13/11/2020

Research Grup
Oenological Biotechnology

Dr. Braulio Esteve‐Zarzoso
Universitat Rovira i Virgili, Tarragona, España

Módulo 2.1. Teoría
Día 14/11/2020, duración 1h 35 min (10.50h‐12.25h) (Prof René Juez  9.20‐10,50h,  Prof Santos 12.25‐13.55h):
Extracción de ADN: Microorganismos eucariotas y procariotas. 
Métodos para la extracción de ADN. 
El uso de reactivos para optimizar la calidad del ADN extraído.

Célula eucariota
Compartimentación del citoplasma
Orgánulos con material genético propio
Plásmidos

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Célula procariota
No hay compartimentos
Material genético libre
Plásmidos

Comparativa células procariotas. Célula aninal vs. Célula vegetal

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Diferencias entre el material genético en células eucariotas

Estructuras externas de las levaduras y hongos

Dependiendo del tipo de pared a degradar se utilizará un complejo enzimático.

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Comparativa células procariotas. Célula Gram poisitva vs. Gram negativa

Para poder llegar a la membrana plasmática de las G+ primero hay que degradar la pared bacteriana

Formaciones externas a la pared o membrana plasmática

Producción de celulosa por bacterias acéticas

Pseudomonas
Cryptococcus
Staphylococcus

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Vamos a conocernos un poco más

Cual es el nivel de instrumentalización de tu laboratorio?

En qué tipo de muestras estás interesado?

De que microorganismo necesitas hacer la extracción del DNA?

Que tipo ácido nucleico necesitas extraer?

Para qué vas a utilizar el ácido nucleico extraído?

Cuantas muestras necesitas analizar?

Métodos de extracción de DNA

Tradicional: largo, barato y repetitibilidad media

Kits comerciales: rápido, caro y alta repetitibilidad

Kits comerciales automatizados: muy rápido, muy caro y muy repetitivos

El tipo de extracción se establecerá en función del uso del DNA

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Pasos de una extracción de DNA tradicional

1. Eliminación del medio de cultivo
2. Lavado
3. Eliminación pared/capsula/cubierta protectora externa
4. Rotura de la membrana plasmática
5. Precipitación de ácidos nucleicos
6. Lavado de ácidos nucleicos
7. Secado de ácidos nucleicos
8. Resuspensión de ácidos nucleicos

Ejemplo de protocolo extracción DNA 

Muchos pasos
Preparación de reactivos
Experiencia en extracciones de ácidos nucleicos
Incubaciones largas 

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Ejemplo de protocolo extracción DNA
Utilizando compuestos orgánicos 

Muchos pasos
Preparación de reactivos
Experiencia en extracciones de ácidos nucleicos
Incubaciones largas 
Generación de residuos tóxicos

Tipos de kits de extracción comerciales

Extracciones de muestras simples
o en placas de 96 utilizando el 
mismo kit
Extracciones de muestras simples

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Tipos de kits de extracción comerciales

Comparativa 4 métodos extracción DNA

Monroy‐Vaca et al. Evaluación de 

cuatro métodos de extracción del 
ADN de Histoplasmacapsulatum y 
su uso en reacciones de PCR.  
Vaccimonitor. 2014

TX: Triton X100 (Tensoactivo no iónico)

TG: Tiocianato de guanidina (Lisis e inactivacióin DNAsas
MM: Método mecánico (Rotura con bolas)
ME: método enzimático (Digestión enzimática de pared)
C+: Control positivo
C‐: Control negativo

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Cuantificación de los ácidos nucleicos

Absorbáncia en espectofotómetro clásica

Cuantificación en gel de electroforesis
Cuantificación en electroforesis capilar
Cuantificación en nanodrop
Cuantificación con colorantes 

Métodos evaluación  calidad/cantidad DNA

Principales colorantes utilizadas en la cuantificación de ácidos nucleicos

Especificidad del PicoGreen para
el DNA de doble cadena

Elaboración de rectas patrón

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Purificación de ácidos nucleicos

Tradicional: largo, barato y repetitibilidad media

Kits comerciales: rápido, caro y alta repetitibilidad

Kits comerciales automatizados: muy rápido, muy caro y muy repetitivos

Normalmente los kits de purificación suelen ser muy parecidos a los de extracción, con algún paso adicional

Protocolos purificación DNA

Eliminan pequeñas impurezas presentes
Se pueden utilizar para enriquecer la muestra en DNA ó RNA
Se aplican sobre volúmenes muy pequeños
Mejor no utilizar compuestos orgánicos
Pueden degradar la muestra si los reactivos están mal

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Vamos a conocernos un poco más

Cual es el nivel de instrumentalización de tu laboratorio?

En qué tipo de muestras estás interesado?

De que microorganismo necesitas hacer la extracción del DNA?

Que tipo ácido nucleico necesitas extraer?

Para qué vas a utilizar el ácido nucleico extraído?

Cuantas muestras necesitas analizar?

Fundamentos de la PCR

Amplifica fragmentos de DNA 

Aumenta la cantidad del fragmento de interés

La temperatura es la base de la reacción

Dependiendo de las técnicas puede ser muy sensible

Puede ser dirigida o al azar

Se necesita equipo específico

Amplificación selectiva dependiendo del primer/cebador

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Preguntas

Gracias por vuestra atención

Dr. Braulio Esteve-Zarzoso

braulio.esteve@urv.cat

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