MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACION

FECAL (coliformes, colifecales, y E. coli)

I. INTRODUCCION:
Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son:
Coliformes, Colifecales, Escherichia coli, y Streptococus del grupo D de Lancefield;
por cuanto normalmente se le encuentra en el tracto digestivo del hombre y de
animales de sangre caliente.

A) COLIFORMES: El termino coniforme , comprende los géneros: Escherichia ,

Enterobacter , Klebsiella , y Citrobacter , y se caracteriza por utilizar la lactosa
como fuente de carbono. Los Coliformes distintos a la E. coli, persisten en el
suelo o sobre las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos de
campo.
B) COLIFECALES: Son un grupos de microorganismos procedentes de la incubación
del inóculo a la temperatura de 44 a 45.5°C, que contiene por lo general un alto
porcentaje de E. coli tipo I y II, por lo que son muy indicativos de la contaminación
fecal.
C) ESCHERICHIA COLI: Este microorganismo habita naturalmente en el tracto
digestivo del hombre y de otros animales de sangre caliente.
La presencia de este microorganismo en un alimento dado se interpreta como
contaminación directa o indirecta de origen fecal, por lo que se considera a la E.
coli como el indicador clásico de la presencia simultanea de bacterias patógenas,
entéricas, entre ellas, salmonella tiply, otras salmonellas, shigella, vibrios,
parásitos diversos, y virus entéricos.
Sin embargo la presentencia de la E. coli en un alimento no indica que exista
también necesariamente gérmenes patógenos, si no simplemente advierte el
riesgo de que pudieran estar presentes.
En conclusión, podemos considerar los siguientes:
 La E. coli, en un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de
los alimentos.
 Los demás coliformes, son buenos indicadores de una limpieza y de infecciones
no adecuadas o de una industrialización o procesamiento no correcto de los
alimentos.
 Los coliformes fecales, tiene una mayor probabilidad de contener gérmenes de
origen fecal, por lo que son organismos indicadores mucho mas seguro de la
contaminación fecal que los coliformes totales.

MEDIO DE CULTIVO: Los medios de cultivo en la presente práctica son los siguientes:

A) Para coliformes : método de recuentro en placas : Se utiliza el agar rojo violeta

con sales biliares (VRBA), que tiene la siguiente composición:

 Cristal violeta 2.0mg

 Rojo neutro 30.0mg
 Extracto de levadura en polvo 3.0mg
 Sal biliar N° 3 1.5mg
 Lactosa 10.0mg
 Cloruro de sodio(Na Cl) 5.0gr
 Peptona 7.0gr
  Agar Agar 15.0gr
 Agua destilada 1.0lt

Después de la disolución llevar el pH del medio 7.3. El calentamiento se realiza a

mas o menos 100°C para la disolución de los ingredientes, el afeminar bacterias
vivas que pueden dificultad la numeración de coniforme, hace q no haya necesidad
de esterilizar el medio, solo se conserva a 50-60°C después de lograrse la
disolución. Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram.(-) que
fermentan la lactosa (denominada bacteria coniforme o coli-aerógenes), como la E.
coli, Citrobacter, freundii, Enterobacter aerógenes, etc., si no también la bacteria
intestinales lactosa (+) conocida como colifecales, patógena indeterminados como la
salmonella, Arizona Shingella, y las especies denominadas “Paracolobactrun”. El
medio se caracteriza por que lleva consigo un colorante apropiado y sales biliales que
van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no son coliformes.

1. Pruebas Presuntiva, para determinar coliformes totales: para esta prueba se

utiliza el Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a doble y simple
concentración cuya composición es la siguiente:
 Verde brillante 15.0 mg
 Peptona 10.0 gr
 Lactosa 10.0 gr
 Bilis deshidratada 20.0 gr
 Agua destilada 1.0 Lt

Esta formula es a simple concentración, para obtener doble concentración, se

adiciona el doble de cada componente en un litro de agua destilada. Después de
la disolución llevar al pH a 7.0–7.2 y repartir en tubos de ensayo a razón de 9.0 ml.
Provisto de una campana Durham y esterilizar a 121°C x 15minutos.

2. Prueba Confirmativa o Test de Eijkam, para determinar Colifecales: Se utiliza los

siguientes medios de cultivo: Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a
simple concentración; y Caldo Pectonado cuya composición es la siguiente:
 Peptona o tristona 10.0gr
 Cloruro de Sodio 5.0gr
 Agua Destilada 1.0Lt

Después de la disolución llevar el pH a7.0 y repartir a razón de 5.0ml por tubo de

ensayo y esterilizar a 121°C por 20minutos.

II. OBJETIVO:

Adiestrar al estudiante con las técnicas e interpretación de los microorganismos

indicadores en los alimentos.

III. REVISIÓN LITERARIA:

Escherichia coli es una de las bacterias más abundantes en el tubo digestivo de los
mamíferos. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana
humana, a la que se atribuyen efectos beneficiosos para la salud. Existen, sin embargo,
cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis.
Principios. Las investigaciones ecológicas han puesto de manifiesto que E. Coli, procede
del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente, si bien
puede sobrevivir y aun multiplicarse en determinados substratos. Del origen fecal de E.
Coli, se concluye que si esta bacteria se encuentra en algún alimento ello indica que han
tenido lugar una contaminación de origen fecal y que, consiguientemente, existe el riesgo
de que hayan llegado al alimento en cuestión microorganismos patógenos de procedencia
entérica.
En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienización eficaz, que
asegura su inocuidad para el Consumidor, por lo general, la determinación de coliformes o
gérmenes del grupo coliaerógenes: gérmenes que, incubados a 37° C, fermentan la
lactosa con producción de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis. Ya hemos
señalado antes que esta determinación no tiene necesariamente relación con una
contaminación de origen fecal y consiguientemente, con la posible presencia en los
alimentos de microorganismos patógenos de procedencia entérica, sino que es sólo una
indicación de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial de los alimentos.
Se utiliza a veces también la denominación "coliformes fecales" refiriéndose a los
microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que
contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5
°C.

Bacterias coliformes:

Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan
morfológica y fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en
características pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad
solamente se reconocen seis. Se sabe que dos aparecen con frecuencia suficiente como
para mencionarse: E. Coli y Aerobacter aerogenes.

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos, que fermentan la lactosa y
forman ácido y gas. Son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a
temperaturas entre 30 y 37 ºC.

Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de

diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico
cuando se observan con luz refleja. Las colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son
mayores, muy mucoides, y de color Rosado; con frecuencia tienen un centro parduzco
pequeño.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS:

3.1 Materiales:
 Placas petri.  Muestra (Leche).
 Tubos de ensayo.
 Pipetas.
 Frascos erlenmeyer.
 Estufa de incubación
 Baño maría.
 Agar rojo violeta con
sales biliales.
 Caldo Lauryls sulfato.
3.2. Procedimiento:

Para Coliformes: Recuento en Placas:

La siembra se realizo por incorporación y para ello la forma de proceder es como

sigue:
 Primero se preparo las siguientes diluciones:
 mezclar en placas petri estériles 1ml de la serie de diluciones con mas o menos
15ml del medio de cultivo y mezclar, mover cinco veces en sentido horario,
cinco en sentido anti horario y cinco a los costados, dejar solidificar a
temperatura ambiente.
 Seguidamente adicionamos una capa fina de Agar aproximadamente 5ml
para luego llevar a incubar a 37°C por un tiempo de 24 - 48 horas.
 Finalmente luego del tiempo mencionado contar las colonias de las placas que
contienen entre 30 – 300 colonias, el número de colonias violeta rodeadas de
un precipitado rojo violeta, y reducir el número de coliformes por gramo o
mililitro de muestra.

Para Coliformes, Colifecales y E. Coli: Método de Número Más Probable (NMP).

1. Para Colifomes Totales:

 Pipetear 10ml del homogenizado del alimento, en tres tubos de ensayo con
CLVBB al 2%de doble concentracion.

 Pipetear 1ml de homogenizado en tres tubos de ensayo con caldo

lactosadoverde brillante bilis(CLVBB) al 2%.

 Agitar cada tubo de ensayo e incubar a 36 – 37°C x 24horas. Así mismo

pasado el tiempo anotar los tubos de ensayo que muestren producción de gas
más del 1/3 del volumen de la campana de Durham.

 Elegir la dilución más alta (la más diluida), en que sean positivos de formación
de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores (más diluidas) más
próximas. Si esto no es posible, ya que ninguna de las diluciones trabajadas
presentan tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas diluciones y anotar
el número de tubos positivos en cada una.

Para determinar el número de colifecales: Se sigue el test de Eijkman,

compuesto por dos tubos de ensayo conteniendo CLVBB al 2% a simple
concentración, uno y caldo peptonado (CP) el otro, en los que siembran por
azadas el inoculo de cada tubo positivo de la prueba anterior, luego se incuba en
baño maría a 44°C por 24 horas. Para el calculo se anotan los tubos de CLVBB al
2% con formación de gas (aquí no interesa ya la condición de mas de un tercio del
volumen de la campana, suficiente con que haya igual o cercano a un tercio de
gas) y su respectivo CP con formación de indol (formación de anillo rojo grosella
con tres gotas del reactivo de kovacs). Cualquier variación contraria se considera
prueba negativa. Luego del triple numero obtenido, se logra el valor respectivo de
la tabla de NMP y se procede igual que para el anterior caso visto.
V. RESULTADOS:

Número de coliformes:

Lecturas

Placa 2A: --- fd = 102 N = 26 x fd

Placa 3A: --- fd = 103 N = 26 x104
Placa 4A: 26 fd = 104 N = 2.6 x105 ufc/ml.
Diluciones: -1: 10 = 3
-2: 100 = 1
-3: 1000 = 0

Lectura: 3 – 1 – 0.
Valor de la tabla del NMP: 43.
Dilución intermedia: fd = 100.
Formula:
Población/ml = NMP x fd(i)
100
N° = 43 x 100
100
N° = 4.3 x 101 col/ml.

VI. DISCUCIONES:

Se obtuvo en la práctica realizada resultados negativos a la prueba de colifecales, por

ello se descarta la presencia de colifecales en el alimento usado como muestra, por
ende descartamos la presencia de E.coli. Esto nos indica que el alimento ha sido
manipulado en condiciones asépticas, sin descartar la presencia de otros
microorganismos, pero con un nivel de carga aceptable para el consumo humano. A
todo esto según bibliografía revisada una carga baja de presencia de microorganismos
hace que el alimento se apto para el consumo y no pueda ser perjudicial para la salud

VII. CONCLUSIONES:

Concluimos con respecto a los objetivos antes relacionados que la determinación de

bacterias coliformes fecales y totales, pueden estar presentes tanto en los alimentos
como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden
transmitir a través de las heces fecales.
La mayoría de los enterococos, estreptococos y demás grupos o géneros microbianos
son algunos patógenos y no patógenos, de estos se pueden preparar fermentaciones,
que mediante un largo proceso, llegan a ser elaboradas en productos comestibles,
garantizando al consumidor la mayor seguridad al consumir ese producto fermentado.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 García, Monses. Microbiología de los Alimentos

 J.M. J.A.Y. Microbiología Moderna de los Alimentos

CUESTIONARIO
1) Diga las razones por las que la prueba de kliger es importante para la
determinación de la E. coli.
Por que mediante la observación de las características de la muestra