MEDICION DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

ÍNDICE:

1.- MEDIDA DE MASA CELULAR

1.1.- MÉTODOS DIRECTOS
1.2.- MÉTODOS INDIRECTOS
2.- MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS
2.1.- MÉTODOS DIRECTOS
2.2.- MÉTODOS INDIRECTOS
3.- NUMERO MÁS PROBABLE

En la práctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con

poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su
crecimiento en un medio de cultivo. Comenzaremos con algunos métodos habituales de
medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales serán aprendidos “en vivo” en las
prácticas de laboratorio. El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede
expresar en función de: Aumento de masa del cultivo y Aumento del número de células.

El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a
cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa
celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular
(grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población).

El crecimiento se puede determinar por: métodos directos y métodos indirectos.

Métodos directos:

 Recuento del número de células en una cámara Thoma

 Peso seco celular
 Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
 Determinación de DNA
Métodos indirectos:

 Recuento de colonias en placa

 Recuento sobre filtro de membrana
 Consumo de oxígeno
 Liberación de dióxido de carbono
 Concentración de un enzima constitutivo
  Decoloración de un colorante
 Incorporación de precursores radiactivos
 Medida de la turbidez

1.- MEDIDA DE MASA CELULAR

Para muchos estudios especialmente aquellos relacionados con la bioquímica de los
procesos de crecimiento, se prefiere determinar la masa de la población más que el
número de células presentes. La masa se puede determinar directamente determinando el
peso seco o húmedo de la muestra. También se puede determinar el contenido de
nitrógeno o el contenido de proteínas o de ADN. Otra forma de estimar la masa celular de
una manera indirecta es determinando la actividad metabólica de la célula por ejemplo
determinando el consumo de oxígeno o producción de dióxido de carbono.

1.1 MÉTODOS DIRECTOS

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una
suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de
bacterias.

El aumento de volumen con la humedad tiene un límite. Este va creciendo hasta que la
célula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de saturación de la
pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las especies en cálculos técnicos. A
partir de éste valor el volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el
volumen de las células no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor
del 30 % es un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su punto de
saturación de la pared celular”.

a). Determinación del peso húmedo:

▪ Se tara un tubo de centrifuga,

▪ Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante,

▪ Se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía
depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del
empaquetamiento, etc.

b) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser
pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen
representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es

difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg
de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

c) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

d) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN,

proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan
errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se
emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

1.2 MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad

de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2),
determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del

laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz
dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. Recordemos aquí que las
suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña
suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites,
proporcional a la masa del cultivo.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes

tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma
absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en
soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco,
independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran
absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia)
cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar
el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una
suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de
microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica)
con el número de microorganismos totales o con UFC.

La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida

nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida
de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas. Las medidas se hacen a una longitud
de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen
denominar valores de densidad óptica.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de

Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una
medida de la luz transmitida a través de la suspensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la
masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño

de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a
longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es
válida para >107céls/ml.

b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado

en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz
dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el
espectrofotómetro.

2. MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS

2.1 MÉTODOS DIRECTOS

1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una

graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

▪ Excavación con 0.02 mm de profundidad;

 ▪ Area de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;

▪ El cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados

pequeños.

▪ O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros

pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en
varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota
el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular
es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10 6

cel./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del
microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias
móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste
de fase y un volumen de muestra. Es una técnica rápida y barata que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos
recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con
colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el llenado de

la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del
vidrio, incluyendo pipetas.

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera

tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de
los recuentos se realizan con objetivos secos.

En este método la suspensión de la muestra se coloca en la cavidad cuadriculada de

dimensiones conocidas de la cámara, y se tapa con el cubre objetos. Como se conoce el
área de las cuadrículas y la altura de la cámara de recuento, el volumen ocupado por la
suspensión en cada cuadrículas queda determinado. Por tanto, para obtener el número de
bacterias por mililitro de suspensión, todo lo que se requiere es contar el número de
microorganismos en varias cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrícula y
multiplicar este promedio por el factor correspondiente.

Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional
sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.

Fig. 1. Cámara de recuento de Petroff-Hausser

Tabla 1. Recuento de Microorganismos

Área Volumen Factor

Tipo de cuadro
[cm2] [ml] [1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

( 2)

1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.

Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron

para contar un el número de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo de
cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un
volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión

microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez
que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la
corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el
número y el tamaño de las partículas que van pasando.

Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no

filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o
miceliares. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes, no pueden medirse
células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de
microorganismos o microorganismos muy grandes.

Un contador electrónico consta de dos cámaras que están separadas por un material que no
conduce la corriente, en este material no conductor hay un orificio de un tamaño similar al
de las células a ser contadas. Cada cámara contiene un electrodo, la suspensión de células
a ser contadas se coloca en una de las cámaras y se aplica presión para que las células
pasen a la otra cámara a través del orificio, cada vez que una célula pasa a través del
orificio ocasiona un cambio en la conductividad eléctrica que es registrado por un
dispositivo electrónico y de esta manera el contador indica el número de células en esa
suspensión.

Las limitaciones de este método son las siguientes:

• Se cuentan células vivas y muertas.

• Las suspensiones deben estar libres de partículas diferentes a los microorganismos

que estamos contando por que el aparato no puede distinguir entre una u otra.

• Los virus pueden contarse al microscopio electrónico.

Figura N° 2

2.2. MÉTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que

hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En
muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas
alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio
sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo
adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de
la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células
viables en la suspensión original.

Una unidad formadora de colonia (UFC) corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero
sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el
número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos
que estaban juntos al ser sembrados en la placa.

Se siembra un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido

adecuado para estimar el número de viables contando el número de colonias que se forman
puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada. Las placas de final de la serie
debe tienen entre 25 y 250 colonias (o entre 30 y 300 colonias). Menos de 25 las colonias
no son aceptables por razones estadísticas, y más de 250 colonias en una placa es probable
que produzcan colonias muy cerca unos de otros para ser distinguidos como distintas
unidades formadoras de colonias (UFC).
En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, éstos
se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.2 μm de tamaño de
poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se
formen las colonias.

Figura 3. Las relaciones de dilución, pueden presentarse ya sea con dos puntos (:) o barras
(/). Una barra indica la proporción de una parte a un conjunto, por ejemplo, 1 / 2 significa
1 de 2 partes, con de un total de 2 partes. Dos puntos indica la proporción de 1 parte a 2
partes, con un total de 3 partes. Así, 1 / 2 es igual a 1:1, pero 1:2 es igual a 1 / 3.

Figura 4. A pesar de las deficiencias que pueda presentar la técnica del recuento en
placas, se usa frecuentemente, y con resultados satisfactorios, para la estimación de las
poblaciones bacterianas en la leche, agua, y otros productos. Es fácil de realizar y se
adapta a la medición de poblaciones de cualquier densidad.

En el siguiente esquema se presenta un ejemplo de un recuento en placa haciendo

diluciones seriadas con un factor de dilución de 100, para ello se toma 1 mL de la muestra,
la cual puede ser un cultivo de bacterias o cualquier otra muestra que contenga bacterias
en suspensión, se añade a un frasco de dilución que contiene 99 mL del diluente adecuado,
se agita y se toma de esta primera dilución (1:100 ó 10-2) 1 mL y se transfiere a un
segundo frasco de dilución que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma
de esta segunda dilución (1:10.000 ó 10-4) 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de
dilución que contiene 99 mL del diluente adecuado (esa corresponde a la dilución
1:1.000.000 ó 10-6).

Figura 5. Se siembran por triplicado muestras de 1 mL y se incuban en posición invertida

por 24 horas o más y se cuentan las colonias.

Por ejemplo si el promedio de las 3 placas de la dilución 1/1000, es de 32 colonias

entonces el recuento es de 32.000 UFC/mL de muestra.

Otro procedimiento de recuento de células viables es el de la técnica de la membrana

filtrante y consiste en hacer pasar la muestra que contiene los microorganismos a través de
una membrana de acetato de celulosa (0.45μm) colocada en un dispositivo de filtración.
Los microorganismos quedan retenidos en la membrana filtrante, la cual se retira después
de terminado el proceso de filtración y se coloca en una placa de Petri que contiene una
almohadilla humedecida con un medio de cultivo adecuado. Después del periodo de
incubación, aparecen sobre la superficie de la membrana las colonias originadas por el
crecimiento de los microorganismos.

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar
un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon
estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de
sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo
sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas
colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del
volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

3.- NUMERO MÁS PROBABLE

Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en

las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque
poco exacto. El método más exacto para la determinación de la población es el método del
número más probable ( MPN “MOST PROBABLE NUMBER) que resulta del conteo de
las bacterias con la cámara de “ NEUBAUER “ facilitando por el contraste de faces como
accesorio de un microscopio .

Migrad ha desarrollado tablas estadísticas, por ejem. Para tres o cinco pruebas paralelas
que sirven para encontrar el MPN de la cantidad de bacterias por mililitro; es necesaria
una secuencia de diluciones del cultivo en investigación hasta que resulten pruebas que no
contengan bacterias.

La determinación del “título de gérmenes” se realiza rutinariamente de igual forma como

el método para el MPN, con una secuencia de diluciones; pero el resultado lleva una gran
desviación estándar. Unas tres o cinco pruebas (tubos) para cada dilución, permite reducir
este error notablemente y con tres diferentes grados de diluciones se encuentra el MPN
(tabla de McGrady) de las bacterias por mililitro en la solución del cultivo o sea la
población respectiva.

Los Thiobacillus Ferroxidans utilizan la oxidación de Fe 2+ a Fe3+ como fuente de energía

para su metabolismo. Esta oxidación se muestra en un cambio del color de la solución
nutriente y comprueba de este modo el límite de la concentración para la dilución de un
cultivo. El MPN para la población de bacterias/ml se muestra en la descripción siguiente:

▪ Se prepara una secuencia de diluciones de la solución 9K (sin FeSO 4);

▪ Se prepara cinco diluciones en cada solución hasta que muestran por coloración el
desarrollo de bacterias (hasta el límite de la dilución); temperatura 30-35ºC;

▪ Se evalúa el crecimiento de T. Ferroxidans por medio de la oxidación de Fe 2+ a

Fe3+

▪ Los resultados en los límites de las diluciones que se recibe después de la

incubación, se utilizan para la búsqueda del MPN según las tablas de McGrady.

Las necesidades e informaciones para averiguar el número más probable de la cantidad de

células bacterias en un cultivo o en una dilución respectiva, son: 1) El grado de dilución,
2) Una tabla estadística, y 3) Una comprobación visual.

Tablas estadísticas de McGrady

Tres o cinco pruebas paralelas con secuencia de diluciones hasta que se minimice la
presencia de bacterias. El procedimiento como se encuentra el MPN para la población de
bacteria/ml para los cultivos del género thiobacillus, se muestra en la descripción
siguiente:

▪ Se prepara una secuencia de diluciones de la solución del cultivo con la solución

del nutriente de 9k ( sin FeSO4)

▪ De cada dilución se prepara cinco tubos con solución nutrientes de 9k ( 10.0g

FeSO4. 7H2O/ litro en vez de 44.22g/ litro ph 2.5

▪ Se incuba los cubos con las diferentes diluciones hasta que muestra por coloración
el desarrollo de bacterias hasta el límite de dilución temperatura 30-35°C

▪ Se evalúa el crecimiento de thiobacillus ferrooxidans por medio de la oxidación de

FE2+ a Fe 3+ o sea por el cambio de color de la solución nutriente a amarillo o marrón.

▪ Los resultados en los límites de las diluciones que se recibe después de la

incubación se utilizan para la búsqueda del MPN según las tablas respectivas de
McGrady.
Ejemplo 1 :

Cinco tubos paralelos de cada dilución (1:10 6 = 10-6 del cultivo original ,1.107 = 10-7 del
cultivo original, 1:108 = 10-8 del cultivo original.

incubamos durante un tiempo con 35°C muestra los resultados siguientes :

➢ 5 tubos positivos de la dilución 10-6 5

➢ 2 tubos positivos de la dilución 10-7 2

➢ 0tubos positivos de la dilución 10-8 0

El agrupamiento de los números de los resultados es 5 2 0 con este número compuesto se

entra en la tabla correspondiente de Mc GRADY y se encuentra el número más probable
5.0

Interpretación: En la dilución 1:106 del cultivo original se encuentra como número más
probable 5.0 bacterias por mililitro. El calculo del MPN para el cultivo original se realiza
por la división por el factor de la dilución o sea 10-6 :

5.0/10-6 =5 x 106 ( bacterias /ml)

Mientras tanto existen para computadoras sobre la base de fórmulas de matemáticas de la

estadística con los cuales sea desarrollado tablas para el MPN con diferentes límites de
confianza por ejemplo 95% y 99% los resultados muestran una pequeña discrepancia con
respecto a la tabla de Mc GRADY , la que se recomienda acá para los casos de aplicación.

Para la determinación de la población de cultivos puros de Thiobacillus Thiooxidans, se

utiliza la formación de azufre que se produce por medio del metabolismo con tiosulfato,
para reconocer la presencia de Thiooxidans en las diluciones respectivas la solución
nutriente se muestra turbia después del tiempo de incubación con 35ºC.
Referencias Bibliográficas:
Acevedo, F; Gentina, JC; Illanes, A. (2002). Fundamentos de Ingenieria Bioquímica, Ediciones
Universitarias deValparaíso. PUCV.
Brock, D; Madigan, M; Martinko, J; Parker, J. (2004) Biología de los Microorganismos, M.
Prencite Hall.
Emiliano Salvucci, 2010. CRECIMIENTO MICROBIANO
Misari Ch. F.S. (2016). Tecnología de la lixiviación bacteriana de minerales. Osinermin. ISBN:
978.612-46124-8-0. Lima – Perú.