Laboratorio Biología Molecular Extracción

Nombres: Diego Ignacio Caldera Bracho Proteínas

Francesca Trotechaud Salinas
Julieth Paola cañas Grupo No_3_
Juan Diego Lesmes

Extracción de proteínas, SDS page y Tinción con Azul Coomasie 101.011.110

Preguntas Teóricas

1. Explique el fundamento y diga en qué ocasiones utilizaría la técnica de PAGE-nativa.

¿Qué diferencias relevantes tiene con respecto a la SDS-PAGE? (1,0).

En la técnica PAGE-nativa las estructuras de las proteínas se mantienen en una forma

tridimensional y las cadenas polipeptídicas permanecen unidas. Por ende, estas no solo se
separan en función de su carga, sino también por su tamaño y forma. Las interacciones entre
las subunidades y proteínas permanecen. En otras palabras, no hay desnaturalización de las
proteínas. Esta técnica la utilizaría para estudios funcionales, donde el péptido se permanece
intacto y es posible detectar actividad enzimática.

Las diferencias con respecto a la técnica SDS-PAGE y la técnica PAGE-nativa es que en la SDS-
PAGE se incluye agentes desnaturalizantes, tales como detergentes, caótropos y reductores. Al
usar agentes desnaturalizantes se rompen los enlaces disulfuro y enlaces no covalentes. Otra
diferencia importante es que en el SDS-PAGE la migración se da en función de la carga y el
tamaño (peso molecular) de la proteína. Otra diferencia importante es que en esta técnica es
imposible detectar la actividad enzimática. En la SDS-PAGE las proteínas quedan con carga
negativa.

2. ¿Cuál es la función del SDS y del agente reductor (Beta-mercapto etanol o DTT) en

una electroforesis de poliacrilamida? Mediante un diagrama (de un gel) dibuje y
explique cómo es la migración de las proteínas con ambos reactivos, solo SDS, solo
DTT, ningún reactivo. Tenga en cuenta que cada combinación debe ir en un pozo
distinto (1,5).

El SDS es un detergente iónico con carga negativa con un fuerte carácter denaturante, su
función en una electroforesis de poliacrilamida es la de dejar las proteínas con carga negativa,
darles mayor solubilidad a las proteínas, romper la unión de los enlaces no covalentes y
facilitar su tinción. El agente reductor (Beta-mercaptoetanol o DTT), tiene la misma función de
denaturar las proteínas igual que el SDS, aunque este agente reductor rompe los puentes
disulfuro para que la proteína quede completamente lineal, separa las subunidades y elimina
los agregados.

Preguntas Prácticas

1. Su compañero de laboratorio, quien investiga la resistencia a Kanamicina en

bacterias, hizo una cromatografía de afinidad con un material que se une a la
Fosfotransferasa-APH de 480Da (enzima responsable de dicha resistencia), con el fin
de separarla de la proteína FtAPH-Enhancer (de 180Da). Después de la cromatografía,
su compañero hizo una SDS-PAGE de las fracciones sucesivas (1-10) le mostró sus
resultados antes de la reunión del laboratorio. (1,25)
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a. Describa el problema que tuvo su compañero de laboratorio. ¿Qué parte de

su metodología estuvo mal?

Considerando que la puntuación correspondiente a la marca de peso (la primera pista) está
completa, no hay cambio ni anormalidad, y considerando la expectativa (es decir, el
fraccionamiento de moléculas según diferentes pesos), se puede descartar que exista un error
en el gel de poliacrilamida (PAGE), por lo que este error es la base de la cromatografía de
afinidad.

Sin embargo, el error es que el gel no está lo suficientemente graduado en peso, como se
observa en los marcadores de peso, pero la concentración del analito es demasiado grande,
480 Da a medida que se avanza sobre las columnas del gel, por lo que es imposible distinguir
fracciones claras según cada tamaño.

Bueno, considerando que, como se mencionó anteriormente, se puede descartar el error en el

gel, porque la columna de la etiqueta de peso se muestra intacta, el error se puede atribuir al
proceso de cromatografía de afinidad que lo separa. Nuevamente, los resultados mostraron
que la proteína de 180 Da estaba funcionando correctamente, debido a que la fracción
correspondiente estaba certificada por peso, por lo que el error estaba en la preparación del
analito de 480 Da.

En resumen, hay varias causas posibles de error en este experimento: La primera causa posible
es que la concentración del analito es demasiado alta, en este caso fosfotransferasa-APH. Al
realizar la cromatografía de afinidad, se debe considerar su concentración. De esta forma, es
necesario medir la concentración de la proteína disuelta en el tampón correspondiente, es
decir, el ligando de la columna (analito de captura) y el medio en el que se suspende la
sustancia a separar, en este caso 180 Da. proteína. De esta forma, si la concentración del
analito, la enzima, es demasiado alta, la parte que aparece en el gel se verá afectada porque
hay demasiada proteína. Otra causa posible es que haya habido un mal plegamiento de las
proteínas, agrandando la fracción que se observa. Esto a su vez explica por qué los puntajes
son un poco más bajos de lo que deberían, considerando que su peso es de 480 Da, y debido a
que son más compactos, obtienen más capacidad de migración de la esperada (Amortegui;
Rodríguez, 2021).

b. ¿Qué sugerencia le haría a su compañero para que lograra obtener el

resultado esperado?  

Para el primer caso, nuestra sugerencia es que utilice la concentración de proteína con cuidado
en el análisis cromatográfico, de modo que pueda medir cuidadosamente la cantidad de
compuesto disuelto en la muestra considerando la cantidad de proteína. De esta forma, la
concentración de proteína en la muestra será suficiente para separar adecuadamente el PAGE.

En el segundo caso el compuesto usado para desnaturalizar la proteína se usa cuidadosamente

de acuerdo con la naturaleza de la proteína. Por ejemplo, si su proteína tiene una
conformación natural basada en los enlaces disulfuro que puede formar, debe agregar DTT
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para romper estos puentes. Además, debe prestar atención a cuántas de estas sustancias usan
(ya sea SDS, DTT, etc.) para que haya suficiente para desplegar las proteínas y permitir que se
linealicen.

2. Para los siguientes geles describa los resultados obtenidos. ¿Estos concuerdan con los
resultados esperados para una extracción de proteína total? Si no, ¿Cómo se podría
resolver el problema que encuentran? (1,25).
a.

Lo más probable es que se haya colocado demasiado voltaje para correr la muestra por el
gel por lo que se obtuvo este resultado, ya que pudo haber una atracción
electromagnética demasiado fuerte que corrió la muestra en contra de los polímeros del
gel, esto sin permitir el fraccionamiento. Esta imagen no está entre los resultados
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esperados, las bandas no se ven bien definidas. Se pueden dar algunas soluciones como,
por ejemplo:
-Reducir la concentración de anticuerpos.
-Evitar la contaminación.
-Disminuir la cantidad de gel que se cargó.
-Eliminar exceso de sales que contenga la muestra antes de la electroforesis.
-Verificar variables de temperatura.

b.

El gel de corrido no polimerizó correctamente, por lo cual los resultados obtenidos no son los
esperados, y se puede observar porque hay manchas de tinta que no permiten observar de
forma idónea los resultados, de manera que se debe tener cuidado al momento de dar las
condiciones necesarias para la polimerización los dos geles, como que no haya presencia de
oxígeno, que tengan suficiente tiempo para polimerizar antes de agregar la muestra, que
polimericen en los momentos apropiados, etc. Algo probable es que la proteína esté
sobrecargada por lo que se podría diluir la concentración. Una posible solución sería:

-Si hubiera un error distinto se podría hacer limpieza para evitar contaminaciones.

-Aumentar el tiempo de lavado y verter la mezcla de acrilamida de forma uniforme para evitar
que quede manchado.
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c.

Las proteínas fraccionadas no se tiñeron bien. Posiblemente se utilizó mucha solución de

distinción y escasa solución de tinción. También es posible que no se llevará a cabo
correctamente la fijación, por lo que las fracciones de menor tamaño pudieron salirse del gel.
Las soluciones que podemos plantear ante esto pueden ser:

-Verificar si se realizó de forma correcta la tinción.

-Aumentar la concentración de las proteínas en caso de que la muestra está demasiado diluida
y utilizar un control positivo para verificar los rangos de separación y que así la proteína no se
salga o escurra.

Referencias:

Amortegui, D., & Rodríguez, C. (2021). Extracción de Proteínas, SDS-PAGE y Tinción con Azul de
Coomassie (Virtual)[Diapositivas]. Bloque Neón.
https://bloqueneon.uniandes.edu.co/d2l/le/lessons/58743/topics/482219

Eubel, H., Braun, HP. & Millar, A. Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-
protein interactions. Plant Methods 1, 11 (2005). https://doi.org/10.1186/1746-4811-1-11

Ma, J., & Xia, D. (2008). The use of blue native PAGE in the evaluation of membrane protein
aggregation states for crystallization. Journal of applied crystallography, 41(Pt 6), 1150–1160.
https://doi.org/10.1107/S0021889808033797

Thermo Fisher Scientific. (s. f.). Native PAGE Gels | Thermo Fisher Scientific - NL. Recuperado
27 de septiembre de 2021, de
https://www.thermofisher.com/nl/en/home/life-science/protein-biology/protein-gel-
electrophoresis/protein-gels/specialized-protein-gels/nativepage-bis-tris-gels.html