PROCEDIMIENTO DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CARRERA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA DE LOS RECURSOS NATURALES

SEDE EL GIRON - QUITO
DOCENTE GABRIELA MÉNDEZ
MATERIA MICROBIOLOGÍA
ESTUDIANTE NERY CAJAS Y MARCELO BALSECA

PRACTICA N° 2
TEMA: Técnicas de muestreo y recuento total de aerobios mesófilos en alimentos.
OBJETIVOS

• General: Aplicar los conocimientos adquiridos sobre la preparación de diluciones,

placas Compact Dry, técnica de extensión y vertido en placa para recuento de
microorganismo.
• Objetivos específicos:
1. Aprender metódicamente los pasos correctos y necesarios para la
elaboración de diluciones, técnicas de extensión en placa y placas Compact
Dry para realizar un recuento microbiano.
2. Calcular el número de colonias (UFC) que se lograron obtener de un
alimento solido de un puesto callejero.
3. Comparar los UFC/ml con la norma INEN para determinar si el alimento puede
seguir siendo consumido con regularidad por los seres humanos.

INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos que conocemos y muchos otros que aún no, no se encuentran
flotando en el aire, en cambio estos se encuentran sobre partículas inertes, hay varios
ejemplos como lo son: polvo, gotas de agua, etc. Estas sirven como medio de transporte,
con lo cual pueden depositarse sobre las superficies, es por ello por lo que mientras más se
limpie un área menor será el número de microorganismos presentes en el aire de esta. Para
realizar este análisis se emplean varias técnicas una de ellas es la sedimentación que es un
método de sedimentación en placa, y también ponerlos en una placa de agar con extensión
en placa. El control microbiológico proporciona información sobre la cantidad de
microorganismos presentes sobre una superficie en este caso sobre algún alimento que
estuvo expuesto, esto nos permite el análisis de cualquier tipo de superficie en el cual estos
alimentos fueron expuestos o a su vez su mal trato o mal uso de agentes de desinfección
como lo son un mal lavado tanto como el utensilio utilizado como el animal o vegetal
utilizado aquí incluso el uso de guantes para servirlo o un ambiente estéril para conservarlo,
incluso irregulares, y con cualquier descontaminación ya que se pueden realizar diluciones
decimales, se debe definir el contenido que se va a tomar de la muestra, se calcula el
número de UFC/g o mL.
METODOLOGÍA:
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• Recolección de muestra:
Se obtuvo un alimento solido de un puesto ambulante, para la recolección de la muestra
se debe tomar en cuenta que el muestreo debe ser realizado de forma aleatoria por todo
el lote. Primero se debe cortar en porciones muy pequeñas con ayuda de un cuchillo y un
tenedor esterilizado previamente, hasta que se logre obtener una masa de 200 gramos.
Recoger la muestra con cuidado con ayuda de algún implemento esterilizado, luego se
procede a colocar el alimento en una funda estéril que previamente debió ser rotulada
con los nombres de los integrantes, fecha, y alimento en cuestión.
Una vez que el agua se encuentra en la funda, se procede a colocar 100 ml de agua
peptonada y se procede a agitar la muestra con la finalidad de tener una mezcla
homogénea.

• Preparación de diluciones
Una vez obtenida la muestra, se procede a elaborar diluciones seriadas, para ellos
necesitaremos de 2 tubos de ensayo rotulados con la dilución correspondiente (10-2 y 10-
3), cada uno de estos tubos deben tener 9 ml de agua peptonada.
Luego se procede a tomar 1 ml de la muestra con ayuda de una micropipeta, y se coloca
con cuidado dentro del tubo de ensayo rotulado con 10-2, posteriormente cambiamos la
boquilla de la micropipeta y procedemos a tomar 1 ml del tubo rotulado 10-2, tal muestra
debe ser colocado en el tubo de ensayo que tenga rotulado 10-3. Con esto se obtuvo una
dilución seriada.

• Método de extensión en placa

Primero se procede a rotular la base de las cajas Petri que contienen Agar Nutritivo con el
nombre de cada integrante y la fecha en la cual se hace y la dilución que se está por hacer.
Segundo colocar con ayuda de una micropipeta 0.1 ml (100 µl) de cada dilución sobre la
superficie del agar.
Tercero sacar el asa de vidrio que se encuentra sumergida en alcohol al 96%, eliminar el
alcohol que sigue en el asa y acercar a la llama del mechero por pocos segundos, luego
retirar y esperar que se enfríe.
Como cuarto al enfriar el asa en una esquina del medio donde no se encuentre la dilución
de la muestra y extender el inóculo uniformemente sobre toda la superficie del medio, se
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procede a colocar el asa de vidrio nuevamente en el recipiente de alcohol que debe estar
ubicado a 30 centímetros del mechero.
Dejar reposar las placas 5 minutos y colocar las placas en la estufa e incubar por 24 horas
a 37°C. Verificar los resultados a las 24h y 48h.

• Método de conteo rápido con placas Compact Dry (Nissui) o Petrifilm.

Se empieza a rotular las placas para conteo rápido en el borde inferior con la dilución de
una micropipeta 1 ml (1000 µl) de cada dilución en el centro de la placa, tapar la placa y
dejar reposar por 5 minutos, con siguiente con esto en el caso de las placas de Coliformes,
las colonias azules verdosas corresponden a coliformes.

• Recuento de colonias
Efectuar los contajes respectivos a las 24 y 48 horas.
Elegir las placas cuyos contajes se encuentren entre 25 y 250 ufc y seguir la guía para
recuento microbiano.
Expresar los resultados como UFC/gramo ó ml de muestra tomando en cuenta que para
extensión en placa se usa 0,1 mL y 1 mL en placas Compact Dry o Petrifilm. Con esto el
recuento debe ser reproducibles es decir no debe existir un error mayor al 5% entre
duplicados. Con esto el resultado se calculará tomando la de los resultados de cada
dilución y no debe existir un error mayor al 10% entre diluciones.
RESULTADO(S) OBTENIDO(S):
Aerobios Placa 1 Placa 2 Promedio (ufc) UFC/ml Recuento
mesófilos (ufc) (ufc) total final

10-2 (Placas MNPC MNPC MNPC MNPC MNPC>

petrifilm) 3,5X106

10-3 (Extensión 348 352 350 3,5X106

en placa)

Fórmula:
𝑼𝑭𝑪 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 ∗ 𝒆𝒍 𝒊𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏
=
𝒎𝒍 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒐𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂 𝒆𝒏 𝒆𝒍 𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐
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𝑈𝐹𝐶 350 𝑈𝐹𝐶 ∗ 103 Para calcular el RTF se considera que el valor de las colonias supera
=
𝑚𝑙 0,1 𝑚𝑙 excesivamente los 250 UFC/ml, en el caso de las placas Petrifilm 10-2
de aerobios mesófilos, por lo que se estima que el número de
𝑼𝑭𝑪
= 𝟑, 𝟓𝒙𝟏𝟎𝟔 colonias puede ser superior a 3,5X106; valor que fue tomado de las
𝒎𝒍
Cajas Petri por el método de extensión en placa.
El número de colonias fue muy alto ya que existe la presencia de
colonias muy pequeñas pero numerosas.

10-3 10-3
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Placa 1 Placa 2 Promedio (ufc) UFC/ml Recuento

Coliformes (ufc) (ufc) total final
fecales

10-1 (Placas 85 96 90,5 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐

petrifilm)

Fórmula:

𝑼𝑭𝑪 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 ∗ 𝒆𝒍 𝒊𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏

=
𝒎𝒍 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒐𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂 𝒆𝒏 𝒆𝒍 𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

𝑈𝐹𝐶 90,5 𝑈𝐹𝐶 ∗ 101 Para calcular el RTF se tomó en cuenta las colonias que
=
𝑚𝑙 1 𝑚𝑙 presentaban una coloración morada intensa y que a su
𝑼𝑭𝑪 lado haya presencia de gas, lo que indicaría un proceso
= 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐 de fermentación del microorganismo E. coli con el
𝒎𝒍
medio.

Coliformes Placa 1 Placa 2 Promedio (ufc) UFC/ml Recuento

totales (ufc) (ufc) total final

10-1 (Placas 85 96 90,5 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐

petrifilm)

Fórmula:

𝑼𝑭𝑪 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 ∗ 𝒆𝒍 𝒊𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏

=
𝒎𝒍 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒐𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂 𝒆𝒏 𝒆𝒍 𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

𝑈𝐹𝐶 90,5 𝑈𝐹𝐶 ∗ 101 Para calcular el RTF se tomó en cuenta las colonias que
= presentaban una coloración morada intensa que a su lado haya
𝑚𝑙 1 𝑚𝑙
presencia de gas y las colonias que tenían una coloración rosada
𝑼𝑭𝑪 tenue.
= 𝟗, 𝟎𝟓𝒙𝟏𝟎𝟐
𝒎𝒍
Los valores de UFC de las coliformes fecales y totales pueden
llegar a ser muy cercanos por lo que se considero colocar el
mismo valor tanto para las coliformes fecales como las totales.
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Mohos y Placa 1 (ufc) Placa 2 (ufc) Promedio (ufc) UFC/ml Recuento

levaduras total final

10-2 (Placas 7 19 13 𝟏, 𝟑𝒙𝟏𝟎𝟑 𝟏, 𝟑𝒙𝟏𝟎𝟑

petrifilm)

Fórmula:

𝑼𝑭𝑪 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 ∗ 𝒆𝒍 𝒊𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏

=
𝒎𝒍 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒐𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂 𝒆𝒏 𝒆𝒍 𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

𝑈𝐹𝐶 13 𝑈𝐹𝐶 ∗ 102 Para el RTF se tomo en cuenta las colonias que tengan
=
𝑚𝑙 1 𝑚𝑙 un color rosado tenue, a rosado oscuro, debido a que el
𝑼𝑭𝑪 proceso de incubación fue solo de 24 horas no se pudo
= 𝟏, 𝟑𝒙𝟏𝟎𝟑 observar gran cantidad de colonias rosadas. Sin
𝒎𝒍
embargo, se logro tonar una gran cantidad de moho.
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HOJA DE RESULTADOS
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DISCUSIÓN (incluir citas):

NORMA PERUANA: (Norma Peruana)

Ilustración 1 Norma Peruana

En cuanto a la Norma peruana podemos decir que en el caso de los Aerobios mesófilos se estaría
pasando del límite permitido que es 105, ya que los valores obtenidos de nuestra muestra de
alimento (mote cocido), arroja un valor mínimo de 3,5x106. Por lo que no puede llegar a ser
consumido gracias a este excedente.
En el caso de mohos y levaduras podemos decir que se encuentra justo en el rango mínimo
permitido, ya que se obtuvo un valor de 9,05x102 por lo que podría ser consumido si tomamos en
cuenta solo este valor.

En cuanto a las coliformes totales podemos decir que no podría ser un producto consumido ya que
sobrepasa el máximo permitido por la norma peruana, ya que en este el valor máximo es de 102,
pero el valor arrojado por la muestra estudiada es de 1,3x103

Con esto se concluye que el producto no puede ser consumido por su gran cantidad de
microorganismos especialmente de E.coli.

NORMA INEN: (Instituto Ecuatoriano de Normalización, 2013) (Servicio Ecuatoriano de

Normalización, 2015) (Instituto Ecuatoriano de Normalización, 2013)

Ilustración 2 Norma INEN ARVEJA

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Ilustración 3 Norma INEN lenteja

Ilustración 4 Norma INEN Mezclas Alimenticias

No se pudo obtener datos específicos del mote cocido. Sin embargo se tomó referencias de otras
leguminosas cocidas como es el caso de la arveja y la lenteja, al revisar la tabla podemos decir que
en el caso de las leguminosas habrá un límite mínimo de 102 y un límite máximo de 103 en el caso
del microorganismo E.coli.

Por lo que podemos concluir que el mote puede ser consumido ya que nos arrojo resultados de
9,05x102, pero se debe tomar en cuenta que no hubo una incubación de 48 horas, por lo que el
resultado realmente superaría el límite máximo permitido. Por lo tanto, se debe regular el
consumo de este alimento a lo más mínimo posible.

Si tenemos en cuenta que la muestra recolectada tiene otros elementos aparte del mote,
podemos decir que se trata de una mezcla alimenticia, por lo que al analizar la tabla podemos
concluir que el alimento se encuentra entre el límite mínimo (103) y máximo (104) permitido ya
que, al realizar el estudio de la muestra, este arrojo resultados de 1,3x103.

• Considerando el análisis realizado se concluye que no debería ser consumido este

producto, las posibles causas de la contaminación puede ser que, al ser un puesto
ambulante cerca de una carretera, el medio ambiente proporcionaría contaminantes de
forma constante en los alimentos. También se puede tener en cuenta que al momento de
que se realizo la compra, no observamos que la vendedora constara de una buena higiene
a la hora de agarrar los alimentos, ya que servía los alimentos con la misma mano que
cobraba a os clientes sin haberse desinfectado.

CONCLUSIONES:

1. Durante esta práctica observamos la importancia de realizar mediciones exactas

para cada solución. Así que concluimos que lo más importante en la realización de
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soluciones es la exactitud y habilidad en la medición. Además, para hacer un

recuento adecuado en las placas se utiliza técnicas de extensión en placa y vertido
en placa, este recuento se elabora en base a una guía adaptada del libro “The
Compedium of Methods for the Microbiological Examinatin of Foods” y teniendo
cuidado de que este recuento sea reproducible y no tenga un margen error mayor
del 5 % entre duplicados y que no exista un margen de error mayor al 10 % entre
diluciones.
2. La muestra extraída de un alimento sólido, en este caso mote de un puesto
ambulante, dio origen a demasiadas colonias microbianas. Al realizar el recuento
de las colonias, se obtuvo valores que superaron los 250 UFC en las placas petrifilm
de aerobios mesófilos (10-2) y en las cajas Petri (10-3), por lo cual es considerado
muy extenso y por normativa se le coloco como muy numeroso para contar
(MNPC). Por lo que al realizar el recuento total final se puede llegar a concluir que
existe una gran cantidad de aerobios mesófilos.
3. Al analizar los resultados de los aerobios mesófilos, coliformes fecales y totales, y
de mohos y levaduras, podemos decir que no se puede consumir este producto de
forma continua por su alto contenido de microorganismos que pueden afectar la
salud humana, podría llegar a ser consumido unas pocas veces pero aun asi se
corre el riesgo de contraer daños muy perjudiciales.
BIBLIOGRAFÍA:

Anónimo. (2017). Placas Petrifilm™ para el Recuento Rápido de Coliformes. Recuperado el 03 de

Enero de 2022, de 3M Ciencias Aplicadas Para la vida:
https://multimedia.3m.com/mws/media/1624099O/3m-petrifilm-placas-rapidas-
coliformes-rcc-guia-de-interpretacion.pdf

Instituto Ecuatoriano de Normalización. (Septiembre de 2013). CEREALES Y LEGUMINOSAS.

ARVEJA SECA EN GRANO. REQUISITOS. Recuperado el 03 de Enero de 2022, de NORMA
TÉCNICA ECUATORIANA: https://www.normalizacion.gob.ec/buzon/normas/1562-1R.pdf

Instituto Ecuatoriano de Normalización. (Septiembre de 2013). NORMA TÉCNICA ECUATORIANA.

Recuperado el 06 de Enero de 2022, de
https://www.normalizacion.gob.ec/buzon/normas/1560-1R.pdf

Norma Peruana. (s.f.). NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOSMICROBIOLOGICOS DE

CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO. Recuperado el 03 de Enero de 2022, de PROYECTO DE ACTUALIZACIÓN DE LA
RM N° 615-2003 SA/DM: file:///C:/Users/usuario/Downloads/Norma%20Peruana.pdf
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Servicio Ecuatoriano de Normalización. (2015). MEZCLAS ALIMENTICIAS. REQUISITOS. Recuperado

el 03 de Enero de 2022, de NORMA TECNICA ECUATORIANA NTE INEN 3084:
file:///C:/Users/usuario/Downloads/pdf-nte-inen-3084_compress.pdf