Análisis y Diseño de Primers para PCR

convencional
(Metaloproteasas MMPs: genes asociados a la
metástasis en Ca de pulmón)

UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS

Facultad de Ciencias Aplicadas

PROCEDIMIENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Isabel Baroja

1
 Informe 1
Analizar el juego de primers diseñados para amplificar la secuencia MMP8 propuesto en la guía de
laboratorio:

GACACATGATGCTGTGAACGTCAGGGTGCTCGCCAGGGAAGGGCCCTACCCAGAGGGACAGAAAGAAAGC
CAGGAGGGGTAGAGTTTGAAGAGAAGATCATGTTCTCCCTGAAGACGCTTCCATTTCTGCTCTTACTCCA
TGTGCAGATTTCCAAGGCCTTTCCTGTATCTTCTAAAGAGAAAAATACAAAAACTGTTCAGAATAAATAA
GCCTTTTCTACAGTAGTGAAGAGGATAAAAAAGAGGAACTGCACTGATGCAACAAATACCTCAAGAGAAG
TCAATTAATGACTACCTGGAAAAGTTCTACCAATTACCAAGCAACCAGTATCAGTCTACAAGGAAGAATG
GCACTAATGTGATCGTTGAAAAGCTTAAAGAAATGCAGCGATTTTTTGGGTTGAATGTGACGGGGAAGCC
AAATGAGGAAACTCTGGACATGATGAAAAAGCCTCGCTGTGGAGTGCCTGACAGTGGTGGTTTTATGTTA
ACCCCAGGAAACCCCAAGTGGGAACGCACTAACTTGACCTACAGGATTCGAAACTATACCCCACAGCTGT
CAGAGGCTGAGGTAGAAAGAGCTATCAAGGATGCCTTTGAACTCTGGAGTGTTGCATCACCTCTCATCTT
CACCAGGATCTCACAGGGAGAGGCAGATATCAACATTGCTTTTTACCAAAGAGATCACGGTGACAATTCT
CCATTTGATGGACCCAATGGAATCCTTGCTCATGCCTTTCAGCCAGGCCAAGGTATTGGAGGAGATGCTC
ATTTTGATGCCGAAGAAACATGGACCAACACCTCCGCAAATTACAACTTGTTTCTTGTTGCTGCTCATGA
ATTTGGCCATTCTTTGGGGCTCGCTCACTCCTCTGACCCTGGTGCCTTGATGTATCCCAACTATGCTTTC
AGGGAAACCAGCAACTACTCACTCCCTCAAGATGACATCGATGGCATTCAGGCCATCTATGGACTTTCAA
GCAACCCTATCCAACCTACTGGACCAAGCACACCCAAACCCTGTGACCCCAGTTTGACATTTGATGCTAT
CACCACACTCCGTGGAGAAATACTTTTCTTTAAAGACAGGTACTTCTGGAGAAGGCATCCTCAGCTACAA
AGAGTCGAAATGAATTTTATTTCTCTATTCTGGCCATCCCTTCCAACTGGTATACAGGCTGCTTATGAAG
ATTTTGACAGAGACCTCATTTTCCTATTTAAAGGCAACCAATACTGGGCTCTGAGTGGCTATGATATTCT
GCAAGGTTATCCCAAGGATATATCAAACTATGGCTTCCCCAGCAGCGTCCAAGCAATTGACGCAGCTGTT
TTCTACAGAAGTAAAACATACTTCTTTGTAAATGACCAATTCTGGAGATATGATAACCAAAGACAATTCA
TGGAGCCAGGTTATCCCAAAAGCATATCAGGTGCCTTTCCAGGAATAGAGAGTAAAGTTGATGCAGTTTT
CCAGCAAGAACATTTCTTCCATGTCTTCAGTGGACCAAGATATTACGCATTTGATCTTATTGCTCAGAGA
GTTACCAGAGTTGCAAGAGGCAATAAATGGCTTAACTGTAGATATGGCTGAAGCAAAATCAAATGTGGCT
GTATCCACTTTCAGAATGTTGAAGGGAAGTTCAGCAAGCATTTTCGTTACATTGTGTCCTGCTTATACTT
TTCTCAATATTAAGTCATTGTTTCCCATCACTGTATCCATTCTACCTGTCCTCCGTGAAAATATGTTTGG
AATATTCCACTATTTGCAGAGGCTTATTCAGTTCTTACACATTCCATCTTACATTAGTGATTCCATCAAA
GAGAAGGAAAGTAAGCCTTTTTGTCACCTCAATATTTACTATTTCAATACTTACATATCTGACTTCTAGG
ATTTATTGTTATATTACTTGCCTATCTGACTTCATACATCCCTCAGTTTCTTAAAATGTCCTATGTATAT
CTTCTACATGCAATTTAGAACTAGATTTTGGTTAGAAGTAAGGATTATAAACAACCTAGACAGTACCCTT
GGCCTTTACAGAAAATATGGTGCTGTTTTCTACCCTTGGAAAGAAATGTAGATGATATGTTTCGTGGGTT
GAATTGTGTCCCCCATAAAAGATATGTTGAAGTTCTAACCCCAGGTACCCATGAATGTGAGCTTACCAGG
GTCTTTGCAGATGTAATTAGTTAAGTTAAGGTGAGATCACACTGAATTAGGGTGGGCTCTAAATCCATTA
TGACTGTTGTTCTTATAAGAAGAAGAGAGGCATAGTCACCTAGGGGAGGAGGCCGTATGAAGACAGAGGC
AGAGATTGGAGTGACGCATCTCCAAGCCAAGGAATTCCAAGGACTGTAAGCCACCAGTAGAAGCTTTGAA
GAGGCAAGGAAGGATTCCCTCCAATAGCCTTCAAGTGTGACCCTGCTGACACCTGCAGAATTCGGACTTC
TATCCTCCAAAACCGTGAGGGAATAAATTTCCTTTGTTTTAAGCCACCAACTTTGCAATACTTTGTTACA
GCAACCCTAGACATGAGGTACTAGACACAGTACATCTACACATATGAAAATGAATCAACACAGAATGCAG
AAGTAGAACCCTTGCTAAGGACTACTGGGCATCTTCCCAGGACAGCAGCCAAAAGAGAACCACCACTTCC
TCTCCTGCCTCCTCCTTGCTCTCTCCTAGAGTCCAAACCCAAATGGGCCAGTTGGATCTGATGTTCGTCA
GTTCTTTACTTCTATTTCCTGGGGTACTCAGGAGGGCACACACTATAGATAACTTGGGTTAGCTGCATAA
AATTCAATGTCTCATTAAGTTGCATTAAACTGAGCTTAGATGTGTAAGTTTGCTAACGGATGGGTTTTTT
TGTTAAGAACTATAGGATTTATGGGACCAAGTCTAGCGAGTCCAGATATCAAAATCATTATAATGTTATA
TTTGCTGTTATTAGAATATAATATAGCTTATTATACAATAAATATGTAGACTGTAAAATATATTTCTCAC
TAGTACCTCCTATTTTCTTTCTCTGTTGAAGTTTTTAAATCCCACAGATAATTAAATTGGCACCTTTATG
CTTGTTCAAAAATTAAAATAATCTATTAAATAAGTTCAAATTAAAGATTTTTACTTCAAATGA

Criterios para el análisis:

1.1. DISEÑO DE CEBADORES

Tamaño del producto de PCR es de 688 pb.

2
CEBADOR Secuencia 5’-3’ Tamaño (nt) Inicio Fin Tamaño amplicón

Cebador MMP8 F AGCCAGGAGGGGTAGAGTTT 20 68 -

688
Cebador MMP8 R TACCTTGGCCTGGCTGAAAG 20 - 755

1.2. ANÁLISIS DE CEBADORES

CRITERIO Cebador MMP8 F Cebador MMP8 R

Tm 62 oC 62 oC

Tamaño 20 20

Contenido de G+C 55% 55%

Hairpins 3 3

Homodímeros 6 10

Heterodímeros 19

Cebador F1
4(G+C)+2(A+T)=Tm
4(11)+2(9)=Tm
62 oC =Tm
Cebador R1
4(G+C)+2(A+T)=Tm
4(11)+2(9)=Tm

3
 Link Oligo Analyzer
https://www.idtdna.com/calc/analyzer

Cebador F1
4(G+C)+2(A+T)=Tm
4(11)+2(9)=Tm
62 oC =Tm

Cebador R1
4(G+C)+2(A+T)=Tm
4(11)+2(9)=Tm
62ºC =Tm
4
 Cebador F1
Tm-(Entre 2-10 oC)=Ta
62-10=Ta
52 oC =Ta

Cebador R1
Tm-(Entre 2-10 oC)=Ta
62-10=Ta
52 oC =Ta

1.3. CÁLCULO DE STOCKS PARA REALIZAR LA MASTER MIX

Completar/modificar la siguiente tabla de acuerdo con la guía y calcular el V2 para 6 determinaciones

REACTIVO C1 C2 V1 (1X) MM V2 (x RX)

Primer Forward 100 μM 0.6 μM 0.15 μL 200 μL

Primer Reverse 100 μM 0.6 μM 0.15 μL 200 μL

Mix dNTPs 10 mM 0.4 mM 1 μL 200 μL

Buffer PCR 10X 1x 2.5 μL 200 μL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 0.75 μL 200 μL

Taq Polimerasa 5U/μL 2,5 U/μM 0.5 μL 8 μL

Agua grado PCR - -

ADN - 5 μL -

Total 25μL -

C1V1=C2V2
MM V2

Primer forward
100*0.15/0.6=V2

V2=8*25 μL
V2=200 μL

Primer reverse
100*0.15/0.6=V2
V2=8*25 μL
V2=200 μL

Mix dNTPs

5
10*1/0.4=V2
V2=8*25 μL
V2=200 μL

Buffer PCR
10*2.5/1=V2
V2=8*25 μL
V2=200 μL

MgCl2
50*0.75/1.5=V2
V2=8*25 μL
V2=200 μL

Taq polimerasa
5*0.5/2.5=V2
V2=8*1 μL
V2 8 μL

1.4. DISEÑO DE PROGRAMA DE PCR

Completar la siguiente tabla de acuerdo con la guía. Revisar las condiciones de denaturación,
hibridación (en base a la Tm/Ta) y extensión y analizar las temperaturas y tiempos seleccionados para
la práctica

ETAPA TEMPERATURA TIEMPO # CICLOS

Denaturación Inicial 94 1min 1
Denaturación 94 1 min
Hibridación 52 45 s 30
Extensión 72 2 min
Extensión Final 72 10 min 1
Refrigeración -80 Hasta su uso 1