4.

ANALISIS ESPECIALES

Entre estas técnicas se incluye algunos métodos aplicables a la determinación de la calidad de los
ingredientes y los productos terminados, con base en su contenido de micronutrientes, tales como fibra
digerible, minerales, vitaminas, actividad enzimática, etc.; así mismo, se presenta el método más
ampliamente utilizado para la cuantificación de óxido de cromo durante la evaluación de la digestibilidad
de las dietas.

4.1. Determinación de Fibra por Detergente Acido.

Este método permite tener una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en el alimento. La
muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en ácido sulfúrico y el residuo es considerado
como la fibra no digerible.

Reactivos

Solución de detergente ácido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco a poco 56 ml de ácido sulfúrico
concentrado, lleve la solución a un volumen final de 2 1 con agua y agregue 20g de Cetil-trimetil-amonio.

Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno).

Acetona.

Materiales y Equipo

Horno

Matraces erlenmayer de 500 ml.

Mantilla de calentamiento.

Condensador de dedo frío.

Crisoles de filtración, porosidad 1.

Procedimiento

Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm.

Tome una submuestra y séquela durante la noche en un horno a 105°C.

Enfríe la muestra en un desecador.

Pese con aproximación de miligramos un gramo de la muestra seca y colóquela en un matraz erlenmayer
de 500 ml.

Adicione 100 ml de la solución de detergente ácido y 2 ml del antiespumante.

Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado.

Lleve rápidamente a ebullición (3 a 5 minutos) y continúe el calentamiento por 2 horas.

Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado.

Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre.

Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succión débil (por vacío).

Enjuague el residuo con acetona y seque.

Coloque el crisol en el horno a 105°C durante 12 horas.

Enfríe dentro de un desecador la muestra e inmediatamente después determine el peso.

Cálculos

Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1)

Donde

W1 = Peso de muestra (g).

W2 = Peso del residuo (g).

FIGURA 7

FIGURA 7

Determinación del contenido de fibra por el método de detergente ácido.

4.2. Determinación de Fibra por Detergente Neutro.

Este método es útil para la determinación de fibras vegetales en alimentos. Aparentemente tiene la
capacidad de separar los componentes nutricionales solubles de aquellos que no son totalmente
aprovechables o que dependen de la fermentación biológica para su aprovechamiento. El método tiene
limitaciones en su precisión cuando los valores de proteína son muy altos y los valores de fibra son bajos.

Reactivos

Solución detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg de sulfato lauril sódico USP,
18.61 g de etilendiamino tetra acetato disódico dihidrogenado dehidratado, 6.81 g de borato de sodio
decahidrato y 4.56 g del reactivo fosfato ácido disódico anhidro. Agítese hasta disolver y mantenga el pH
entre 6.9 y 7.1.

Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H2O mas 10 ml de etilenglicol.

Acetona grado reactivo.

Sulfito de sodio anhídro. Se usa únicamente en análisis de subproductos animales.

Materiales y Equipo

Equipo de reflujo. Cualquier equipo estándar adecuado para el análisis de fibra.

Crisoles de filtración en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa de filtración de
40mm de diámetro con capacidad para 40 – 50 ml de líquido.

Cuando los crisoles se obstruyen después de un uso continuo se prepara una solución limpiadora de 20%
KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasar caliente en en sentidi opuesto a través
del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la solución pues tiende a erosionar el vidrio.

Procedimiento

Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y deposítela en un matraz de

fondo redondo para iniciar el reflujo.

Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra.

Caliente para que la solución hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullición reduzca la
temperatura para evitar la formación de espuma. Ajuste la temperatura para que la solución hierva
suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir.

Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para
succión al vacío. Use poco vacío al principio incrementándolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase
toda la muestra al crisol utilizando un mínimo de agua caliente (80°C) para el lavado del matraz. Elimine
el vacío, afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua
caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra
del filtro y seque con vacío.

Seque los crisoles a 105°C durante 12 h y péselos en caliente (esta operación no debe durar más de 30
seg). Si no se puede pesar de inmediato, enfríe los crisoles en un desecador que contenga como
desecante pentóxido de fósforo (P2O5).
El residuo de fibra recuperado se registra en términos de paredes celulares.

Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100.

NOTA:

En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un material gelatinoso derivado
de los almidones y la proteína, el cual obstruye el filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtración haga
pasar aire en sentido inverso en el crisol. Así mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del
matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullición, calentando rápidamente con agitación
constante.

Cálculos

Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100(((peso del crisol + paredes celulares) -
(peso del crisol))/peso de la muestra.

El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares.

% contenido celular = 100 - % paredes celulares.

Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.

FIGURA 8

FIGURA 8

Determinación del contendido de fibra por el método de detergente neutro

4.3. Ceniza insoluble en Acido Clorhídrico

Este método determina el contenido de substancias minerales insolubles en ácido clorhídrico contenidos
en los alimentos; de acuerdo con el contenido mineral de la muestra se aplica ya sea el método A, para
alimentos con alto contenido de materia orgánica, o el método B, recomendable para alimentos con un
alto contenido de minerales, incluyéndose aquellos cuyo contenido de ceniza insoluble es mayor a 1 % al
evaluarse previamente con el método A.

Reactivos

Solución HCI 3N.

Solución A de ácido tricloroacético al 20%, 20 g en 100 ml.

Solución B de ácido tricloroacético al 1 %, 1 g en 100 ml.

Materiales y Equipo

Placa de calentamiento.

Mufla eléctrica con termostato.

Crisoles de calcinación: Platino o aleación de platino y oro (10% Pt, 90% Au); Rectangulares (60 × 40 × 25
mm) o circulares (60–75 mm de diámetro con 20 – 25 mm de alto).

Método A

Calcine la muestra siguiendo el método de determinación de ceniza. Transfiera el residuo a un vaso de

precipitado de 250 – 400 ml usando 75 ml de ácido clorhídrico 3N y evapore a sequedad, continúe
calentando durante una hora más para deshidratar cualquier sílice presente. Enfríe y agregue 75 ml de
solución de HCI 3N y caliente a ebullición suavemente por 15 minutos. Filtre la solución en caliente a
través de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo con agua caliente hasta que el filtrado deje de
ser ácido.

Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550–700°C en un crisol de platino prepesado,
enfríe en un desecador y posteriormente pese.
FIGURA 9

FIGURA 9

Determinación de ceniza insoluble en ácido clorhídrico. Método A.

Método B

Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximación de 0.001 g y transfiérala a un vaso de

precipitado de 250 – 400 ml. Adicione 25 ml de agua destilada y 25 ml de solución de ácido clorhídrico
3N. Mezcle con cuidado y espere hasta que ya no se liberen gases.

Agregue otros 50 ml de ácido clorhídrico y espere hasta que cese la liberación de gases y coloque el vaso
en un baño maría a ebullición durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre
la solución cuando todavía este caliente con papel filtro libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con
50 ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser ácido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo
el residuo en un crisol de platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 – 700°C.
Transfiera las cenizas a un vaso de precipitado usando 75 ml de ácido clorhídrico 3N y continúe el análisis
como en el método anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra suavemente por 15
minutos.

NOTA:

Si se hace difícil filtrar, repita el análisis reemplazando los 50 ml de ácido clorhídrico 3N con 50 ml de la
solución A de ácido tricloroacético y enjuague el filtro con una solución tibia de la solución B de ácido
tricloroacético.

Cálculos

Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la muestra.

FIGURA 10

FIGURA 10

Determinación de ceniza insoluble en ácido clorhídrico. Método B.

4.4. Carbohidratos Totales Disponibles (Clegg-Anthrone).

Este método determina la cantidad de carbohidratos totales, basándose en su contenido de almidones

hidrolizables y azúcares solubles.

Reactivos

Solución de ácido perclórico al 52 %. 279ml de ácido perclorico (grado específico 1.70) en 100 ml de
agua destilada; deje enfriar antes de usar.

Solución de ácido sulfúrico. 760ml de H2SO4 (grado específico 1.84) en 330ml de agua destilada; deje
enfriar antes de usar.

Reactivo Anthrone. Prepare suficiente reactivo Anthrone preparando una solución de ácido sulfúrico al
0.1 % con el fin de usarla el mismo día.

Solución estándar de glucosa. Disuelva 100mg de glucosa en 100ml de agua.

Solución estándar de glucosa diluida. Diluya 10ml del estándar de glucosa a 100 ml de agua destilada
(1ml = 0.1mg de glucosa).

Materiales y Equipo

Espectrofotómetro.

Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150.

Procedimiento
Extracción:

Pese con aproximación de 0.001g 1.0g de muestra seca ó 2.5g de muestra húmeda conteniendo
aproximadamente de 60 a 300 mg de carbohidratos totales disponibles.

Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con tapón.

Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la muestra.

Adicione 13 ml de la solución de ácido perclórico. Agite constantemente con la varilla de vidrio durante
20 minutos.

Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml. Mezcle y filtre a un matraz
volumétrico de 250 ml.

Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz volumétrico. Afore el matraz con
agua destilada y agite.

Determinación:

Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un tubo de ensaye 1 ml del
filtrado diluido.

Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirán como blancos por duplicado y
coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye.

Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solución de glucosa diluida.

Agregue rápidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recién preparado. Tape los tubos y
mezcle vigorosamente. Colóquelos en un baño maría y caliente durante 12 minutos.

Enfríe rápidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solución a celdas para espectrofotómetro de 1

cm. El color verde es estable sólo por 2 horas.

Lea la absorvancia a 630 nm contra el blanco.

Cálculos

Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 × b)/(a × W)

Donde

W = Peso en g de la muestra.

a = Absorvancia del estándar diluido1.

b = Absorvancia de la muestra diluida.

1 El gráfico es una línea recta én el rango de 0 – 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 – 1.5 mg de glucosa
(automático).

Clegg, K.M. (1956). J.Sci. Food Agric. 7, 40.

FIGURA 11

FIGURA 11

Determinación de carbohidratos totales disponibles en alimentos.

4.5. Nitrógeno Proteico y No Proteico

Esta técnica permite reconocer la porción de nitrógeno de origen proteico y no proteico de los
materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales.

Reactivos

Acetato de cobre monohidratado en solución al 3 % p/v.

Sulfato de aluminio y potasio (2 H2O) en solución al 10% p/v.

Antiespumante de silicona.

Materiales y Equipo

Matraces kjeldhal de 800 ml.

Embudos buchner de 12 cm de diámetro.

Matraces kitazato.

Papel filtro Whatman no. 541 ó Schleicher y Schill no. 1505, de 18 cm.

Procedimiento

Pese 2 g de muestra con más de 25% de proteína cruda, lg para rangos de 25 – 50% de proteína y 0.5g
para materiales con más de 50% de proteína cruda. Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue
aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos gránulos de antiebullente y una o dos gotas del
antiespumante.

Caliente a ebullición durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque). Cuando la muestra esté
todavía caliente agregue 2 ml de la solución de sulfato de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y
caliente a ebullición, adicione 50 ml de la solución de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y
deje enfriar. Filtre usando vacío. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fría.
Para evaluar el nitrógeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrógeno total de
kjeldahl. El nitrógeno no proteico se analiza por medio de la misma técnica a partir del líquido filtrado.
Los resultados respectivos de los sólidos y líquidos por medio de kjeldahl ofrecerán directamente los
datos de nitrógeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.

FIGURA 12

FIGURA 12

Determinación del contenido de nitrógeno proteico y no proteico en alimentos.

4.6. Determinación de Proteínas por el Método de Lowry.

El método más preciso para la determinación de concentraciones proteicas es probablemente el método

de hidrólisis ácida. La mayor parte de los otros métodos son sensibles a la composición de aminoácidos
de las proteínas y no pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no es
la excepción, pero es sensiblemente constante de proteína a proteína, lo cual ha hecho que sea
ampliamente usado y que las determinaciones sean una alternativa completamente aceptable con un
rigor absoluto en todas las determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren
mezclas de proteínas o extractos crudos.

Reactivos

Reactivo de formación compleja. Prepárese inmediatamente antes de usarse, mezclando las soluciones
A, B y C en proporción 100:1:1 respectivamente.

Solución A: 2% (P/V) Na2CO3 en agua destilada.

Solución B: 1% (P/V) CuSO4.5H2O en agua destilada.

Solución C: 2% (P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada.

Solución de Hidróxido de sodio 2N.

Reactivo de Folín (disponible comercialmente): úsese en concentración 21N.

Estándares: Use una solución madre de proteína estándar (por ejem. fracción V de albúmina de suero
bovino) conteniendo 4 mg/ml de proteína en agua destilada, almacenada a -20°C. Prepare los
estándares diluyendo la solución madre con agua destilada tal como se indica en la siguiente tabla:

PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA

Solución madre (μl) 0 1.25 2.50 6.25 12.50 25.00 62.50 125.0 250.0

Agua (μl) 500 499 498 494 488 475 438 475 250

Concentración de proteína (μg/ml) 0 10 20 50 100 200 500 1000

2000

Procedimiento

A 0.1 ml de muestra o sol. estándar, adiciónele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a 100°C durante 10 min
a baño maría hirviendo para hidrolizar la muestra.

Deje enfriar a temperatura ambiente y agréguele 1 ml del reactivo de formación de complejo recién
preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.

Adicione 0.1 ml de reactivo de Folín, agite con un mezclador de vórtice y deje reposar a temperatura
ambiente durante 30–60 min (no exceda este tiempo).

Lea la absorvancia a 750 nm si la concentración de la proteína fuera menor a 500 μg/ml, ó 550 nm si
fuese entre 100 y 2000 μg/ml.

Trace una curva estándar de absorvancia como función de concentración inicial de proteína y úsela para
determinar el contenido de proteína en la muestra.

NOTA

Si la muestra se encuentra como precipitado, disuélvalo en NaOH 2N e hidrolice como en el paso 1. Use
alícuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2.
Todas las células u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por
Burton (1984) para DNA.

Mezcle rápidamente en cuanto el reactivo de Folín sea adicionado; esto es importante para obtener una
adecuada reproductibilidad.

Se requiere un grupo de estándares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.

FIGURA 13

FIGURA 13

Determinación de proteína en alimentos por el método de Lowry

4.7. Determinación de Urea

Este método permite cuantificar el contenido de urea en ingredientes alimenticios.

Reactivos

Carbón activado

Solución Carrez I: disuelva 21.9 g de acetato de zinc dehidratado en agua, agregue 3 ml de ácido acético
glacial y diluya a 100 ml con agua destilada.

Solución Carrez II: disuelva 10.6 g de ferrocíanuro de potasio en 100 ml de agua destilada.

Acido clorhídrico 0.02N.

Solución de acetato de sodio: disuelva 136 g de acetato de sodio trihidratado en 1000 ml de agua.

Solución de 4-dimetilaminobenzaldehído: disuelva 1.6 g de 4- dimetilaminozenzaldehído (4-DMAB) en

100 ml de etanol al 96% y adicione 10 ml de ácido clorhídrico (d=1.18 g/ml).

Solución estándar de urea: disuelva 0.1 g de urea en 100 ml de agua.

Materiales y Equipo

Agitador rotatorio

Espectrofotómetro con celdas de 10 mm.

Procedimiento

Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisión de 0.001 g, o una cantidad que se espera
contenga de 50 a 200 mg de urea y colóquela en un matraz volumétrico de 500 ml. Agregue 150 ml de
ácido clorhídrico 0.02N, agite por 30 min y adicione 10 ml de la solución de acetato de sodio y mezcle.
Agregue 1 g de carbón activado, agite perfectamente bien y deje reposar la mezcla por 15 min. Adicione
5 ml de la solución Carrez I, seguido por 5 ml de la solución Carrez II, mezclando perfectamente bien
entre las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en
un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco.

Determinación

Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapón esmerilado, adicione 10 ml de la solución 4-
DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la absorvancia de la solución a 435 nm en una celda de
10 mm, contra una solución de referencia preparada con los reactivos.

Curva de Calibración

Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solución de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10 ml de cada solución a
tubos de ensaye con tapón esmerilado y adicione 10 ml de la solución 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje
reposar por 15 minutos, mida la absorvancia como se señaló anteriormente contra una solución de
referencia preparada con 10 ml de solución 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una gráfica relacionando las
absorvancias con la cantidad de urea presente.

Expresión de Resultados
Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibración elaborada.
Exprese los resultados como por ciento de la muestra.

% Urea × 0.4665 = % N urea.

NOTA:

Si la muestra está muy coloreada, la cantidad de carbón activado deberá ser incrementada arriba de 5 g.
La solución final después del filtrado deberá ser incolora.

FIGURA 14

FIGURA 14

Determinación del contenido de urea en ingredientes alimenticios.

4.8. Acido Urico.

A través de este método es posible determinar el contenido de ácido úrico y sus sales tanto en gallinaza
como en alimentos e ingredientes que los constituyen.

Reactivos

Solución de hidróxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de agua, mezcle bien y almacene la

solución en un envase de plástico.

Solución neutra de formaldehido.

Verifique la concentración de la solución disponible, para lo cual mezcle 30 ml de ésta con 50ml de
solución de NaOH IN y 25ml de solución de Peróxido de hidrógeno (20 volúmenes). Caliente en baño de
vapor hasta que no haya más efervescencia. Enfríe y titule con NaCl IN usando indicador de fenoftaleína.
Realice una titulación de blanco usando 3 ml de agua en lugar del formaldehído y calcule la
concentración como sigue:
1ml de la solución de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehído.

Conc. de formaldehído (g/100 ml) = ((B-T) × ((0.0300 × 100)/3)

Donde

B = Titulación del blanco.

T = Titulación de la muestra.

Prepare una solución neutra que contenga 17.5g de formaldehído con 250ml de agua y 500ml de etanol.
Ajuste el pH a 7.0 con una solución de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste
nuevamente el pH de ser necesario.

Solución buffer de succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de ácido succínico en 750ml de agua y
20ml de la solución de NaOH. Deje enfriar y adicione una cantidad adecuada de solución de formol que
contenga 17.5g de formaldehído, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0 con la solución de NaOH. Diluya a
1000ml con agua destilada, mezcle y ajuste el pH si es necesario.

Solución de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na2S2O3.5H2O en 1000ml de agua destilada.

Solución de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de lactato de plata en 50ml de agua
destilada y 1ml de ácido láctico. Diluya a 100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No lo
exponga a la luz directa.

Solución de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO4.7H2O y 17.5g de NH4CL en 50ml de agua.
Agregue 30ml de NH4OH (d = 0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua.

Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solución de lactato de plata con 15ml de solución de
magnesio amoniacal. Adicione 50ml de hidróxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mézclese bien. Prepárese
inmediatamente antes de usarse.

Solución estándar de ácido úrico. Pese 250mg de ácido úrico con una precisión de 0.1mg y transfiéralo a
un matraz de fondo redondo acoplado a un condensador de reflujo. Adicione 100ml de la solución de
formaldehído etílico y caliente a reflujo en un baño de vapor por 30min agitando frecuentemente. Enfríe
y transfiera a un matraz volumétrico de 250ml, lavando el matraz redondo con sol. de formaldehído
etílico, afore con esta solución y mezcle. 1 ml contiene 1 mg de ácido úrico.

Eter de petróleo, punto de ebullición 40 – 60°C.

Materiales y Equipo

Epectrofotómetro con celdas de cuarzo de 10 mm.

Tubos de cristal para percolación, con aproximadamente 240 mm de longitud, 18 mm de diámetro

interno, y en la parte inferior aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de diámetro interno.

Extracción del ácido úrico:

De la gallinaza: Pese con una aproximación de 0.001 g cerca de 0.4g de gallinaza seca y colóquela en un
matraz de fondo redondo de 150ml. Adicione 60ml de solución neutra de formaldehído, conecte a un
condensador de reflujo y caliente en baño de vapor por una hora. Enfríe y filtre a través de un crisol
(Porosidad 4) a un matraz volumétrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones
de 10ml de solución de formaldehído etílico, pasando cada porción por el crisol de filtración al matraz
volumétrico. Afore con la misma solución y agite.

De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximación de 0.001 g y desengrasela por extracción
con éter de petróleo. Transfiera cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo
redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire. Continúe el análisis como
previamente se señaló, iniciando con la adición de 60 ml de solución de formaldehído etílico.

Determinación

Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra prepesado, según los métodos descritos, a
un tubo de centrífuga de 50 ml. Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y
déjelos reposar en la oscuridad por una hora. Centrifuge a 2000 rpm por 15 min. Retire el sobrenadante
y deje escurrir por 10 min. Cuidadosamente limpie cualquier líquido remanente sin perturbar el
precipitado y adicione 20 ml de solución de tiosulfato de sodio. Disuelva el precipitado, agitando con una
varilla de vidrio delgada. Con una pipeta transfiera 5 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 200
ml conteniendo 40 ml de solución buffer de succinato, afore con agua destilada y mezcle bien. Mida la
absorvancia de la solución a 294 nm en celdas de sílice de 10 mm comparada contra una solución
preparada mezclando 5 ml de solución de tiosulfato de sodio con 40 ml de solución buffer de succinato
aforada a 200 ml con agua destilada. Determine la cantidad de ácido úrico mediante una curva de
calibración.

Curva de Calibración:

En una serie de tubos de centrífuga de 50 ml de capacidad transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml

de solución estándar de ácido úrico (equivalentes a una cantidad similar de ácido úrico en mg) y llévelos
a 20 ml con la solución de formaldehído etílico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y
Hitchcock, mezcle bien y déjelo reposar en la oscuridad por una hora. Continúe el método como en la
determinación a partir del centrifugado. Mida la absorvancia de la solución y trace la curva de
calibración graficando absorvancia (y) contra la cantidad correspondiente de ácido úrico en mg (x).

Expresión de Resultados

El contenido de N del ácido úrico como % de la muestra está dado por la fórmula:

% N = A/(6 × W)

Donde

A = mg de ácido úrico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado por la medición
fotométrica.

W = peso de la muestra en g.

FIGURA 15

FIGURA 15

Determinación de ácido úrico en gallinaza e ingredientes alimenticios

4.9. Ceniza Soluble e Insoluble en Acido.

Este método proporciona una estimación de la disponibilidad de minerales en base a su digestibilidad en

ácido.

Reactivos, Materiales y Equipo

Acido clorhídrico (1–2.5 % v/v)

Papel filtro libre de ceniza

Crisoles de porcelana

Procedimiento

Use el residuo obtenido de la determinación de ceniza. Caliente 25 ml de ácido clorhídrico con cuidado
para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con agua caliente hasta que quede libre del ácido.
Coloque el papel filtro y el residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colóquelo en la mufla a
600 °C durante 2 horas o hasta que quede libre de carbón.

Cálculos

Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con ácido/Peso de la muestra)

FIGURA 16

FIGURA 16

Determinación de ceniza soluble e insoluble en ácido clorhídrico

4.10. Determinación de Calcio en el Alimento.

La evaluación de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con el fósforo u
otros minerales generará un bajo crecimiento.

Reactivos

Acido clorhídrico (1 – 3 %)

Acido nítrico 70%

Hidróxido de amonio (1:1 v/v)

Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol)

Solución de oxalato de amonio 4.2 %

Acido sulfúrico 98 %

Solución estándar de permanganato de potasio 0.05N

Materiales y Equipo

crisoles de porcelana

matraces volumétricos de 250 ml

vasos de precipitado de 250 ml

Papel filtro para análisis cuantitativos libre de cenizas

Procedimiento

Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y unas gotas de
HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullición, enfríe y transfiera a un matraz volumétrico de 250ml,
afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales ó
25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione
NH4OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color
rosa. Diluya con 50ml de agua, hierva y adicione con agitación 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio.
Ajuste el pH con ácido para regresar al color rosa si es necesario.

Déje reposar, filtre y lave el precipitado con la solución de NH4OH (1.5%). Coloque el papel filtro con el
precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de H2SO4, caliente a 70°C y titule
con la solución de permanganato y calcule:

Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato/Peso de la Muestra) × (Alicuota usada en ml/250)

FIGURA 17

FIGURA 17

Determinación de calcio en alimento e ingredientes alimenticios.

4.11. Determinación de Fósforo

Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de los organismos cultivados,
debiendo estar presente en las dietas en cantidades suficientes para satisfacer las necesidades
metabólicas de los organismos. Este elemento en proteínas de origen vegetal puede estar formando
parte de fitatos, por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una
determinación de ácido fítico previa al uso de tales materiales.

Reactivos

Reactivo de Molibdato. Disuelva 40 g de molibdato de amonio 4.H2O en 400 ml de agua caliente y

enfríe. Disuelva 2 g de metavanadato de amonio en 250 ml de agua caliente, enfríe y adicione 450 ml de
ácido perclórico al 70%. Gradualmente adicione la sol. de molibdato a la sol. de vanadato con agitación y
diluya a 2 1.

Estándar de Fósforo. Prepare una solución stock disolviendo 8.788 g de Ortofosfato dihidrógeno potasio
en agua y llévelo a 1 1. Prepare la solución de trabajo diluyendo la sol. stock 1 en 20 (Conc. de trabajo
0.1 mg P//ml).

Materiales y Equipo

Espectrofotómetro para leer a 400 nm

Matraces graduados de 100 ml

Procedimiento

Pase una alicuota como en la determinación de Ca a un matraz de 100 ml y adicione 20 ml del reactivo
de molibdovanato. Aforelo, mezcle y deje reposar por 10 min.

Transfiera alicuotas del estándar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 mg de P en matraces de 100
ml y trátelos como al anterior.

Lea la muestra a 400 nm ajustando el estándar de 0.5 mg a 100% de transmisión.

Determine mg de fósforo en la muestra usando una curva estándar.

FIGURA 18

FIGURA 18

Determinación de fósoforo en dietas e ingredientes alimenticios.

4.12. Determinación de Cloruro de Sodio

Este método permite determinar la cantidad de sal presente en harina de pescado y otros ingredientes.

Reactivos

Solución estándar 0.1N de Nitrato de Plata

Solución estándar 0.1N de Tiocianato de Amonio

Indicador Férrico - Solución acuosa saturada

Solución de Permanganato de Potasio 6 % p/v

Solución de Urea 5 % p/v

Acetona grado analítico

Acido Nítrico concentrado

Procedimiento

Pese 2 g de muestra en un matraz erlenmayer de 250 ml, humedezca la muestra con 20 ml de agua,
adicione con pipeta 15 ml de la solución de nitrato de plata y mezcle bien.

Adicione 20 ml de Acido Nítrico concentrado y 10 ml de la solución de Permanganato de Potasio y

mezcle. Caliente continuamente la mezcla hasta que el líquido se aclare y desaparezca los vapores
nitrosos, enfríe.

Adicione 10 ml de Solución de Urea y deje reposar por 10 min.

Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador férrico y titule el exceso de nitrato de plata con la solución
de Tiocianato hasta el punto final rojo-café.

Cálculos

Calcule resultados como NaCl

%NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH4CNS × 0.585)/g de muestra

FIGURA 19

FIGURA 19
Determinación de cloruro de sodio en harina de pescado y otros ingredientes

4.13. Determinación de Potasio

Reactivos

Acido Clorhídrico concentrado.

Solución estándar de Potasio: Para preparar solución stock (500 ppm), disuelva 0.477 g de Cloruro de
Potasio y llévelo a 500 ml con agua destilada. Para preparar el estándar de trabajo (10 ppm), diluya 1:50.

Aceite de oliva (puro)

Materiales y Equipo

Crisoles de Sílice.

Fotómetro de flama

Mufla

Procedimiento

Seque 2 g de muestra en un crisol de sílice a 100°C para eliminar la humedad. Adicione unas cuantas
gotas de aceite de oliva y caliente sobre la flama hasta que deje de producir flama.

Calcine a 500°C en la mufla por 24 h, enfríe y adicione 2 ml de HCI concentrado para disolver el residuo.

Llévelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solución y haga una nueva dilución a 100 ml con
agua destilada.

Ajuste el fotómetro de flama para que de una lectura de 100 con el estándar de 10 ppm y lea la solución
muestra.
Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilución al momento para dar una lectura
apropiada.

FIGURA 20

FIGURA 20

Determinación del contenido de potasio en ingredientes alimenticios.

4.14. Cuantificación de óxido de cromo en heces y alimentos (Furukawa y Tsukahara, 1966)

El óxido de cromo es el marcador más ampliamente utilizado durante la evaluación de la digestibilidad

en dietas experimentales para peces. El método aquí presentado es una modificación del propuesto por
Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinación del contenido de óxido
de cromo en dietas y heces.

Reactivos

Acido nítrico concentrado, gr.

Acido perclórico, g.r.

Materiales y equipo

Espectrofotómetro

Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml

Matraces kjeldahl de 100 ml

Matraces volumétricos de 25 ml

Procedimiento

Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habrá eliminado previamente escamas y
cualquier otra materia extraña; manténgalos a sequedad. Pese con precisión de 0.0001g de 50 a 100mg
de muestra, colóquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso
de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullición suave por un mínimo de 30 min
hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad
de líquido y continúe habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de ácido nítrico y siga digiriendo. Al
término la solución debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar.

Ya fría la solución, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de ácido
perclórico. Realizar la adición dentro de una campana de extracción y con mucho cuidado, ya que en
caso de una digestión incompleta se puede presentar una reacción explosiva. Coloque nuevamente el
matraz en el digestor y continúe la ebullición hasta que la solución vire de verde a amarillo limón;
apague el digestor y deje enfriar. Ya frío se debe formar un anillo rojizo en el borde del líquido; en caso
de no formarse o si el líquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea
permanente.

Pase el líquido frío a un matraz volumétrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con
agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotómetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El
blanco se prepara simultáneo a la muestras usando solamente los ácidos y agua destilada.

Cálculos

a) Calcule la cantidad de óxido de cromo (mg) presente en la muestra:

X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4

Donde

Y = absorvancia

0.0032 y 0.2089 son constantes

b) Calcule el % de óxido de cromo en la muestra:

O.C.% = 100(X/A)

Donde

X = peso del óxido de cromo

A = peso de la muestra

FIGURA 21

FIGURA 21

Determinación de óxido de cromo en alimentos y heces.

4.15. Método de Carpenter para la determinación de Lisina Disponible (Tejada, 1985)

El método permite determinar la cantidad de lisina libre que reacciona con el l- fluorodinitro benceno.

Reactivos

Solución madre de Mono E N dinitrofenil - lisina HCI (p. m. 366.77, 39.85 % lisina) Disolver 314 mg en
250 ml de HCl concentrado. Se disuelve lentamente, de manera que hay que iniciar su preparación un
día antes.

Solución estándar diluida de DPN-lisina. Diluya 10 ml de la solución madre en 100 ml de agua destilada
para formar el estándar. Hecho lo anterior, 2 ml de la solución contienen alrededor de 0.1 mg de lisina y
disuelto a 100 ml da una absorción neta de alrededor de 0–4 a 435 nm en celdilla de 1 cm.

Solución de 1 - fluoro 2,4 dinitrobenceno (FDNB). Manéjese con guantes de plástico desechables. Sí el
FDNB está sólido colóquese en balo de agua caliente para que se funda, tome con una pipeta automática
aproximadamente 0.4 ml y disuelva en 15 ml de alcohol etílico por muestra. Debe prepararse
diariamente.
Cloruro de metoxicarbonil (cloroformato de metilo). El MCC es inestable por lo que se debe almacenar
en refrigeración. Manéjese con cuidado.

Solución de bicarbonato de sodio al 8% en agua destilada.

Eter etílico libre de peróxidos.

Solución de fenoftaleína, 500 mg/l de alcohol etílico al 60%.

Solución de hidróxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a 8.5 durante la reacción del MCC.
Debe almacenarse en frasco de plástico. Tener a la mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier
exceso.

Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de NaHCO3 y 1g de Na2CO3 en 250
ml de agua destilada; ajuste el pH si es necesario. Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para
evitar pérdida de CO2

Acido clorhídrico concentrado

Materiales y Equipo

Tamiz de 0.5 mm

Matraces de fondo redondo

Matraz volumétrico de 250 ml

Baño maría

Rotoevaporador

Aparato de reflujo

Papel filtro Whatman 541

Tubos de ensaye con tapón

Perlas de vidrio

Espectrofotómetro

Procedimiento

Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar deberá contener
alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 – 2g de la muestra. Pasela a un matraz de
fondo redondo. Agregue 2–3 perlas de vidrio y 10ml de NaHCO3, agitar suavemente para que la muestra
no se adhiera a las paredes.

Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la muestra se quede en las
paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un baño de agua hirviendo el matraz debe perder
aproximadamente 12.5g.

Enfríe y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua presente, se tendrá un
volumen de 40ml y una concentración de ácido de 6M. Reflujar suavemente durante 16 horas.

Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en caliente a un matraz
volumétrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias veces con agua destilada y colecte en el
matraz volumétrico; afore en frío con agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de
dinitrofenol que se puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el éter.

Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapón, etiquetándolos A y B. Agregar al tubo B 5 ml de éter y
agita. Extraiga el éter (capa superior) con una pipeta automática. Coloque el tubo en un baño a 90°C
hasta que se elimine todo el éter y enfríe.

Agregue una gota de fenoftaleína al tubo, adicione gota a gota la solución de NaOH hasta que aparezca
un ligero color rosado; añada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de
metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presión con cuidado. Después de 5
ó 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar la formación de espuma.
Se extrae cuatro veces la solución con éter como se describió anteriormente. Elimine el éter residual en
baño maría, enfríe y lleve el volumen 10 ml con agua destilada.

Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con éter el tubo A; elimine el
éter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el
espectrofotómetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B (blanco) es la
absorvancia atribuible al DNP - lisina.

Absorvancia del estándar DPN - Lisina

Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento ya indicado-Practicar hasta
que se tenga confianza en las manipulaciones. La absorvancia neta se usará para calcular las muestras
problema. El blanco B tiene generalmente una absorvancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar el
procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de carbonato, la longitud de onda a
que se está leyendo y el éter libre de peróxidos.

Precauciones con alimentos de origen vegetal.

En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrólisis total a las 16 horas y como un
tiempo más largo se descompone el DNP-L, debe hacerse una segunda digestión con materiales
desconocidos. Para lograr esto, después de la digestión se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se
señaló. El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas perlas de vidrio (se
pueden juntar los residuos de las réplicas); el volumen del ácido clorhídrico debe ser menor a 30 ml. Se
deja en reflujo por 16 horas, se filtra en caliente y se lleva a 100 ml según el procedimiento ya descrito. Si
el resultado es muy pequeño se elimina, o de lo contrario, se hacen las correcciones necesarias para el
material.

Para determinar la pérdida de DNP-L se debe calcular un factor de corrección, el cual varía con el
material. Para su cálculo, consultar a: Makade, M.L. y Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271.

Cálculos

C = (Ws × Au × V × 100 × 100)/Wu × As × a (cp)

Donde

C= g de lisina/16g de N

Ws= Peso del estándar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 sí se prepara como se indica.

Wu= Peso de la muestra en mg

As= Absorción neta del estándar

Au= Absorción neta del desconocido

V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda digestión).

a= Alícuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml.

CP= Proteína cruda, 6.25 × g N/100g material.

Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la fórmula.

NOTA:

El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los hidrolizados y
soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz especialmente a pH alcalino.

FIGURA 22

FIGURA 22

Determinación de lisina disponible en ingredientes alimenticios.

4.16. Análisis de Melazas

Los peces, según su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar carbohidratos en su dieta,
por lo cual se considera importante contar con un método rápido para la determinación de azúcares
totales disponibles.

Reactivos:

Solución de Fehling (modificada por Soxhlet):

Disuelva 34.639g de Sulfato de Cobre 5H2O en agua destilada, afore a 500ml, filtre.
Disuelva 173 g de tartrato de sodio y potasio 4.H2O y 50 g de Hidróxido de Sodio en agua destilada,
diluya a 500 ml, deje reposar por 2 días y filtre a través de asbesto preparado.

Estándar de Azúcar invertida. Prepare una solución stock adicionando 5ml de HCL (Sp. g 1.18) a 9.5g de
sacarosa en solución y diluya a 100ml con agua destilada. Después de almacenar por 2 días a
temperatura ambiente, afore a 1000 ml con agua destilada. Prepare soluciones de trabajo que
contengan 5mg/ml, para lo cual mida con una pipeta volumétrica una alícuota de 100 ml de la solución
stock. Vacíe a un matraz volumétrico de 200 ml y neutralice con una solución de NaOH al 20%, usando
fenoftaleína como indicador, lleve a volumen y mezcle.

Acido Clorhídrico concentrado (Sp.g 1.18).

Acido Clorhídrico (0.5N).

Hidróxido de Sodio, Solución 20%.

Indicador de Fenoftaleína (1% en etanol).

Indicador de azul de metileno (1% en agua).

Materiales y Equipo

Calentador eléctrico

Matraces erlenmayer de 500 ml

Procedimiento

Disuelva 8g de melaza y llévela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del filtrado con 5ml
de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftaleína como
indicador y diluya a 200 ml.

Estandarización de la Solución Soxhlet: Mida 10ml de la solución Soxhlet (a) y (b) con una pipeta
volumétrica y vacíe a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un
volumen de estándar de trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solución Soxhlet. Llévelo a
ebullición y déjelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y rápidamente complete la
titulación mientras está hirviendo, hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y
determine el volumen de solución requerido para reducir completamente 20 ml de solución Soxhlet.

Titulación de Muestra: Primero realice una titulación aproximada; pase a un matraz 10ml de las
soluciones (a) y (b), adicione alícuotas de 10ml de la solución muestra. Añada 40 ml de agua y llévelo a
ebullición. Si persiste el color azul, titule con una solución estándar de trabajo y calcule el contenido
aproximado de azúcar en la muestra. Para determinar con precisión el contenido de azúcar, pase a un
matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b); adicione una alícuota de la solución muestra. El volumen
de muestra usado dependerá del contenido de azúcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la
tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullición, agregue estándar de trabajo con una bureta hasta que la
titulación sea casi completa. Añada azul de metileno y complete la titulación.

VOLUMEN DE MUESTRA USADO EN LA TITULACION SOXHLET (AOAC, 1970)

ml de H2O ml de muestra g de muestra en alícuota Total como azúcar invertida (%)

40 10 0.08 73

35 15 0.12 82-58

30 20 0.16 61-41

25 25 0.20 49-35

20 30 0.24 49-29

Calcule el % de azúcar (como invertida) = (F - M) × I × 100/w

Donde:

F= Volumen de estándar necesario para reducir 20 ml de Solución Soxhlet.

M= Volumen de solución estándar de azúcar requerido para completar la titulación

I= Peso de la azúcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo.

W= Peso de la muestra en la alícuota usada.

FIGURA 23

FIGURA 23

Determinación de azúcares totales disponibles en melaza

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