repeticiones de cada una de las combinaciones Bacteria -hongo. En el testigo no se sembraron las cepas bacterianas, todas se incubaron a 28+2C durante siete das. Se seleccionaron como antagnicos los aislamientos bacterianos que limitaron el crecimiento del hongo.

3.3.2 Evaluacin del porcentaje de inhibicin micelial Para la evaluacin del porcentaje de inhibicin micelial, se utilizaron las cepas que resultaron antagnicas en el experimento anterior, a travs del mtodo de dilucin descrito por Jawet z [et al.], (1990). En erlenmeyers de 500 ml con Papa-Dextrosa Agar (sin solidificar) a 40 0 C, se inocul la suspensin bacteriana, luego, el medio fue vertido en placas de Petri estriles de 9 cm de dimetro. En el centro de cada placa, una vez solidifi cado el medio, se coloc un disco de 5mm con el hongo, en el testigo no se inocularon las bacterias, se realizaron cinco rplicas por tratamiento. Las placas se incubaron a 30 C y se observ su crecimiento durante 10 das. Cada 24 horas durante ese tiempo se midi el crecimiento en dimetro del micelio con una regla graduada. Se aadi otro tratamiento con Trichoderma harzianum cepa A-53, que es la utilizada en el control del hongo de inters. En el control no se aadieron las bacterias al medio. Con estos datos se calcul el porcentaje de inhibicin micelial mediante la siguiente frmula (Singh. 2003 ): Inhibicin micelial (%) = ((dc - dt)/dc)) 100 donde: dc = dimetro del micelio del control dt = dimetro del micelio del tratamiento As como la velocidad de crecimiento por da mediante la siguiente frmula:

Velocidad de crecimiento (mmda -1) = dimetro final- dimetro inicial Tiempo transcurrido Los tratamientos para ambas variables fueron comparados a travs de un anlisis de varianza de clasificacin simple y el Test de Rangos Mltiples de Tukey. Se consider diferencias significativas para p 0.05 y se utiliz el paquete estadstico Statistic for Windows, (2002). En el caso del porcentaje de inhibicin se transformaron los datos mediante arcsenx.
RESULTADOS Y DISCUSIN Aislamiento de Phytophthora nicotianae en el cultivo del tabaco.

Al evaluar el crecimiento del hongo en PDA se observ que las colonias eran blancas, de contornos circulares y con crecimiento aracnoide. Los esporangios presentaron papilas prominentes, generalmente unipapilados, rara vez con dos papilas, se caracterizaron adems por tener forma esfrica, con un pedicelo muy corto, difcil de observar al microscopio. Todos los aislamientos mostraron un crecimiento micelial a 37C. La medicin del crecimiento radial vari entre 4,7 a 8,1 mm en 96 h de oscuridad. Estas caractersticas morfolgicas y la temperatura cardinal concuerdan con las descripciones dadas en la literatura para la especie Phytophthora nicotianae Breda de Haan (Newhook [et al.],1978; Hall, 1994). Arvalo (2005), plante que los esporangios se produc en con abundancia, en temperatura de 14 -28 0 C en 48 horas del micelio cultivado en un sustrato rico.

Varios autores plantean que la deteccin de recobrado de Phytophthora por medio de la formacin de esporangios sobre el cebo, determinada por el examen microscpico es considerada la ms confiable y ha sido utilizada por diferentes investigadores como Fernndez (1998).
Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus. Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus a partir de muestras de suelos .

A partir de las muestras de suelos se pudo obtener un total de 102 aislados, con caractersticas que los ubican dentro del gnero Bacillus. Las caractersticas observadas en las bacterias que las ubican dentro del gnero Bacillus fueron las siguientes: Tincin de Gram (Positiva), se observ una morfologa bacilar de las clulas vegetativas, formacin de esporas bacterianas pocos das despus de realizado el cultivo (4 -7 das), colonias lisas y rugosas, con bordes irregulares, convexas y de color blanco. No se observ la presencia de pigmentos en ningn aislado. La morfologa observada coincide con la gama morfolgica del Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey, (1986), para las especies del gnero Bacillus, donde se plantea adems, que las condiciones del medio pueden influir sobre la produccin de pigmentos y las caractersticas culturales en sentido general. Estos resultados coinciden con la literatura reportada sobre aislamientos de bacterias del gnero Bacillus, donde se evidencia la amplia distrib ucin de este gnero en diferentes condiciones ambientales y su gran poder de adaptacin. Sosa et, al. (2006) lograron obtener 323 aislamientos de bacterias a partir de la rizosfera y plantas de tabaco de ocho Provincias de Cuba. Los aislados resultaron ser Gram positivos, con clulas en forma de bastn, alargadas, con formacin de esporas y endosporas y catalasa positiva, ubicndolas dentro del gnero Bacillus.
Aislamiento de bacterias del gnero Bacillus a partir de muestras del cultivo in vitro de plantas.

A partir del cultivo in vitro de plantas se aislaron 4 cepas bacterianas, C1, C2, C3 y C4, con caractersticas que las ubican dentro del gnero Bacillus, las caractersticas observadas fueron las mismas descritas en el acpite anterior. La presencia de bacterias del gnero Bacillus ha sido reportada en el cultivo in vitro de plantas por varios investigadores, tal es el caso de Alvarado et. al., en 1997 encontraron varias cepas de este gnero co mo contaminantes del cultivo in vitro del pltano. En el 2003, este autor report nuevamente la presencia de bacterias de este gnero en el cultivo in vitro de la caa de azcar, entre las que se destacaba Bacillus subtilis, muy utillizada y reportada internacionalmente para el control biolgico del patgenos del suelo.
Seleccin in vitro de cepas de Bacillus spp. promisorias como agentes de control biolgico de P. nicotianae. Antagonismo in vitro.

Se seleccionaron como antagonistas aquellas cepas bacterianas en cuyo alrededor no apareci crecimiento micelial, resultando negativas aquellas en las que el crecimiento fngico cubra la zona de crecimiento bacteriano. De las 106 cepas aisladas, solamente siete mostraron actividad antagnica frente a Phytophthora nicotianae, estas fueron V5, V3 y V12 asiladas del suelo y C1, C2, C3 y C4 aisladas del cultivo in vitro del ame. A los nueve das de montado el experimento, el testigo cubri toda la placa y en los casos anteriormente mencionados se observ un crecimiento micelial diferente al testigo, con el micelio enroscado y sin llegar a cubrir la placa completa. Tambin se pudo apreciar un micelio empobrecido, visto al microscopio estereoscpico. En tod os los casos exista una zona clara entre los dos organismos, sin crecimiento aparente. El hecho de que solamente tres de las 102 cepas aisladas del suelo mostraran actividad antagnica nos es desalentador, ya que concuerdan con resultados reportados por diferentes investigadores como, Sosa (2006) encontr que de 323 aislados bacterianos de suelos, solo 17 manifestaban antagonismo frente a Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, y Phytium aphanidermatum, patgenos fngicos investigados en el cultivo del Tabaco. Otros investigadores como Talavera(1998), plantean que el proceso de seleccin de bacterias antagonistas in vitro se considera el paso ms difcil en el desarrollo de un candidato promisorio para el control biolgico de enfermedades. El mismo autor plante que de 25 aislamientos a partir de la rizosfera de cereales, solo uno produjo una zona de inhibicin clara contra algunos de los Microorganismos probados.
4.3.2 Evaluacin del porcentaje de inhibicin micelial. En la figura 1 se muestra la inhibicin del crecimiento micelial por parte de los antagonistas utilizados. En l se observa la cepa C4 como la de mejores resultados, fue capaz de inhibir el crecimiento micelial en un 90.4 % significativamente superior al resto de las cepas, entr e las que se encontraba la A-53 de Trichoderma harzianum, la cual inhibi el crecimiento en un 85%, frente a C3 la inhibicin del crecimiento fue 82.3% y frente a C2 fue del 80%, los otros aislados no inhibieron el crecimiento por encima del 80%.

100 80
% de Inhibicin Cv: 2.5 E.s.: 0.2

a e d c

60 40 20 0 h
C1 C2 C3 C4 Tri V5 V3 V12 T

Tratamientos

Figura 1. Inhibicin del crecimiento del micelio de Phytophthora nicotianae por cepas de Bacillus spp y Trichoderma harzianum. (Letras diferentes difieren significativamente con p0,05)

Con excepcin de V12 (63%) el resto de los tratamientos inhibieron el crecimiento por encima del 70 %. En el crecimiento del control no se apreci inhibicin, este lleg a cubrir toda la placa. Pueden considerarse las cepas C4, A53, C3 y C2 como moderadamente txicas frente a Phytophthora nicotianae atendiendo al porcentaje de inhibicin a nivel de laboratorio, segn la escala propuesta por Garca (2005), donde se plantea adems que solamente se considera como txica las que inhiban el 100% del crecimiento del patgeno. De esta manera el resto de las cepas se consideran ligeramente txicas (79 -30%). En la figura 2 se muestra la Velocidad de crecimiento del hongo frente a los diferentes tratamientos. No se observan diferencias significativas en cuanto a la Velocidad de crecimiento de Phytophthora nicotianae al enfrentarse a las cepas C2, C3, C4 y Trichoderma, sin embargo se debe destacar que frente a C4 el hongo creci a una Velocidad de 0.51 mm/da y se detuvo a las 72 horas de montado el experimento, frente al resto de las cepas el hongo experiment una Velocidad de crecimiento superior a 1 mm/da y no se detuvo hasta los ocho o nueve das, segn el caso, con excepcin del testigo, el que creci hasta ocupar toda la placa al cabo de 10 das a una Velocidad de 10 mm/da.

Velocidad de 10 8 crecimiento mm/da Cv: 2.2 Es: 0,10

6 4 2 0
C1

bc

bcd
C2

bc cd
C3

bc

d
C4

cd
Tri V5 V3 V12 T

Tratamientos

Figura 2. Velocidad de crecimiento del micelio de Phytophthora nicotianae (Letras diferentes difieren significativamente con p0,05)

Estos resultados concuerdan con los reportes de varios investigadores quienes plantean que el marcado carcter antagnico del gnero Bacillus sobre diferentes hongos fitopatgenos, como son los casos de Dos Santos y De mello (1993), los que aislaron cepas de Bacillus antagnicas a Rhizoctonia solani en Eucalipto. Tambin Sosa [et al.], (2006) encontraron cepas de Bacillus que eran capaces de controlar la Velocidad de crecimiento de diferentes hongos fitopatgenos que afectan al cultivo del Tabaco. Se han obtenido diferentes productos a base de bacterias del gnero Bacillus para el control de hongos fitopatgenos, como es el caso del BIOBAC, obtenido a partir de Bacillus subtilis (cepa INIFAT 101) (Tejeda 2006).
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