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Se tomaron flores para el análisis del polen de cuatro plantas seleccionadas al azar por
tratamiento con UV-B. Las anteras de Limnanthes alba deshicieron el polen gradualmente
a lo largo de la vida de una flor. Por lo tanto, este polen solo se recolectó de flores más
viejas de L. alba en fase femenina . Por el contrario, P. campanularia deshizo rápidamente
las cinco anteras durante la fase masculina anterior. Eliminamos las anteras de P.
campanularia con su polen solo de las flores en fase masculina. Flores enteras
de Limnanthes y Phacelialas anteras se recolectaron cada 3 días y se colocaron en viales de
vidrio previamente limpiados. Cada vial se llenó con etanol filtrado y la suspensión se
dispersó en un baño ultrasónico. Se contó la mitad de la submuestra agitada de la
suspensión de polen utilizando un analizador de tamaño de partículas HIAC-Royco PS-320
(Pacific Scientific Inc., Silver Spring, Maryland) . Duplicar los conteos de polen produjo
una producción total de polen por flor.

Se utilizaron modelos ANCOVA para analizar la producción de polen de L. alba y P.

campanularia . La fecha de cosecha del polen fue la covariable para el ANCOVA y
representó el aumento de la variación en la producción de polen como resultado de un
aumento estacional en la producción de flores androestériles en ambas especies de
plantas. La variación de plantas individuales fue un efecto aleatorio y se usó como un
término de error para probar las hipótesis nulas de que el efecto de la dosis de UV-B era
igual a cero para todos los análisis ANCOVA y MANCOVA.

El 10 de noviembre, 2 días después de que terminaron los tratamientos con UV-B,

recolectamos 19 muestras de polen para el análisis de proteínas de polen. Cada muestra
contenía todo el polen producido por 50 flores elegidas arbitrariamente de 10 a 16 plantas
de P. campanularia de cada tratamiento UV-B. Para tratamientos UV-B más intensos, no
hubo suficiente polen para el análisis de proteínas. Por lo tanto, el polen se agrupó en una
categoría de tratamiento de bajo UV-B (2,74 y 5,01 kJ·m- 2 ·d- 1 ) y alto UV-B (9,17, 11,75
y 15,93 kJ·m- 2 ·d- 1 ). Las anteras de L. alba produjeron muy poco polen de fácil acceso para
obtener la muestra mínima de 1,0 mg requerida para el ensayo de
proteínas. Concentraciones de proteína en P. campanulariaEl polen se analizó mediante el
ensayo de Bradford ( Bradford, 1976 ), primero modificado para muestras foliares ( Jones,
Hare y Compton, 1989 ) y ahora adaptado para polen (Roulston y Cane, datos no
publicados) utilizando el reactivo Biorad (Bio-Rad Laboratories , Nueva York). El polen de
totora, Typha latifolia L., fue nuestro estándar. El porcentaje de proteína en el polen de P.
campanularia para las categorías UV-B baja y alta se comparó mediante análisis ANCOVA
utilizando la masa de la muestra como covariable.

Néctar
El volumen y la concentración de néctar se midieron simultáneamente cada 3 o 4 días en
dos flores de cada planta. Se tomaron muestras de néctar de cinco plantas elegidas al azar
en cada uno de los cinco tratamientos UV-B. Las mediciones comenzaron 14 h después de
regar las plantas en un intento de reducir la variación en el flujo de néctar debido a las
fluctuaciones en el potencial hídrico de la planta. El néctar total secretado durante la vida
de una flor no se pudo medir con precisión porque el sondeo repetido con tubos
microcapilares dañó los nectarios. En cambio, tomamos muestras de flores en fase
femenina cuando se produjeron cantidades adecuadas de néctar y las anteras no obstruyeron
la inserción de las pipetas microcapilares. La concentración de néctar se midió con
refractómetros de bolsillo Bellingham y Stanley (Tunbridge Wells, Reino Unido)
modificados para pequeños volúmenes (0,2 μL). Volúmenes de néctar entre 0,05 y 0,1 μL
paral _ Las flores alba requerían que se tomaran muestras de tres flores vecinas y se
agruparan para obtener una gota lo suficientemente grande para una lectura
refractométrica confiable.  Esto se justificó porque un ANOVA mostró que el 69% de la
variación en la concentración de azúcar ocurrió entre las plantas de L. alba y no entre las
flores de la misma planta. Las lecturas del refractómetro se convirtieron en microgramos de
equivalentes de sacarosa por microlitro utilizando una curva estándar construida a partir de
los datos proporcionados por Bolten et al. (1979) . La masa de azúcar (equivalentes en
microgramos de sacarosa) por muestra de néctar fue el producto de la concentración de
azúcar (equivalentes en microgramos de sacarosa por microlitro) y el volumen de néctar
(microlitros). Numerosas variables ambientales contribuyen significativamente a la
variación de los rasgos florales (Martínez del Río y Búrquez, 1986 ; Frazee y Marquis,
1994 ). Por lo tanto, la temperatura del aire, la humedad relativa y el tamaño de la flor
(diámetro de la corola) se controlaron después de extraer el néctar de cada flor.

Las distribuciones de frecuencia del volumen de néctar, la concentración de azúcar y la

masa de azúcar del néctar estaban sesgadas a la izquierda. Las observaciones se
transformaron log 10 y los nuevos histogramas resultantes fueron normales. La
heterocedasticidad (varianza creciente del rasgo con mayor intensidad de UV-B) también se
redujo como se demostró con Kolmogorov Dprueba. Utilizamos ANCOVA para probar el
efecto de los rayos UV-B, la humedad relativa y la variabilidad de plantas individuales en
la producción de néctar floral y polen, la cantidad de polen y la concentración de
proteínas. MANCOVA se utilizó para probar el efecto general de UV-B en el volumen y la
concentración de néctar simultáneamente. Dado que los rayos UV-B pueden tener efectos
tanto dañinos como beneficiosos, se construyeron contrastes para probar las posibles
tendencias (lineales, cuadráticas y cúbicas) en los datos a partir de coeficientes polinómicos
( Lentner y Bishop, 1993 ).

RESULTADOS
Éxito de floración
Después de un período inicial y presumiblemente uniforme de autoaclareo, 166 plantas de
ambas especies permanecieron vivas cuando se abrieron los primeros botones florales. Solo
el 68% de las 97 L. alba sobrevivientes produjeron flores. El éxito de la floración de L.
alba se distribuyó de manera desigual entre los cinco tratamientos con UV-B, y
proporcionalmente menos plantas produjeron flores con mayores dosis de UV-B ( Fig.
1 ). Este impacto nocivo de UV-B en el éxito de la floración de L. alba siguió una tendencia
lineal. La pendiente de la línea de regresión para el éxito de la floración de L. alba mostró
que se podía esperar que el 3 % de las plantas individuales de L. alba dejaran de florecer
con cada incremento de 1 kJ en la dosis de UV-B ( r  2= 0,550, gl = 4, P < 0,01).

Un raleo más intenso entre P. campanularia dio como resultado que 69 plantas

sobrevivieran hasta la primera floración. Sin embargo, P. campanularia tuvo mayor éxito
en la floración y UV-B no alteró el porcentaje de plantas de P. campanularia que floreci