RECOMBINACION- INGENIERIA GENETICA

Básicamente la técnica de DNA recombinante, como su nombre lo indica es una tecnología que
ha sido posible gracias a todos los estudios que antes de 1970 se hicieron sobre DNA, sobre
biología molecular.

Podemos decir que antes de 1970 la molécula de DNA era una molécula muy difícil de analizar,
muy complicados sus estudios, por ser una molécula muy larga, ya que el DNA humano tiene
tres mil millones de nucleótidos por 10 a la 9.

Que beneficios ha traído esta metodología?...

 que actualmente la molécula es mas fácil de estudiar

 Es posible obtener regiones separadas de determinadas zonas codificantes del genoma
 Es posible determinar la secuencia de nucleótidos y las vecindades de esas secuencias
y
 De alguna manera podemos expresar el gen en un sistema bacteriano por ejemplo
(DNA RECOMBINANTE) o se puede transferir el gen a otro organismo (transgénesis) y
participar en la terapia génica.

La técnica del DNA recombinante, es una tecnología que se facilito a partir de 1970 cuando
este par de señores Stalin collen y Roger hicieron el primer experimento de DNA
recombinante, a partir de allí ha habido todo un desarrollo en técnicas, en métodos y en
conocimiento q ha facilitado este experimento que permito secuenciar el genoma humano
y otros proyectos genoma, gracias a q se pudieron clonar pedazos del genoma humano.
Básicamente la técnica ha tenido un gran impacto hoy en día, hay una gran escala de
producción de biomoleculas a partir de toda la tecnología del DNA recombinante, tanto en
termino de proteínas terapéuticas como otro tipo de productos como la insulina
recombinante q ya conocen, la cura de hepatitis B recombinante, que son algunos de los
muchos productos que hoy en día se producen por medio de esta metodología, esto ha
hecho que los costos de producción de muchos de estos productos bajen…
Antes de 1985 cuando sale el DNA recombinante 100 unidades de insulina bovina costaba
alrededor de unos 100 - 150 dólares, hoy en día la misma insulina HUMANA, producida vía
recombinante cuesta alrededor de 10 dólares cada 100 unidades..Hay mas bajo costo y
esto ha hecho q la insulina sea muy aplicable, a costos bajos y con una ventaja; que es
humana, no bovina como la anterior…. Y esto muestra que este tipo de enfoques tiene sus
beneficios. Lógicamente tiene lado oscuro, que es lo que hay que tener en cuenta de estos
experimentos de DNA recombinante, por que se presta para producir “organismos
indeseables” y llegara todo un arsenal biológico, utilizable para guerra biológica, por lo
hay q tener sus consideraciones éticas.

Como podemos clonar genes?

Básicamente uno de los objetivos de la técnica de DNA recombinante es poder separar un
gen o un producto de ese gen, convertirlo en DNA y poderlo colocar en un sistema que se
llama VECTOR, este vector es un sistema genético, es una molécula de DNA que tiene
capacidad de replicarse autónomamente, ósea es capaz ella misma por que tiene sus
propias señales y origen de replicación , replicarse de manera autónoma del resto de
moléculas de DNA que tenga el organismo. Como vector ese DNA de alguna manera puede
aceptar otros DNA, ósea la idea de la técnica del DNA recombinante es introducir
covalentemente estos vectores, moléculas extrañas, o DNA extraños , que no son
naturales en ese vector .

Para generar ese tipo de DNA, ese tipo de moléculas a clonar hay 3 vías:

1. Vía impráctica que se dio hace mas o menos unos 25 años, que era tomar la proteína,
separarla, secuenciarla y a partir de la secuencia de aminoácidos ,producir un DNA
sintético, utilizando el código genético, sin embargo acuérdense que el código genético
es degenerado, ósea puede tener mas de un codón para determinado aminoácido,
entonces se produce un problema con base en la ubicación de codones … El único gen
sintético que se ha hecho hoy en día es el gen de la insulina, en 1975 se logro sintetizar
los 70 aa que tiene la insulina humana, pero pues para proteínas mas grandes,
realmente resulta muy largo y muy costoso. Sin embargo quedan dos opciones.
2. Se utilizan las moléculas de RNA mensajeros, recuerden q la molécula de RNA
mensajeros producida por la transcripción a partir de genes, contiene en su extremo 3
´ una secuencia larga de adenosinas… y es una característica de los mensajeros
eucarioticos , mediante esto es posible suspendiendo los rna de una célula , es posible
separar los mensajeros del resto de los RNA, y a partir de la transcriptasa reversa
(retrovirus), convertir ese RNA en su DNA, este DNA lógicamente es una copia, es
complementaria a ese RNA, será un DNA complementario. Que ventajas tiene
esto??...pues que si se tienen moléculas discretas, cuyo tamaño es equivalente al
tamaño del mensajero pero de doble cadena y en forma de DNA, se vuelven
“clonables” o se vuelven sustratos para la clonación.
3. La tercer vía es tomar el DNA directamente del organismo, si es un eucariotico se toma
el DNA nuclear , pero tiene un problema grave, son moléculas muy grandes , entonces
cuando se opta por la vía genómica y la opción 3 va al DNA de esa molécula y lo
fragmenta, esta fragmentación genera una colección de fragmentos de DNA, la idea es
que si Ud. suma todos esos fragmentos de DNA le representan el genoma completo
pero tiene la gran desventaja que tiene muchísimos pedazos de DNA que debe clonar
si se quiere hacer eficiente este sistema.

Bien se k se vaya por cualquiera de estas vías, el objetivo de la ingeniería genética es por
un lado identificar genes, hacer que estos genes identificados se puedan utilizar para usos
terapéuticos o para otro tipo de usos o utilizarlos como identificadores de enfermedades
o rasgos genéticos, estos son los usos o las aplicaciones q tiene.
Entonces tenemos para utilización terapéutica, por ejemplo proteínas recombinantes,
como la insulina, el factor de crecimiento y otros. Biofertilizantes que se usan mucho en
agricultura, a partir de supuestamente de rutas metabólicas que sintetizan nitrógeno, y
sintetizan otro tipo de elementos y terapia génica. Terapia génica en estos momentos
para corregir defectos bien sea sistémicos o celulares y curar enfermedades…
Como se hace eso?... básicamente ya teniendo como sustrato el DNA que va a clonar,
tenemos que hacer una cantidad de experimentación para lograr obtener esto…??...
Tener un vector, en este caso es un plásmido, los plasmidos son elementos genéticos
naturales extra cromosómicos de bacterias, pequeños, mas o menos 10.000 a 150.000
pares de bases y utilizarlos como vectores, ósea como una DNA que puede aceptar un DNA
extraño, q es el que se va a clonar, lógicamente esos plasmidos tienen unas marcas
genéticas. Esa marca genética en la mayoría de los plasmidos son de resistencia a drogas,
a antibióticos, Uds. saben que la resistencia bacteriana antibiótica es una resistencia
plasmidal , y que se utiliza esa marca de resistencia como un seguimiento q depende d q
una bacteria tenga o no ese plásmido, además esos plasmidos tienen un origen de
replicación, son capaces d replicarse de manera independiente del DNA cromosómico,
utilizando lógicamente el aparato de replicación de la bacteria, el objetivo es utilizar el
vector (en este caso el plásmido) para lograr integrar covalentemente pedazos d DNA.
Ese fragmento q se esta clonando tiene que estar covalentemente unido. Por eso se llama
DNA recombinante, por q lo q ha ocurrido es una recombinación integracional, el cual el
pedazo d DNA porta un determinado gen o porta una determinada característica genética
se introduce covalentemente en ese vector (en el plásmido) y pasa a hacer un elemento
genético mas de ese plásmido, a este plásmido lo vamos a denominar PLASMIDO
RECOMBINANTE.
Que se puede hacer con ese plásmido recombinante?.. Pues como es una molécula de
DNA, lo ideal es replicarla, para q produzca mas copias, en este caso se ha incluido un gen,
un pedacito de DNA q tiene un gen.. si yo logro introducir ese plásmido en una bacteria
que no lo tenga y hacer que esa bacteria se prolifere, es decir q produzca una población de
bacterias, cada una conteniendo ese plásmido, entonces se crea un clon, q se llama CLON
RECOMBINANTE, entonces podemos decir que un clon recombinante es la población
bacteriana en la cual todos los miembros de la población portan ese único plásmido que
tiene ese único pedazo de DNA recombinante.
Ahora, si Ud. tiene de muchos pedazos de DNA, y logra q cada recombinante acepte esos
pedazos , entonces Ud. va a tener una BIBLIOTECA O UNA GENETECA, entonces podemos
decir q una geneteca es la colección de todos esos clones recombinantes que
representarían en su totalidad el genoma q esta clonado o los mensajeros que ha utilizado
para replicarse. Entonces hay dos tipos de bibliotecas o genetecas; la biblioteca genómica,
q se hace precisamente sobre la fragmentación del DNA y posterior introducción
fragmento por fragmento de los vectores, se tienen todos los pedazos del genoma q
quiera, o hay biblioteca de cDNA, que son los que tienen colecciones de pedazos de rna
mensajeros retro transcritos a DNA .
Que hay q hacer después?..eso depende d lo que Ud. hizo y para q lo hizo, por eso se llama
tecnología, normalmente Ud. puede hacer que esas copias de ese gen puedan ir a producir
las proteínas por introducción, y producir entonces alta resistencia a ciertas plagas o
producir bacterias que generen petróleo, uno de los grandes logros de la ingeniería
recombinante es producir unas bacterias que son capaces de metabolizar petróleo, esas
grandes manchas de petróleo, y lógicamente representa una gran ventaja, o simplemente
puede utilizarla para producir proteínas recombinantes, ósea proteínas que normalmente
se producen, pero cuando se clona ese gen se producen bacterias o levaduras en la misma
célula, o producir proteínas que sirvan como terapias moleculares para el cuerpo como
aliviar la diabetes o disolver trombos. Como
toda tecnología debe tener una aplicación, y esta aplicación tiene sus implicaciones
comerciales, hoy en día muchos de los productos que uno consumen, o se consumen en
medicina, se producen vía este procedimiento, como la insulina, hormona de crecimiento,
vacunas, la vacuna de la hepatitis b, fue la primera vacuna recombinante y muchas de las
vacunas derivadas para virus se están haciendo vía DNA recombinante, y pues lógicamente
la importancia en el cambio de los destinos terapéuticos es grande.

Que necesitamos para hacer clonación?... primero necesitamos utilizar unas herramientas,
como corto DNA?... lo puedo cortar mecánicamente; lo someto a ultrasonido, pero me
queda muy difícil obtener una población heterogénea de estos pedazos, sin embargo
existen unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción, estas endonucleasas
tienen esa función; cortan, hidrolizan enlaces fosfodiester dentro de una molécula de DNA,
no importa que sea de humanos, que sea de ratón, no diferencia, lo único que le mira es q
ese DNA sea de doble cadena y que tenga unos sitios especiales para que la enzima pueda
unirse y hacer la hidrólisis. Esas endonucleasas se han convertido como las tijeras para
cortar DNA, para cortarlo en forma muy especifica, por que esa enzima solo reconoce una
secuencia de DNA muy especificas y combinaciones especificas que se llaman sitios de
restricción, entonces cada enzima de restricción va a tener un sitio especial de restricción
y entonces va a haber diferentes enzimas que van a tener diferentes sitios de restricción y
por lo tanto van a generar colecciones diferentes de fragmentos.
Estas enzimas inicialmente son naturales, ósea están en las bacterias, todas son de fuentes
procarioticas, en el año 1965 las aislaron de bacterias por que se producía infección por
bacteriófagos, cuando la bacteria era infectada por un bacteriófago (T4 o lambda), la
bacteria respondía, era un sistema de defensa el cual producía 2 enzimas, una enzima que
metilaba, introducía el grupo metilo en el DNA propio de la bacteria y una enzima que
hidrolizaba el DNA del bacteriófago que estaba entrando.
Hoy en día todos los descubrimientos de DNA se hacen con base en hibridación (cuando
dos DNA que comparten cierta complementariedad se abren y se colocan juntas, las
moléculas homologas van a formar heteroduplex de acuerdo al parecido de descendientes
que tengan, entonces se llama hibridación de DNA).

Hoy en día no se consigue ningún experimento, ningún trabajo de DNA recombinante sin la
secuenciación ya q hoy en día es una rutina en la mayoría de los laboratorios.
Para hacer DNA recombinante se necesitan unas enzimas, ya vimos endonucleasa de
restricción, la otra es la DNA ligasa, x que es una introducción covalente, entonces
necesito algo que me ligue, necesito transcriptasa reversa , para convertir los RNA msn en
DNA copiados y necesito otra serie de enzimas que me permiten hacer “maquillaje” en
ciertas moléculas como rellenar huecos que quedan, añadir 5´fosfato a porciones
terminales 5´ OH, añadir OH a las porciones terminales que no lo tengan, 3´que no lo
tengan, o eliminar en ambos terminales 5´, 3´ el grupo fosfato. Entonces necesitamos una
batería de enzimas, lógicamente estas baterías ya las venden, ya son comerciales , no
necesita sacarlas, simplemente Ud. hace su proyecto o hace su presupuesto y va y las
compra.

Que tiene una enzima de restricción?.... una endonucleasa de restricción tiene una
secuencia q se llama sitio de restricción, que es un sitio de restricción?... es una secuencia
de 4, 6 u 8 nucleótidos combinados de manera especial , que son el sitio por donde se liga
la enzima de restricción, en la endonucleasa su sustrato es DNA de doble cadena y estos
sitios especiales son palindromes (secuencias terminadas invertidas, a partir de un eje
imaginario), la ventaja es que como son muchas cada una tiene sitios diferentes, ósea hay
combinaciones diferenciales de esos nucleótidos que hace que cada una tenga sitios
específicos de restricción, el sitio tiene que estar en el interior de la molécula de doble
cadena, no se involucran las terminales.

El sustrato de las enzimas de restricción es un DNA de doble cadena que debe tener la
secuencia sitio de restricción, si no la tiene no va haber hidrólisis, y el producto final va a
ser la hidrólisis del enlace fosfodiester en alguno de esos sitios.

Actualmente hay unas 750 enzimas extraídas de muchas especies bacterianas, a la mayoría
de ellas se les conoce su sitio de restricción, se conoce donde “cortan” y q secuencia
reconocen.. La primera que se estudio y se caracterizo es la Eco R1, es Eco R1 por que
taxonómicamente la primera letra mayúscula es el genero de la bacteria donde se extrajo
(E viene E. coli), las otras dos letras minúsculas vienen de la especie de donde extrajo (co
viene COLI) y lo que sigue en adelante son características genéticas de esa bacteria y el
numero viene del numero de enzimas que produce. Esta enzima y solo esta enzima tiene
como sitio de reconocimiento de restricción esta secuencia GAA TTC, secuencia de 6
nucleótidos combinados de esta forma, si no la tiene ese DNA no es sustrato. Y corta en el
enlace fosfodiester GA- AG y genera q queden 4 nucleótidos sin aparear, quedan como
extremos protuberantes de cadena única. Todo DNA que ha sido sometido a restricción
con esta enzima le quedan unos extremitos 5´ de cadena única, que se llaman extremos
cohesivos o extremos pegajosos, esto tiene una ventaja muy grande q si yo tengo otro RNA
q he tratado con Eco R1 y los enfrento a los dos, los mezclo en un tubo de ensayo en
condiciones físico-químicas favorables, ellos pueden formar heteroduplex, formar
moléculas alineadas, que ahora son sustratos para la DNA ligasa, que une enlaces
fosfodiester.

El truco más simple para hacer clonación; tratar con endonucleasas de transcripción que
generen fragmentos con extremos cohesivos, enfrentar el vector cortado con la misma
enzima y el DNA puente con la misma enzima, hacer que se alineen por los extremos
cohesivos y ligar el que tiene el DNA recombinante.

Las 750 enzimas provienen de bacterias procariotes…

Eco R1, genera extremos cohesivos

Hae III , genera extremos romos , proviene de haemofilios aegipty y contiene 3 enzimas
de restricción.
Taq I, viene termus aquaticus, reconoce solamente una secuencia de 4 nucleótidos

Cualquier tratamiento de DNA que tenga sitio de restricción para Eco R1 va a generar
extremos 5´protuberantes que puede servir para enfrentar dos moléculas diferentes,
negra y roja q tengan los mismos extremos, y como son complementarios van a formar
heteroduplex parciales, que son el sustrato para la DNA ligasa, aquí se pueden producir las
moléculas de DNA recombinante, entonces si Ud. quiere producir un pedazo de DNA
humano en un plásmido o en un vector , lo digiere con Eco R1, lo enfrenta, los alinea y los
liga.

Cual es el DNA vector?... la definición general de un vector , es k es un sistema genético,

una molécula de DNA que se pueda replicar , q se pueda replicar quiere decir que tenga un
origen de replicación, todo DNA q se va a replicar tiene un origen y ahí el aparato
molecular (el replisoma) empieza a hacer la copia, la replicación. Una condición
fundamental de todo vector es k tenga un origen de replicación, si no lo tiene no puede,
por q el objetivo de la clonación es producir mas moléculas y si no se replica queda en las
mismas, de ahí en adelante lo que tenga los vectores, ya es de acuerdo al diseño que se
haga, Ud. escoge el vector que le convenga para su experimento. Los vectores tienen unas
características básicas, hay tres tipos de vectores; los plasmidos, q son moléculas
pequeñas, extra cromosómicas, naturales en las bacterias, los bacteriófagos virus que
infectan bacterias y unos vectores que se construyen a su voluntad, entonces Ud. ya puede
hacer ingeniería genética sobre vectores. Por ejemplo los cosmidos, no son moléculas
naturales, ya no existen, pues son un hibrido entre un pedacito entre el bacteriófago
lambda y un plásmido, q ventajas le da ese pedacito de DNA a lambda?... q ese plásmido
puede meterse en una capside viral, entonces tiene una doble vía; se comportan como
virus y se comportan como bacterias, esto tiene sus ventajas, q ventajas tiene??.. La
cantidad o el tamaño de DNA q se puede clonar , se llama capacidad d clonaje, q se define
como el tamaño máximo de las pares de bases q se puede clonar en ese vector, sin afectar
las propiedades replicacionales de ese vector, lo único q interesa es q se replique.

En los bacteriófagos se pueden meter hasta 23.000 pares de bases, esto se debe a que
lambda tiene una doble vía, puede producir mas partículas virales que se llama un
heretolitico, que hace q se produzcan mas virus o puede quedarse metido en el
cromosoma bacteriano, si se le quita toda la parte de genes de lisogenia y lo reemplaza por
un pedazo de DNA equivalente, mas o menos 25.000 pares de bases el virus produce mas
virus, entonces se logra mediante este truco hacer que esas 23.000 pares de bases se
introduzcan en ese vector, que se llama vector de reemplazamiento y sean manejados
como virus, entonces se va a producir partículas virales recombinadas.
La gran ventaja de los cosmidos, es que cuando se clonan, esas partículas virales
cosmidales las puede manejar como plasmidos, ósea las puede introducir dentro de la
bacteria y ya no producir más capsides, sino que tenga una replicación de tipo plasmidal.
Los plasmidos tienen unas características importantes; tienen marcas seleccionables, las
marcas mas importantes son las de resistencia a antibióticos, hay plasmidos de
resistencia a ampicilina, a tetraciclina, pero se puede tener marcas mas sofisticadas q den
unas reacciones mas sofisticadas como colores, puede tener plasmidos q tengan un
pedacito de beta-galactosidasa, entonces cuando se pone sustratos coloreados para esta
beta-galactosidasa, los colores pasan de azul a blanco.

Un plásmido que ha sido como el fundador de todos: pbr 3.2. P por plásmido, BR por los
dos biólogos q construyeron ese plásmido, ya q no es natural, es construido, ósea q la
ingeniería genética también ha servido para construir vectores, este plásmido tiene dos
resistencias una ampicilina y otra a tetraciclina.
Puedo colocar bacterias en ampicilina y en tetraciclina, y aquellas q crezcan en ampicilina y
no en tetraciclina son las que contiene el plásmido recombinante, es muy fácil, en menos d
16 horas puede identificar cual es colonia del DNA recombinante y cual no, tiene otra
ventaja y es que en un único sitio Eco R1 puede utilizar para ponerle marcas extras,
entonces muchos de los derivados de segunda generación de pbr 3 2 2 tiene promotores,
tiene una cantidad de otras marcas mas especiales que han sido clonadas en el sitio de
Eco R1.

Todo plásmido usado en la Ing. genética tiene q tener origen de replicación, si tiene origen
de replicación, cuando se coloca una bacteria en clorafenicol se produce un efecto de
potenciación, entonces ese plásmido pasa a tener muchas copias de esa bacteria, puede
llegar a tener hasta 200 o 500 copias de esa bacteria, esto tiene una ventaja muy grande
por que si Ud. necesita mucho DNA recombinante, lo tiene.

En algunos casos se les ha colocado otras marcas, como en el caso de la beta lactonasa,
tiene una proteína verde, para q la bacteria clon produzca un color verde y Ud. la pueda
diferenciar, el recombinante del no recombinante, hoy en día hay una cantidad de “trucos”
para poder seleccionar clones recombinantes.

Este es el mapa genético de restricción del pbr 3 2 2, se sabe todo, tiene 4331 pares de
bases, se sabe en donde están todos los sitios, en donde se localizan, ósea que si Ud.
quiere hacer pbr 3 2 2 debe saber todos los sitios de restricción y en donde están
localizados, ósea Ud. coge esto y ya tiene el mapa, la cartografía de restricción. Todos los
plásmidos hoy en día tienen esto, mas del 60% de los vectores de plásmidos se derivan del
pbr 3 2 2. Pbr 3 2 2 es como el tatarabuelo de muchos plásmidos q se crean
actualmente, ósea se ha utilizado como base pbr 3 2 2 para mediante ingeniería genética
hacer modificaciones y producir mas vectores.

Entonces como se clona el Pbr 3 2 2??....A partir de tratar ese pbr 3 2 2 con Eco R1, con Pb
1 o con Pb 2, que son únicos sitios, ósea hay un solo sitio de restricción, por lo tanto esos
plásmidos son secuencias articulares, DNA articulares, se abren y sirven entonces para que
se clonen y se vuelvan a restituir articulados, ósea queda como DNA articulado.

El que esta experimentando necesita lo mas simple para poder evidenciar q propiedades
tiene un plásmido y q no, por eso la resistencia a drogas es muy fácil, en otros casos
cuando Ud. quiere expresar una proteína Ud. necesita saber que tanta capacidad de
transcripción tiene el plásmido, entonces le coloca una marca seleccionable de
promotores, por que el objetivo es producir mucho transcripto para q haya mucha
proteína, si Ud. quiere q le produzca colonias verdes o verdes, le introduce la proteína
verde o blanca, todo ese tipo.

Este es un experimento ya de producir una biblioteca genómica en plásmidos, en ese caso

entonces se esta introduciendo el plásmido recombinante y se esta conservando la marca
de resistencia a ampicilina, por lo tanto todo plásmido recombinante que transforma una
bacteria se convierte en un clon resistente a ampicilina, esa es la forma de seguirlos.
Entonces Ud. simplemente coloca en un medio de cultivo ampicilina y solamente van a
crecer todos los clones que tienen el plásmido recombinante, los otros como son sensibles
van a morir.
Esta colección ahora se guarda en forma de colonia, Ud. la puede guardar, coge la colonia,
la guarda a -150 grados y Ud. tiene ya el clon. Entonces los clones recombinantes se
guardan así, se guardan en medios con glicerol 50%, se congelan se guardan a – 156 y por
años se puede mantener ahí, cuando Ud. los quiera reactivar, simplemente los saca, los
descongela, los reactiva, los pone a crecer y ahí tiene el clon.

Normalmente muchas bacterias necesitan ser preparadas para que el plásmido entre,
recuerden que la transformación es un proceso natural de muchas especies bacterianas.
En q consiste la transformación??.. En la entrada de DNA a la bacteria. E coli, no es una
transformadora natural, no deja entrar moléculas de DNA externas, pero por ejemplo
neumococo si, por eso es que la resistencia a neumococo es muy fácil, por que esos
plásmidos libres entran rápidamente a neumococo, y neumococo se vuelve resistente muy
rápidamente , entonces E. Coli no es muy transformable pero neumococo si, eso depende
de unas características de la pared y de la membrana de esas bacterias, pero como no
transforma rápidamente eso obliga a que acepte, entonces Ud. mete ese DNA por
transformación y ya ahí esta lo que se llama la selección, una vez q ha crecido Ud. lo
somete a selección, en este caso estamos seleccionando para ampicilina resistente y le
hemos puesto una marca coloreada de b lactosa menos o lac z menos, que es un pedacito
de la beta galactosidasa que hace que la bacteria en presencia de sustratos coloreados de
un color blanco, la recombinante, la q no tiene la recombinante da un color azul, muy
rápidamente en su cultivo Ud. coloca eso, y en termino de una hora pues ya selecciona las
blancas de las azules, identifica las blanca, las coge con un palillito y las guarda. Entonces lo
q ha hecho es una selección de clones, d esa colección grandota ha seleccionado los que
tienen plásmidos recombinantes y si tiene los recombinantes es por que Ud. tiene los
pedazos de DNA q Ud. guardo allí.

Hay viene un problema grave y es q normalmente estos procesos de clonación molecular

se hacen para buscar genes, para buscar secuencias especificas, entonces viene el
problema por que al seleccionar esa gran cantidad de bacterias que tienen clones
recombinantes, la que tenga el gen de la secuencia q Ud. esta buscando la cosa se pone un
poquito mas dura, esto se puede hacer por medio de un tamizado, o por una selección ya
q el DNA se puede hibridizar (cojo 2 DNA d fuentes diferentes pero relacionadas, los abro,
las desnaturalizo, las enfrento entre ellas y de acuerdo al parecido molecular de
secuencias, formo híbridos, con cadenas dobles, q están en forma de doble cadena
dependiendo del grado de homología q tengan entre ellas).

Entonces supongamos q quiero buscar el gen de beta globina, supongamos q en el

experimento hicieron una biblioteca genómica y quiero buscar el plásmido que tenga el
gen de beta globina o los plásmidos q tengan pedazos de beta globina…los reticulocitos
son los precursores d los eritrocitos y son células en actividad d RNA mensajeros de
globinas, tienen alta cantidad d mensajeros de globinas, estos mensajeros se pueden
aislar, como los puedo aislar??............ donde se producen las proteínas?, en los ribosomas,
y q es lo q sale primero d una traducción?.... q extremo?..El extremo amino, entonces yo
puedo utilizar anticuerpos contra los primeros nucleótidos de los aminoácidos del extremo
amino y cojo los polisomas q están haciendo traducción y cojo los RNA mensajeros y los
someto a inmunoprecipitacion con esos anticuerpos. Entonces q obtengo en el
precipitado; polisomas +, pedacitos de la globina, y RNA mensajero de globina, aíslo todo
eso y me quedo con el RNA mensajero de globina…y q hago??.. Lo retro transcribo, ósea,
obtengo una sonda por que ese DNA copiado va a tener secuencias de beta globina, q
luego con eso puedo buscar en mi clon recombinante, cual d esos tienen las secuencias
complementarias, entonces q he desarrollado??.. Una sonda, es un pedacito de DNA
natural o sintético q me permite hibridizar funciones complementarias en estos clones.
Esta sonda la tengo q marcar con algo para poderla seguir, inicialmente las marcas eran
radioactivas, se marcaba ese DNA con fosforo 32 y azufre, de tal forma q cuando se
formaban los heteroduplex, ósea los híbridos, se podía seguir eso por que ese hibrido se
exponía a una película de rayos x, entonces Ud. tenia en esa placa de cultivo varias
colonias, las transfería a un filtro de celulosa, ese filtro lo desnaturalizaba, abría los DNA
que estaban allí, colocaba esa sonda marcada con fosforo 32, hibridizaba ese filtro, la zona
q iba a buscar secuencias complementarias , lavaba y exponía eso a una película de rayos x
y en donde aparecían las manchas oscuras eran colonias q contenían secuencias
complementarias a la sonda q se uso, en este caso la beta globina, entonces se rescato los
clones recombinantes q tienen beta globina.

Hoy en día es muy fácil pues las secuencias parciales se conocen en casi todos los seres
humanos, de lo s 27600 genes q se calcula q tenemos los humanos, mas o menos el 80% ya
esta secuenciado total o parcialmente, si quiero utilizar una sonda de beta gala tosida o
manogalacsidasa, entonces Ud. ya sabe q parte del gen ya esta secuenciado, entonces
químicamente secuencio una sonda pequeña de 20 o 30 nucleótidos q lo utilizo para
hacerlo. Las sondas de hoy en día no se marcan radioactivamente por cuestiones
ambientales, sino q se marcan con moléculas q producen luz, por quiloluminescencia,
entonces se marca con una molécula ese DNA y hace la reacción y comienza a ver
destellos de luz y lo q coloca en una película de rayos x, esos destellos de luz van velando y
después se lava eso y prácticamente es lo mismo q la radioactiva. U otra opción es
coloreada con biotina, hay muchos métodos de selección.

Entonces ya tenemos la colonia q tiene el gen q yo quiero, ya tengo el 80% del

experimento del DNA recombinante, entonces q tengo q hacer ahora?... trabajar con eso,
si lo quiero expresar, entonces para q se produzca la proteína, si lo quiero integrar en otro
lado, muchas cosas.

En algunos casos, los vectores a veces no tienen los sitios q uno quiere, entonces se los
puedo poner, sintetizo químicamente un nucleótido q tenga los sitios de restricción, estos
se llaman poli adaptadores, entonces si no tengo sitio para pm 1, lo puedo crear, esto hace
q por el método q les mostré se pueda tener muchas opciones de endonucleasas de
transcripción, casi todas ellas produciendo extremos cohesivos q me sirvan para clonar.

En la bacteria, una bacteria nunca va a producir insulina artificialmente, pero las bacterias
recombinantes por medio de esta tecnología puede producir grandes cantidades de
insulina, y esto hace que los costos sean mas baratos por q Ud. puede cultivar litros y litros
de las bacterias, y puede ser purificado ml y gr de insulina, q es la q le venden a los
diabéticos para su tratamiento. Los bacteriófagos lambda son otro grupo vectores q tienen
reemplazamiento y simplemente es quitarle un pedazo y reemplazarlo por otro, tiene la
ventaja q puede trabajar con pedazos mas grandes, ya q lambda tiene una doble vía; lítica
y lisogenica. Si le quito los genes de lisogenia y lo reemplazo por un pedazo extraño d DNA,
conservo las características y por tanto puedo producir más partículas virales
recombinantes, entonces en lugar de colonias de bacterias, voy a tener poblaciones de
virus recombinantes.

La colección de todos los bacteriófagos q contengan todos los pedazos de DNA seria una
geneteca genómica de lambda, la ventaja es q puedo tener fragmentos mas grandes.

Los cosmidos tienen una doble vida, por q pueden estar en una capside viral como clones
infecciosos y una vez q llegan a la bacteria pasan replicarse como plásmidos, entonces se
pueden manejar como plásmidos y puedo utilizar las partículas virales cosmídales para
infectar bacterias, q gana ahí??... mas cantidad de DNA, ya q cuando se hacen genetecas
entre mas grande sea el pedazo de DNA q se va a clonar, mejor, x q habrá menos
recombinantes.

El cosmido tiene un origen de replicación, tiene un COS, tiene ciertos marcadores

seleccionables para resistencia, el origen de replicación plasmidal y el sitio cos. Al infectar
no se replican como virus sino q se replican como plásmidos.

Para crear cDNA básicamente se tienen q aislar los mensajeros, a partir de cromatografía,
q permite seleccionar solamente algunos RNA q tengan poli As, esto se someten a una
retro transcripción por medio d la transcriptasa reversa y lo q se obtiene es una molécula
de cDNA q es copia del RNA, q se llama cDNA copia o complementario, la desventaja es q
no hay sitios, puedo generar los sitios cohesivos cortando con la enzima o adicionando
pedacitos de DNA q tengan sitios de restricción, entonces genero extremos cohesivos y
puedo clonar el plásmido o el virus.

Una biblioteca de cDNA va a tener la colección de RNA mensajeros q están siendo

transcriptos en esa célula, q va a ser muy importante para averiguar la expresión de genes
a través de esos c DNA.

Para clonar la idea es q tenga la secuencia de genes completas, entonces se utiliza un

vector q tenga una localización cromosómica conocida, una cantidad de cosas previas para
q se fragmente... q tipo de vector usar??... va depender de lo q Ud. quiera; tamaño del
gen, si el gen es pequeño se usa plásmido, si el gen es grande se usa cosmidos. La
velocidad para seleccionar, q tipo de mecanismo quiere q seleccione; rápido, mas
elaborado. Si se quiere q se exprese..Si quiere q se exprese tiene q ser un vector q tenga
promotor, ese promotor puede ser natural o puede ser introducido por DNA
recombinante.

Una cosa interesante en los plásmidos es q puedan ser transmisibles, es decir q puedan
transmitirse a las generaciones siguientes.

Los productos del DNA recombinante, básicamente es la expresión de genes clonados, en

forma de proteínas (proteínas recombinantes), alteración de genes clonados, producción
de nuevos genes x ejemplo la industria farmacéutica esta produciendo nuevas proteínas a
partir de genes modificados y en los jabones, esas famosas proteasas neutras , q se usan
en los jabones q dicen q quitan todas las manchas, arrugas, todo..Esas proteasas no existen
en la naturaleza, han sido construidas conservando los sitios catalíticos para q sean mucho
mas eficientes en las desintegrasas, hidrólisis de aminoácidos, ósea q entre mas sitios
catalíticos tengan esas proteasas mas efectivos son en limpiar, son detergentes mas
activos.

En plantas puedo inyectar parásitos bacterianos como el agrobacterio, q es una bacteria q

produce las agallas en las raíces de las leguminosas, pero la ventaja q tienen es q fijan
nitrógeno, entonces a través d esto se ha podido introducir toxinas. También se ha
utilizado para hacer animales transgénicos resistentes a virus, a infecciones bacterianas y
la terapia génica q veremos en la próxima clase…………………………….