Cátedra Biología Molecular

Facultad de Ciencias Naturales e IML

-2015-

Trabajo Práctico N1

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1- Objetivos

• Que el alumno comprenda el fundamento teórico que permitió el desarrollo de la

técnica de PCR.
• Que el alumno comprenda la importancia de la técnica en el desarrollo de la
tecnología del ADN recombinante.
• Que el alumno conozca las aplicaciones y usos de la técnica.
• Que el alumno sea capaz de diseñar y efectuar reacciones de PCR en el laboratorio.
• Que el alumno pueda interpretar los resultados obtenidos en relación al objetivo del
experimento planteado.

2- Introducción

Definición e importancia.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada por el grupo de Kary Mullis
de Cetus-Perkin- Elmer en 1985.
El primer experimento de Mullis y colaboradores, publicado en
Science en 1985 fue planeado para desarrollar un método de diagnóstico que no insumiera
más de 24 hs para la detección de la hemoglobinopatia de eritrocitos falciformes ("sickle
cellanemia"). En esta anemia la cadena  de la globina está mutada a nivel de la segunda
base del séptimo codón de lo que resulta un cambio de glutámico (cadena PA normal) por
valina (cadena s patológica). A nivel del gen esto hace desaparecer un sitio Dde pero no
afecta a otro sitio Hinf contiguo.

En el experimento amplificaron un fragmento de 110 pb portador o no de la mutación.

Luego de la amplificación el producto desnaturalizado monocatenario se hibridizó con un
oligonucleótido homólogo de 40 bp en cuyo extremo 5' están dos hemisitios de Hinf y Dde.
El fragmento fue marcado con 32P en dicho extremo.
El híbrido es entonces tratado primero con Dde a 56"C que de cortar, genera un producto de
8 nucleótidos. El segundo tratamiento es con Hinf que no actúa sobre e! producto de Dde
pero si corta generando un fragmento de 3 nucleótidos si el sitio Dde no existe.
En los últimos años, la PCR se ha convertido en una revolucionaria tecnología que facilita
los estudios moleculares en el laboratorio y que abre nuevas perspectivas a la investigación
y al diagnóstico médico. Esta nueva tecnología se basa en la ampliación de secuencias
específicas del ADN y se conoce como reacción en cadena de la polimerasa o PCR
(polymerase chain reaction).

-2-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

La revolución que la PCR ha originado en el campo de la investigación genética y

molecular es comparable a la producida por el descubrimiento de las enzimas de restricción
o de los polimorfismos del ADN.

Ventajas y usos.

- Se dispone, en forma rápida y eficaz, de cantidades suficientes de una determinada

secuencia de DNA para su posterior estudio molecular.
- Diagnóstico de patologías genéticas o adquiridas,
- Investigación sobre los defectos moleculares todavía no definidos.
- Aplicación a la medicina forense y legal.
- Detección de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.

Fundamentos

La PCR permite, mediante la utilización de una ADN polimerasa, la amplificación de

regiones específicas de ADN de simple cadena, la que actúa como molde para la síntesis de
una nueva cadena complementaria. Estos moldes de ADN se obtienen cuando se calienta el
mismo a una temperatura cercana a un punto de ebullición (desnaturalización),
produciéndose la separación de las cadenas de ADN. Para la iniciación de la síntesis de la
cadena complementaria al molde se requiere además de la presencia de cebadores o
primers, que son secuencias cortas de nucleótidos sintéticos (oligonucléotidos) o primers,
hibridan de forma específica con las dos hebras complementarias de ADN. Los cebadores
se diseñan de tal manera que hibriden en los extremos opuestos de cada hebra de la región
de interés, así las nuevas cadenas de ADN sintetizadas que comienzan en cada primer se
extiende hacia la posición del primer que se encuentra en la hebra opuesta. De esta forma
se generan en cada cadena de ADN nuevamente sintetizada nuevos sitios de unión a los
primers. La mezcla de racción se calienta nuevamente para separar la cadena original de la
nueva, las cuales quedan disponibles para nuevos ciclos de hibridación del primer, síntesis
de ADN, separación de las cadenas, y así sucesivamente.
Es decir que básicamente, la amplificación de la secuencia de interés se consigue al realizar
una serie de ciclos repetitivos que consisten en:
- Desnaturalización del ADN molde.
- Hibridación de los primers con el molde.
- Síntesis del ADN complementario mediante la acción de la enzima denominada
ADN polimerasa, termoestable.
El resultado de una reacción de PCR es que al final de n ciclos, la reacción contiene un
máximo teórico de 2n moléculas de DNA de doble cadena que son copias de la secuencia
de DNA comprendida entre los primers específicos.
Si se realizan 20-30 ciclos del proceso de PCR señalado anteriormente, se pueden obtener
varios millones de copias de la secuencia de interés, flanqueada por los primers utilizados
en la amplificación.

Tema 4. Componentes de la reacción de PCR.

-3-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

La reacción típica de PCR consta de:

- Muestra de ADN que contiene la secuencia a amplificar.
- Enzima ADN polimerasa.
- Secuencias cebadoras o primers.
- Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)
- Mg Cl2
- Buffer de reacción.
- Enhancers.
- Aceite mineral.

Muestra de ADN o templado. La muestra de ADN puede consistir en 100 ng de ADN

genómico (aproximadamente 100.000 copias del ADN molde a amplificar); o ADN
obtenido de una única célula, es decir solo una a dos copias del ADN (aproximadamente 5
pg de ADN).

ADN polimerasa. Existen varios tipos de enzimas ADN polimerasa. En un principio se

utilizó ADN polimerasa procedente de E. coli. Sin embargo, la actividad de esta enzima
desciende considerablemente por encima de los 37º C, y la exposición a las altas
temperaturas de desnaturalización, necesarias para separar las dos cadenas de ADN inactiva
la enzima tras cada ciclo de amplificación. Por tal razón, en la reacción de PCR se utilizan
ADN polimerasas termoestables; éstas se han aislado a partir de microorganismos que
viven a temperaturas elevadas. La ADN polimerasa del microorganismo Thermus aquaticus
( Taq ADN polimerasa) permite la síntesis del ADN por encima de los 70º C, resistiendo
temperaturas de hasta 94º C. Otras enzimas termoestables son las Tfl ADN polimerasa
obtenida del Thermus flavus, la Pfu ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus, VENT
(nombre comercial de enzima de Thermococcus litoralis), DeepVENT (nombre comercial
de enzima de Pyrococcus sp. GB-D), estas tres últimas presentan mayor termoestabilidad
que la Taq polimerasa, presentando además una actividad exonucleasa 3 a 5 que le
permite corregir los nucleótidos incorporados en forma errónea; es decir que los fragmentos
de PCR generados con esta enzima tendrán menos errores de incorporación que los
generados con la Taq polimerasa. La Tth polimerasa de Thermus termophilus, posee
además actividad de RT en presencia de Mn2+.

Cebadores. Los primers o cebadores son secuencias cortas de ADN de 20 a 30 bases que
se obtienen por síntesis; la secuencia de los mismos se diseña de acuerdo al fragmento de
ADN que se desea amplificar. Se debe tener una concentración de 0.2-1.0 M c/u, en
muchísimo exceso molar respecto del templado (relación primer/target: inicial: 108 y final:
10 aproximadamente. En el diseño de los primers es necesario tener en cuenta algunas
consideraciones:
- Deben ser específicos, especialmente en el extremo 3´.
- Las bases que lo componen deben tener una distribución homogénea a lo largo de la
secuencia, evitando regiones ricas en polipurinas, polipirimidinas u otras secuencias poco

-4-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

comunes. Se debe tratar en lo posible que el contenido de CG sea similar al del fragmento a
amplificar.
- Diseñar "primers" con el Tm más alto posible, 55 a 80 C y similares entre los
primers.
- Los primers no deben estar distanciados por mas de 3 kbp.
- Se debería evitar la presencia de secuencias que permitan la formación de
estructuras secundarias, particularmente en el extremo 3 del primer .
- Es muy conveniente controlar que no existan regiones de complementariedad entre
los primers (uno con otro) evitando que el par de cebadores posean extremos 3 solapados,
ya que podrían dar lugar a un artefacto de amplificación llamado dímero de primers. Estos
dímeros aparecerán como producto de la reacción de PCR especialmente cuando se hacen
muchos ciclos de amplificación sobre una muestra que tiene pocas copias iniciales del
material a amplificar. Un dímero de este tipo es un fragmento de ADN cuya longitud es
muy próxima a la suma de los dos primer y su formación ocurriría cuando un primer es
“extendido” por la polimerasa sobre el otro primer. La concatenación resultante es un
molde extremadamente eficiente que puede , si es que ocurre en un ciclo temprano,
fácilmente volverse el producto predominante de la reacción. Existen programas de
computación que facilitan el diseño de los primers.

dNTPs. Son necesarios para la formación del nuevo ADN amplificado. 0.2 mM c/u (0,8
mM en total), corresponden a aproximadamente a 1016 moléculas de dNTPs. Cuando se
amplifican productos largos se aumenta también la concentración de dNTPs. También se
puede reemplazar un dNTP por algún nucleótido modificado. Ej: ddNTP, bases
modificadas, adición de biotina, fluorocromos, etc.

Mg2+. Afecta la unión del primer, el Tm del templado, la especificidad del producto
(que los primers se unan únicamente a la secuencia de interés), la actividad de la enzima y
su fidelidad. Junto con la temperatura es uno de los parámetros a manipular. Usualmente se
ensayan concentraciones, entre 0.5 y 5.0 mM.

Buffer de reacción. 50 mM KCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8.3).

Enhancers. En ciertas circunstancias el agregado de sustancias como DMSO (1-10%),

PEG-6000 o glicerol (5-15%), detergente no iónicos, formamida {1-10%), BSA (10-100
g/ml) pueden mejorar mucho la especificidad y e! rendimiento.

Aceite mineral: para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, 2 gotas

-5-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

Diseño de una reacción de PCR.

En una reacción de PCR se busca optimizar tres elementos fundamentales: Especificidad,

Rendimiento y Fidelidad. La especificidad se refiere a la capacidad de obtener un producto
de PCR único y deseado. La fidelidad busca por su parte que el producto de amplificación
sea tan fiel a la secuencia original como sea posible, es decir, que se minimicen los errores
en la adición de bases durante la replicación. Y el rendimiento implica la obtención de una
gran cantidad de producto final después de toda la reacción.
Debido a la amplia variedad de aplicaciones en las que se está utilizando la PCR, no existen
condiciones estándares que garanticen el éxito en todas la situaciones. Sin embargo,
algunos parámetros pueden ser tenidos en cuenta como referencia para el diseño de una
reacción de PCR.
Una reacción de PCR se realiza habitualmente en un volumen de 25 a 50l, en un aparato
automático programado (ciclador térmico) para conseguir las temperaturas y los ciclos
deseados. Un ciclo típico consiste en realizar la desnaturalización a 94º C durante 20 seg.,
la hibridación de los primers con el ADN molde a 55º C durante 20 seg., y la síntesis a
72º C durante 30 seg. Los aparatos existentes en el mercado permiten llegar a las
temperaturas deseadas a una velocidad de entre 0,3 y 1º C por segundo, por lo que un ciclo
dura menos de 5 min., y el total del proceso de amplificación puede ser de menos de 3
horas de duración.
En la mezcla de reacción, la concentración del ión Mg2+ puede tener un profundo efecto
sobre la especificidad y el rendimiento en una amplificación. Generalmente una
concentración de 1,5 mM de MgCl2 es óptima cuando se trabaja con concentraciones de
200 M de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP) pero en algunas circunstancias pueden
ser requeridas diferentes cantidades de Mg2+. En general, el exceso de Mg2+ producirá una
acumulación de productos de amplificación no específicos, y una cantidad insuficiente del
mismo reducirá el rendimiento en la amplificación del fragmento deseado.
Los desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) se utilizan normalmente en
concentraciones equimolares y comprendidas entre 50 a 200 mM cada uno de ellos.
Concentraciones más elevadas pueden dar lugar a incorporaciones erróneas por la ADN
polimerasa (es decir, disminuye la fidelidad de la copia); a las concentraciones
mencionadas hay suficiente cantidad de precursor para sintetizar aproximadamente 6,5 y 25
mg de ADN respectivamente. A concentraciones menores disminuye el rendimiento de la
reacción, es decir, la cantidad de producto amplificado que obtengo.
La Taq polimerasa se utiliza en una concentración de 2,5 unidades por 100 l; al
incrimentar la cantidad de enzima pueden aumentar la producción de productos no
específicos de PCR, reduciendo así el rendimiento del fragmento de ADN deseado.
La cantidad de cebador utilizada en una amplificación dependerá de varios factores, pero en
general las concentraciones de los mismos están comprendidas entre 0,05 a 0,5 l; de cada
uno de los oligonucleótidos.
El tiempo de incubación a 72º C (extensión) varía de acuerdo a la longitud de la secuencia
a ser amplificada. La temperatura de hibridación o annealing depende de la longitud de los
cebadores y de su contenido de CG.

-6-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

Si los primers tienen una complementariedad perfecta con el templado se usa 55 C para
(C+G) < 50% o 60 C para (C+G) > 50%. Si no la tienen por ignorarse detalles de las
secuencia del primer, hay que hacer pruebas variando la temperatura entre 35 y 65 C,
hasta la obtención de un único producto con la longitud deseada.
Este último caso es el de la mezcla de oligonucleótidos “degenerados” donde la referencia
que se tiene del templado es sobre la secuencia de aminoácidos de la proteína y no de la
secuencia de bases del gen o mRNA.
En otros casos se introducen a propósito en los primers zonas sin homología; por ejemplo
cuando se trata de introducir una mutación o bien un sitio de restricción. Cuando esto
ocurre, la zona no homóloga debe estar en el lado 5´ del primer; caso contrario puede no
haber extensión.
Como vemos, son varios los parámetros a tener en cuenta en una reacción de PCR y
muchas veces puede ocurrir que una región particular del ADN presente dificultad en ser
amplificada por esta técnica. Este es el caso de aquellas regiones de ADN ricas en CG o
aquellas que forman estructuras secundarias; en estos casos se puede incluir en la mezcla
de reacción un aditivo que incremente el rendimiento y la especificidad. Los aditivos más
usados son dimetilsulfóxido (DMSO), la N,N,N-trimetilglicina (betaína) y la formamida,
también se utilizan el glicerol, detergentes no iónicos, polietilenglicol, albúmina sérica
bovina.

Condiciones que favorecen una mayor especificidad

Tipos de PCR.

1. Reacción de PCR a partir de ARN (RT-PCR).

Esta técnica es una variante de la PCR que permite determinar la presencia de un

transcripto, estimar los niveles de expresión del mismo y clonar productos de ADNc.

-7-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

El material de partida es ARN, pero como la PCR utiliza una ADN polimerasa, es necesario
hacer previamente una copia del ARN a ADNc; esto se consigue haciendo en una primera
etapa una transcripción reversa del ARN total o el ARNm a ADNc con una transcriptasa
reversa; el ADNc obtenido es el sustrato en la reacción de PCR usando cebadores
específicos.

2. PCR anidada o Nested PCR.

Es un método para incrementar la sensibilidad y la especificidad de la amplificación. Luego

de 20 ciclos de amplificación, se toma un 10% de la mezcla que se somete a una nueva
amplificación por 20 ciclos pero ahora en presencia de otro par de primers que se ubican
por dentro de la secuencia a amplificar respecto de los primers iniciales.

3. PCR anclada o Anchored PCR.

Se la utiliza cuando solamente se tiene información para el diseño de un solo primer.

4. PCR con “random primers”.

Está basado en la utilización de “primers” con secuencias seleccionadas al azar. Se usa para
la detección de polimorfismos genéticos en ausencia de información sobre secuencias de
bases. El esquema de fragmentos amplificados con esta técnica es trnsmitido
mendelianamente de padres a hijos y sirve para caracterizar especies de indviduos y
eventualmente para construir mapas genéticos. El método se denomina “Random Amplified
Polymorphic DNA” y se realiza con primers de 10 nucleótidos y la renaturalización se debe
efectuar a 36C.

5. RNA display.

El método fue descripto por el grupo de Pardee (1991). Se basa en la utilización de primers
con secuencias seleccionadas al azar para detectar mRNAs específicos de un estadío celular
mediante RT- PCR. La renaturalización se debe efectuar a 40C. Un ejemplo de los primers
que se utilizan es:

-8-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

6. Real Time PCR.

Es una metodologia que permite medir en tiempo real la formacion de un producto de PCR.
Utiliza un fluorometro adosado a un equipo convencional de PCR y tubos de calidad optica.
Se basa en el uso de un oligonucleotido que contiene un fluorocromo y un quencher. La
proximidad de estos dos elementos bloquea la fluorscencia. Cuando estos dos elementos se
separan en el transcurso de la amplificacion, aumenta la emision de fluorescencia.
Las desventajas que presenta incluyen la necesidad de una optimizacion perfecta, no se
puede asegurar la especificidad de la reaccion, complica el uso de controles internos, y
elevado costo.

Cuando el fluorocromo se aleje o separe

del quencher, se observara fluorescencia.

Comparacion con electroforesis

Comparacion entre distintas concentraciones

7. RACE: rapid amplification of cDNA ends; Amplificación rápida de extremos de

cDNA.
La RACE –PCR es un método muy utilizado para obtener las secuencias completas de
cDNA (Frohman et al., 1988). RACE-PCR es una modificación anclada de la RT-PCR.
Está basada en la amplificación de la secuencia comprendida entre una sola región

-9-
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

previamente caracterizada en el mRNA (cDNA) y una secuencia de anclaje apareada en el

extremo 5‟ o 3‟. Se diseña un cebador a partir de una secuencia interna conocida y el
segundo cebador tiene la secuencia de anclaje. Un paso previo a la RACE-PCR implica la
introducción de una secuencia específica en o el extremo 3‟ o 5‟, por lo que efectivamente
es una forma de mutagenesis

A- 3‟ RACE-PCR utiliza un primer antisense que empieza con una secuencia específica 5‟,
generalmente de más de 15 nucleótidos, que se incorpora en el transcripto de cDNA en el
paso donde interviene la transcriptasa reversa. Un primer sense interno se utiliza para
generar un segunda cadena corta que termina en una secuencia complementaria a la
secuencia original de anclaje. Después, la PCR se inicia utilizando el primer sense interno y
el primer de anclaje.
B- 5‟ RACE-PCR. Aquí un primer antisense interno se utiliza para preparar la síntesis del
templado de una cadena parcial de cDNA. Una cola de poly(dA) se añade al extremo 3‟del
cDNA usando una transferasa terminal. La síntesis de la segunda cadena se prepara
utilizando un primer sense con una secuencia de extensión específica (el ancla). Esta
cadena se utiliza como templado para un paso adicional de la síntesis que utiliza el primer
interno para producir una copia complementaria de la sucesión de anclaje. La PCR,
entonces, se puede realizar utilizando los primers interno y de anclaje

- 10 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

8. PCR mutagénica

La PCR también puede ser utilizada para introducir mutaciones en sitios específicos.
Mutagénesis 5‟: (A) Los primers son modificados en el extremo 5‟, por lo que se pueden
introducir, por ejemplo, secuencias marcadas, secuencias que contengan un sitio de
restricción o un promotor que dirija la expresión.
Mutagénesis específica de sitio: (B) En este caso, la mutación ocurre en una zona
localizada en el centro del amplicón. Se llevan a cabo dos reacciones de PCR, A y B, que
amplifican segmentos superpuestos que contienen la mutación introducida a propósito, al
modificar los primers internos de la secuencia original. Luego los dos productos son
combinados mediante otra PCR.
Mutagénesis por unión incorrecta: En este caso el primer es solo parcialmente
complementario a la secuencia original.

Aplicaciones de la PCR.

- 11 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

La PCR ha simplificado y magnificado las posibilidades diagnósticas del ADN en

medicina. La nueva tecnología permite el diagnóstico preciso de la patología hereditaria,
que incluye tanto los procesos en los que el defecto molecular es conocido en detalle, como
aquellos para los que sólo ha sido posible la localización cromosómica del defecto en
cuestión. En enfermedades genéticas adquiridas, como el cáncer y los procesos
autoinmunes, la PCR permite detectar con precisión los defectos moleculares que han sido
definidos, y facilita la exploración de su patología básica. El estudio de la hipervariabilidad
en el genoma supone la posibilidad de su empleo en los estudios de susceptibilidad a ciertas
enfermedades y la aplicación a la medicina forense y legal. En este campo, el poder
discriminativo de la nueva tecnología es altamente superior al obtenido con la metodología
clásica. La detección de patógenos infecciosos y la identificación de variabilidad genética
asociada a enfermedad se ha visto también revolucionada con la utilización de la tecnología
del ADN recombinante.
La PCR en el campo de las enfermedades monogénicas tiene dos aplicaciones principales:
- El análisis indirecto de los procesos hereditarios mediante el estudio de
polimorfismos asociados a los genes responsables de los distintos procesos.
- La detección directa de mutaciones, mediante hibridación, digestión con enzimas de
restricción, secuenciación directa del ADN o simple visualización de fragmentos. Además
de la posibilidad de análisis de procesos genéticos, cáncer y susceptibilidad a
enfermedades, la nueva tecnología permite el análisis rápido de patógenos infecciosos. El
análisis de la presencia de estos patógenos y de mutaciones en oncogenes en material
médico de archivo, como bloques de tejidos de parafina, fijados en formol, permite
importantes trabajos retrospectiv os.

Detección de la presencia de HIV en plasma

La técnica del PCR permite no solo determinar la presencia del virus en sangre sino
también la carga viral.
Puesto que la PCR solo puede amplificar ADN, el ARN del HIV-1 debe ser transcripto a
ADNc mediante una transcriptasa reversa (RT-PCR). El ARN del HIV-1 se extrae del
plasma usando agentes caotrópicos como el tiocianato de guanidina, que inactiva a las
RNAsas , luego se precipita con isopropanol y se solubiliza el pellet en agua y se coloca en
un tubo de micro centrífuga junto a los otros componentes de la reacción, para amplificar
una secuencia de 142-bases del gen gag.
Los primeros utilizados poseen 25 a 30 bases de longitud, hibridan por fuera de las regiones
de la secuencia del gen gag a amplificar. En la mezcla de reacción se coloca además
cantidades conocidas de un estándar interno que es una molécula de ARN sintético idéntico
al ARN viral a amplificar con la diferencia que posee una delección (ARN competidor); la
presencia de este estándar permite la cuantificación del virus en la muestra problema.
Luego que los ciclos de PCR han terminado, los productos de amplificación se separan por
electroforesis en un gel teñido con bromuro de etidio. Se determina la intensidad de la
banda de 142 pares de bases del ARN del HIV-1 y la intensidad de la banda del producto de
amplificación del estándar interno (que tiene una talla menor). La relación de intensidades

- 12 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

de ambos fragmento permite realizar un cálculo del número de copias del ARN del HIV-1
en la muestra original.

Detección de genes de microorganismos en alimentos

Las aplicaciones de la técnica de PCR en el control de alimentos son numerosas. Se pueden

utilizar para identificar especies cárnicas y especies de pescado de interés alimenticio,
detectar la presencia de agentes patógenos en los alimentos (Salmonella spp., Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7) o detectar la presencia o ausencia de
organismos genéticamente modificados (OGM) en los alimentos. Para ello se amplifican
por PCR marcadores moleculares específicos y se detecta su presencia en un gel de
agarosa.

Aplicación de la biología molecular en la identificación de individuos

Desde 1990, se empezó a utilizar la técnica de PCR para la identificación molecular

forense. Este sistema posibilitó la obtención de información genética útil a partir de
muestras provenientes de cadáveres antiguos, de tejidos descompuestos, de restos
epiteliales de colillas de cigarrillos o bulbo piloso, etc. básicamente, se identifican
secuencias de DNA hipervariables.
Los patrones generados por este sistema presentan dos bandas (alelos) en un determinado
individuo, cada una de ellas aportada por cada uno de sus progenitores:
Condición de inclusión: el individuo comparte una banda con su padre y otra con su madre.
Condición de exclusión: el individuo no comparte ninguna banda con su padre o su madre.
Si nos encontramos ante una condición de exclusión, podemos afirmar que los supuestos
progenitores y el individuo testeado no tienen ninguna relación.
Si nos encontramos ante una condición de exclusión, no podemos confirmar con el análisis
de un solo sistema que por ejemplo el padre alegado es el padre biológico; por eso debemos
utilizar más de un sistema para alcanzar niveles de certeza compatibles con la paternidad.
Existe cierto numero de regiones no codificantes de el gen de la mioglobina humana las
cuales exhiben un alto grado de variabilidad entre individuos. Estas secuencias presentan
un comportamiento de herencia “de padres a hijos” (herencia mendeliana) y se localizan en
diferentes regiones del genoma. Estas secuencia se pueden utilizar como sondas o
marcadores sobre DNA, llamando a esta técnica DNA fingerprinting (huellas digitales
genéticas HDG) o sondas capaces de generar tales patrones se denominan sondas
multilocus (MLP).
Este tipo de secuencias fueron reemplazadas por otro tipo de secuencias variables pero
localizadas en posición determinada del genoma de tal manera que el patrón producido por
estas, al ser usadas como sondas, sólo presentaba dos bandas (en la condición heterocigota)
o una banda (en la condición homocigota). Estas sondas fueron denominadas unilocus y
reciben actualmente la mayor atención por su posibilidad de estandarización y de
generación de bancos de datos poblacionales intercomparables.
El análisis molecular de los fragmentos variables con sondas de locus múltiple (MLP) o
con sondas de locus específico (SLP) permitieron demostrar que tal variación depende del

- 13 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

número de veces que se encuentran presentes ciertos segmentos de ADN, los que
constituyen unidades de repetición. Tal propiedad valió para que se las denominará
Repeticiones en Tándem de Número Variable (VNTR).

Visualización de ADN

ELECTROFORESIS

FUNDAMENTOS

El método electroforético aprovecha la propiedad de las partículas cargadas de migrar en un

campo eléctrico, en donde la velocidad de migración depende de la carga de dichas
partículas. Este método se puede usar tanto para proteínas como para ácidos nucleicos. Las
proteínas poseen carga como resultado de la presencia de aminoácidos básicos (arginina y
lisina) y ácidos (glutámico y aspártico) pero también poseen cargas adicionales debido a las
modificaciones postraduccionales mediante glicosilación, sulfatación y fosforilación.
En el caso del ADN, éste se carga negativamente cuando se encuentra en un buffer alcalino,
debido a sus extremos fosfatos y de esta manera puede migrar al ánodo en un campo
eléctrico. Otros factores influyen en la migración y la separación del ADN, además de la
carga: tamaño del ADN, concentración de agarosa, concentración de ADN e intensidad del
campo eléctrico. Los fragmentos del ADN lineal, por ejemplo, migran a través de la matriz
del gel a una velocidad inversamente proporcional al log10 de sus pesos moleculares. Esta
relación puede ser usada para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN.

FORMA DE LLEVAR A CABO UNA ELECTROFORESIS

Entre los soportes más comunes están: papel, acetato de celulosa, agarosa y poliacrilamida.
Estos soportes afectan la movilidad de las moléculas cargadas de manera diferente, ya que
pueden absorber moléculas al medio de soporte (tales como los grupos hidroxilos del papel
de celulosa) o reducir el movimiento mediante un tamiz de poros moleculares como en el
caso del PAGE. La migración de partículas cargadas en un gel, presenta un alto coeficiente
de rozamiento. Este tipo de medio no sólo previene la convección y minimiza la difusión
sino que participa activamente en la separación de las moléculas haciendo intervenir en
forma importante el criterio de dimensión ya que ejercen un efecto de filtración molecular.
Este efecto de tamiz es función de la dimensión de los poros del gel, lo que depende de la
concentración del gel.
Cualquier matriz que el operador elija es importante que sea eléctricamente neutra ya que la
presencia de grupos cargados en dicho soporte produce un fenómeno de electroósmosis que
disminuye el poder resolutivo de esta técnica. Los soportes más comunes para la
electroforesis en gel son los de agarosa y poliacrilamida. Los primeros dan un tamaño de
poros más grande y su utilización permite la separación de grandes moléculas mientras que
con geles de poliacrilamida se logran poros de pequeño tamaño, haciendo posible la
separación de pequeñas macromoléculas.

- 14 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Es un método estándar usado para analizar moléculas de ADN de más de 200 pares de base
(pb). La electroforesis en gel de agarosa fue desarrollada primariamente en plataformas
horizontales. Los geles horizontales se preparan colocando la agarosa fundida en un molde,
cerca del extremo se coloca un peine para formar los pocillos. Una vez que la agarosa ha
solidificado, el peine es removido. El método más común para la electroforesis del ADN es
el método submarino en el cual el buffer cubre el gel. Se utilizan buffers neutros o
alcalinos. Ej: TAE. Éste contiene EDTA que es un agente quelante de cationes divalentes,
que son requeridos por las DNasas y así se previene la degradación de la muestra de gel.
La agarosa actúa como tamiz molecular, por lo tanto la conformación del ADN afecta su
migración y separación durante la electroforesis. El ADN posee tres conformaciones
normales: superenrrollado, relajado (circular abierto) y lineal. Generalmente el ADN
superenrrollado corre más rápido que el ADN lineal, y éste corre más rápido que el ADN
relajado.
Cuando el análisis del ADN es cuantitativo, es muy importante que las bandas puedan
resolverse y verse claramente. La resolución depende de muchos factores: tamaño y forma
del pocillo, tamaño de los fragmentos de ADN, concentración de agarosa y voltaje usado.
La intensidad del campo también determina la velocidad de migración del ADN. Un
gradiente de altos voltajes conduce a una pobre resolución debido a que los fragmentos
tienden a atravesar el gel como una masa compacta. El uso de voltajes bajos puede producir
la difusión del ADN de la banda, reduciendo así la resolución.
PROTOCOLO CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE AGAROSA.

Visualizar el ADN extraído corriendo 5 l de muestra en posillos dentro de en un gel de

agarosa 0.8% en una cuba de electroforesis usando como buffer de electroforesis TAE 1X y
como marcador de peso molecular, 1 Kb. Debe tenerse en cuenta siempre que el volumen
de las muestras no debe sobrepasar el volumen de los pocillos del gel. Antes de sembrar la
muestra se le agrega un volumen determinado de colorante (1 µl) de frente (azul de
bromofenol) para visualizar la corrida. La electroforesis se lleva a cabo a 10 V cm -1 durante
1 h a temperatura ambiente; los geles luego se tiñen con solución de bromuro de etidio y
se observan bajo luz UV.
Reactivos necesarios.
1. 1X TAE buffer ( 0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, pH 8.0)
2. 0,8 % agarosa en 1X TAE buffer.
3. Solución de bromuro de etidio: 1 µg ml-1 in 1X TAE buffer.
4. Marcador de peso molecular: 1Kb.
5. Buffer de corrida.

Preparación del gel de agarosa.

1- Preparar la cuba de electroforesis con el peine correspondiente.

- 15 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

2- Realizar el calculo necesario para preparar un gel de agarosa 0,8 %(25 ml).
3- Pesar la agarosa. Diluir con TAE 1x hasta 25 ml y calentar hasta disolución.
4- Dejar enfriar 10 minutos y verter solución de agarosa.
5- Dejar solidificar y cubrir el gel con TAE 1x.

Esquema ilustrando el resultado de una corrida electroforética.

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

COMPOSICIÓN QUÍMICA.

La matriz está compuesta de acrilamida copolimerizada con N, N· - metilenbis acrilamida.

La polimerización ocurre cuando el persulfato de amonio se disuelve en agua, formándose
radicales libres. Cuando estos radicales libres se ponen en contacto con la acrilamida, ésta
se polimeriza en largas cadenas de poliacrilamida, que gelificarán debido a la presencia de
la bisacrilamida que forma enlaces cruzados entre las cadenas. El TEMED, una amina
cuaternaria N N N tetrametilen diamina actúa como catalizador, debido a su capacidad de
existir en la forma de radical libre. Debido a que el oxigeno inhibe la polimerización, la
mezcla se somete a vacío o se purga con gas inerte. El tamaño del poro de la acrilamida
polimerizada depende de la cantidad de acrilamida usada por unidad de volumen en el
medio de reacción, y el grado de entrecruzamiento. La relación acrilamida/bis acrilamida es
también crítica para el tamaño de poro. Al aumentar la concentración de acrilamida
disminuye el tamaño del poro. Para ajustar aún más el tamaño de poro puede variarse la
concentración de bisacrilamida. Pudo establecerse que con un 5% de bisacrilamida con
respecto a la cantidad total de acrilamida-bisacrilamida se logra el poro más fino. Por abajo
o por arriba de ese porcentaje el tamaño del poro aumenta.
Los geles pueden ser hechos en placas planas o en tubos cilíndricos. En ambos casos en el
borde superior, el gel forma un menisco que posteriormente distorsiona el esquema de las
bandas, para evitarlo se coloca una fina capa de agua antes de que polimerice.

- 16 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

SISTEMAS DE ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

- Sistema continuo: La concentración del gel , el pH y la fuerza iónica quedan fijos .
Se utiliza el mismo buffer en el gel y en las cubas. Utiliza un tipo de gel llamado gel
de separación (o de resolución) y además un gel concentrador (o espaciador).
- Sistema discontinuo: En este sistema los parámetros anteriores varían pero la
resolución es superior.
SISTEMAS DESNATURALIZANTES Y NO DESNATURALIZANTES
Tanto en los sistemas continuos y discontinuos pueden seleccionarse a su vez un sistema
que permita mantener las muestras en su estado nativo, o sea no desnaturalizante mediante
el uso de tampones adecuados que no contengan detergentes, con pH y concentración
predeterminada y reduciendo el calor al máximo. Por lo contrario cuando la resolución de
las muestras proteicas es difícil de llevar a cabo, se incluye en el gel un agente
desnaturalizante, siendo el más comúnmente utilizado el detergente dodecil sulfato de sodio
(SDS) en concentraciones entre 1 y 2%. En este sistema disociador se logra la disociación
de los agregados de macromoléculas en las subunidades polipeptídicas. Existen otros
agentes disociantes como urea, ácido acético, ac. Acético más fenol, detergentes no iónicos,
o cambios de pH. Con el SDS, la mezcla proteica se desnaturaliza calentando al 100º C
durante 1 a 2 min en presencia de un exceso de SDS y beta mercaptoetanol (un agente
reductor). La presencia de SDS en todo el sistema incluyendo la muestra negativiza las
proteínas, las que migrarán hacia el ánodo de acuerdo solamente a su peso molecular.

PROTOCOLO DE UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA DE GELES DE POLIACRILAMIDA

Reactivos y soluciones
1. 10X TBE buffer ( 0.04 M Tris-borato, 0.001 M EDTA, pH 8.0)
2. 40% acrilamida: bis {19:1) y TEMED o:Acryl-a-Mix Solution (6%)
3. 0.5 % ácido acético en 95% de etanol.
4. Azul de bromofenol: 1mg/ml en H20 bidestilada.
5. Solución de persulfato de amonio: persulfato de amonio 10% en H20 bidestilada.
6. TEMED

Procedimiento
- Se preparan los soportes planos.
- Se preparan las soluciones del gel separador. Se cargan los soportes con la solución
de acrilamida-bisacrilamida.
- Se agrega agua en el borde superior, se deja gelificar.
- Se preparan las soluciones del gel concentrador. Se agrega sobre el primer gel,
previo secado del agua. Se deja gelificar.
- Se preparan las muestras para la corrida, diluyendo en cantidad suficiente del buffer
de preparación de muestras, se calienta a baño maría a 100º C durante un minuto y
medio.

- 17 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

- Se arma el aparato de electroforesis, se coloca el buffer de corrida en las cubas

respectivas.
- Se siembran 25l de cada muestra.
- Se corre en el gel de concentración a 17 mA durante aproximadamente ½ hora y a
25 mA en el gel de resolución.

TEÑIDO CON PLATA

Este protocolo describe el uso del DNA Silver Staining System de Promega. Un sistema
contiene suficiente reactivo para teñir 10 medidas de gel e incluye: ,

. 500 µl de silano en pasta

. 20µl de nitrato de plata (10 x 2g)
. 60 ml de formaldehído, 37 % (20 x 3ml)
. 10 ml de tiosulfato de sodio, 10 mg/ml (10 x 1 mi)
. 600 g de carbonato de sodio (10 x 60 g)

Reactivos no provistos:
. Solución fix/stop,
. Solución de manchado
. Solución reveladora

Procedimiento

1. Después de la electroforesis, vaciar la cámara de buffer y afloje con cuidado los

sujetadores del gel. Retire los platos de vidrio del aparato.
2. Ubique el gel (platos de vidrio) en una superficie plana. Remueva el peine y los
espaciadores del costado. Use una cuña de plástico para separar dcon cuidado los
dos platos de vidrio. El gel debería estar fuertemente adherido al plato de vidrio
corto.
3. Ubique el gel (adherido al plato corto) en una bandeja de plástico poco profunda
(tina de lavado NALGENE®).
NOTA. EL USO DE Silver Múltiple Holder permite simultáneamente el teñido de
plata de dos o más geles usando aproximadamente la misma cantidad de tiempo uy
reactivos. Si dos geles son teñidos, ubique el lado expuesto del gel de ambos platos
hacia arriba mientras está la solución.
Para el teñido de plato:
Paso Solución Tiempo
a. solución fix/stop 20 minutos
b. agua desionizada 2 minutos
c. repita paso b dos veces 2 x 2 minutos
d. solución de teñido 30 minutos
e. agua desionizada 10 segundos
f. solución reveladora (4-10ºC) hasta 5 minutos

- 18 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

g. solución fix/stop 5 minutos

b. agua desionizada 2 minutos
4. Posicione el gel verticalmente y deje secar durante toda la noche.

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO

La electroforesis de campo pulsado se basa en la reorientación periódica del campo

eléctrico que permite la separación de moléculas de ADN del orden de las 2 megabases
(Mb). Las moléculas de ADN de mayor tamaño se resuelven porque son selectivamente
retardadas en el campo pulsado. Las alternancias en la polaridad de los electrodos producen
cambios en la dirección de migración; la velocidad de reorientación de las moléculas de
ADN varía en función del tamaño. Una explicación de ésto es que una molécula de ADN
de elevado peso molecular utiliza una porción considerable de cada ciclo reorientándose
con respecto al campo. Existen diferentes tipos de electroforesis de campo pulsado: FIG,
RGE, TAFE y CHEF. Actualmente el más empleado es el CHEF (Contour-clamped
homogeneous electric field) emplea un arreglo geométrico de los electrodos para producir
un campo que es reorientado electrónicamente. Múltiples electrodos dispuestos alrededor
de un círculo están sujetos a potenciales iguales en un campo uniforme. El grado de
uniformidad del campo aumenta con el número de electrodos, en consecuencia los geles
pueden correrse libres de cualquier distorsión significativa.
El primer equipo de CHEF fue construido con los electrodos dispuestos en un cuadrado de
tal manera que el campo estaba reorientado por 90º. Aunque la migración de las moléculas
de ADN fue uniforme a lo largo del gel, la resolución fue pobre. Posteriormente se ensayó
un diseño en donde los electrodos estaban dispuestos en forma hexagonal, originando un
ángulo de reorientación de 120º, lo cual produjo una excelente resolución en moléculas de
ADN por arriba de las 10 Mb.

- 19 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

3- Actividades prácticas

A- Búsqueda del gen pcoA en cepas de actinomycetes mediante PCR

Los genes pcoA y pcoR forman parte del operon pco (plamid-borne copper resistance)
presente en el plasmido pRJ1004 detectado en una cepa de E. coli resistente a cobre. A su
vez, dichos genes fueron detectados mediante PCR en aislamientos de suelo lo cual sugiere
la posible transferencia de los genes pcoA y pcoR en cepas de actinomycetes tolerantes a
cobre.

Materiales:
o Buffer STR
o DNA polimerasa
o Primers: pcoA1- pcoA2
o ADN
o Agua bidestilada estéril
o Micropipetas – Tips – Tubos de PCR – Termociclador.
o Agarosa – Cuba de electroforesis – Marcador de PM 1kb
o Bromuro de etidio - Analizador de imagenes

Metodología
1. Preparar la mezcla de reaccion (volumen final 25 ul)

Buffer STR 10X 2,5 ul

Primers
F (pcoA1) 0,2 ul
R (pcoA2) 0,2 ul
DNA polimerasa 0,2 ul
ADN 1 ul
H2O bd esteril 20,9 ul

2. Realizar la PCR usando las siguientes condiciones

95ºC 5‟
95ºC 90‟‟
57ºC 90‟‟ 35 ciclos
72ºC 2‟
72ºC 7‟
4ºC inf

3. Visualizar los productos de PCR en gel de agarosa al 0,8%. Usar el marcador de

peso molecular 1kb (Promega).

4. Una muestra de los resultados que se consiguen aparece en la gráfica siguiente:

- 20 -
 Cátedra Biología Molecular
Facultad de Ciencias Naturales e IML
-2015-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Primera banda: Amplificación de 300pb esperada

Segunda banda: Dímero de cebadores

Calle 1: marcador de 1 kpb ("ladder")

Calle 2: control positivo
Calle 3: control negativo
Calles 4 a 10: resultado de la PCR de distintas colonias

- 21 -