La presencia generalizada en el medio ambiente de hexahidro- 

1,3,5-trinitro-1 ,3,5-triazina (RDX), uno de los más

ampliamente utilizaron explosivos militares, ha causado preocupación debido a su la toxicidad y la obstinación a la
degradación. Para investigar la potencial de las plantas para eliminar RDX del suelo contaminado y el agua, ingeniería de
Arabidopsis thaliana para expresar una  gen bacteriano que codifica un citocromo XPLA RDX de degradación  P450 (ref.
1).  Nosotros demostramos que el dominio del P450 XPLA se funde a una pareja redox flavodoxina y cataliza la 
la degradación de RDX en ausencia de oxígeno. Transgénicos  XPLA A. thaliana que expresan retirado y desintoxicado de
RDX  medios líquidos. Como un sistema modelo para la fitorremediación RDX, A. thaliana que expresan XPLA se cultivó
en RDX-contaminada suelo y demostraron ser resistentes a la fitotoxicidad RDX, produciendo biomasa aérea y radical
mayores que los de tipo salvaje plantas. Nuestro trabajo sugiere que la expresión de XPLA en el paisaje plantas puede
proporcionar una estrategia de rehabilitación adecuados para los sitios contaminados por esta clase de explosivos. 

Décadas de la actividad militar se han traducido en graves y generalizadas contaminación del suelo y las aguas
subterráneas por los explosivos que se recalcitrantes a la degradación, en particular, hexahidro-1 ,3,5-trinitro- 1,3,5-
triazina (demolición real explosivos, RDX) y trinitrotolueno 2,4,6- (TNT). Esta contaminación es principalmente una
consecuencia de la fabricación, uso y eliminación de estos compuestos energéticos. RDX es tóxico para todas las clases
de organismos analizados, incluyendo mammals2, 3 y plants4, y los EE.UU. Agencia de Protección Ambiental listas RDX
como prioridad de contaminantes y posible carcinógeno. la contaminación del RDX es una de las principales 
preocupación en todo el mundo, principalmente debido a su gran movilidad a través de suelos y la contaminación
posterior de las aguas subterráneas. Por ejemplo, RDX contaminación en campos de tiro representa una amenaza
significativa a determinados fuentes de agua potable, como los que cerca de la de Massachusetts Reserva Militar en
Cabo cod5. las tasas de degradación del medio ambiente de RDX en sitios contaminados baja. La incineración, el
compostaje, la bioaumentación y la detonación han ha utilizado para remediar el suelo contaminado con RDX. Sin
embargo, estos las estrategias son caros, puede ser ineficiente y ambientalmente destructivos. Uno de los principales
factores que limitan el desarrollo de en los procesos de biorremediación in situ ha sido la obstinación de RDX  la
degradación microbiana. Ciertas bacterias tienen la capacidad metabólica para destruir la estructura del anillo y facilitar
la mineralización de este energético compuesto
Sin embargo, el hecho de que el RDX persiste en el medio ambientesugiere que los microorganismos presentes en el
suelo contaminado se no tienen suficiente actividad de la biomasa o metabólica para degradar estecompuesto antes de
que se impregna en el agua subterránea. Teniendo en cuenta lamagnitud de la escala de la contaminación y la
insuficiencia  de las actuales enfoques, la atención reciente se ha vuelto a la fitorremediación: el uso de las plantas para
eliminar la contaminación del medio ambiente.Lamentablemente, por RDX la contaminación, este enfoque se ve
obstaculizada por la inherente baja endógeno capacidad de las plantas para degradar RDX, en  parte  debido  a  su
phytotoxicity4. La identificación y el aislamiento de bacterias y hongos que posea la capacidad para  degradar
RDX presenta la oportunidad genéticamente ingeniero de esta capacidad en las plantas. La  degradación
aeróbica de RDX se ha demostrado en el hongo de pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium7 y las bacterias
Rhodococcus 11Y1 cepa rhodochrous y Rhodococcus sp. Cepa DN228. 
Estas cepas rhodococcal RDX degradan por desnitrificación inicial, seguido por la hendidura del anillo, el nitrito 
rendimiento,  formaldehído y 4-nitro-2,4-diazabutanal7, 9 (fig. 1a). La comparación de secuencias predijo que el
gen XPLA (adhesión NCBI no. AF449421) que es responsable de RDX degradación en 11Y R. cepa rhodochrous puede
ser un citocromo P450(ref. 1). Secuencia de análisis también sugirió que XPLA contiene una flavodoxina  dominio  cerca 
de su extremo N. Para explorar el uso de XPLA en la fitorremediación de RDX, que expresa y se  caracteriza  la  proteína 
en Escherichia coli. La purificada XPLA fue demostrado por análisis de  SDS PAGE  para tener unaaparente peso
molecular del kDa B70 (fig. 1b) y un grupo hemo característica pico  de  la  enzima sustrato  férrico libre. En la reducción 
con el sodio ditionito, el pico de  Soret  pasado  de 420 nm  a 406 nm, y en el presencia de monóxido de carbono,  un 
cambio de característica a un máximo Soret a 448 nm  se  observa en la enzima reducida, un diagnóstico característica 
del citocromo P450 (Fig. 1c) Tripsina la digestión y en tándem identificación de espectrometría de masas (MS / MS) de
los péptidos demostrado que los péptidos de ambos flavodoxina y del citocromo P450  dominios estuvieron presentes,
demostrando que XPLA codifica para una fusión  flavodoxina-enzima citocromo P450. Después de la proteína y
covalente  hemo unidas se precipitan con ácido tricloroacético, el no covalente cofactor de flavina enlazado desde el
dominio flavodoxina soluble y se mantuvo visible en el análisis espectral, lo que confirma la presencia de la 
flavina cofactor de la proteína recombinante soluble (Fig. 1d). Este acuerdo XPLA sugiere que puede ser el P450 aislado
por primera vez a tener un flavodoxina fundido, por lo que podría representar un redox completamente nuevo sistema
P450. Es interesante, además de la XPLA aislado en el Reino Unido de R. 11Y rhodochrous cepa, homólogos de XPLA han
sido identificados en rhodococci aislado de explosivos en el suelo contaminado Australia (DN22 cepa) e Israel (cepa YH1,
la adhesión no NCBI. AAQ03207). El homólogos clonado hasta el momento parecen tener una alta grado de similitud
entre sí (499% de identidad de aminoácidos cubriendo el 60% de XPLA) y, especialmente, parecen estar ausentes a partir
de cepas de rhodococci aisladas de los sitios que no están contaminados con RDX (datos nopresentados) .  Esta obsv. es
apoyada por los proyectos de secuenciación del genoma de Rhodococcus equi10 y Rhodococcus sp. Cepa RHA1
(http://www.rhodococcus.ca/), junto con la secuenciación del ADN del medio ambiente projects11, que no han
revelado cualquier P450 similares. Como RDX ha estado en el medio ambiente sólo por un cuestión de décadas,
posiblemente sea XPLA desarrollado específicamente para degradar  RDX o está muy restringido en su distribución. El
RDX puede ser degradado por un citocromo P450 conejo en un ambiente anaerobiomedio ambiente, con RDX unión a la
enzima en la sexta coordinarposición de la hemo en lugar de oxygen9 molecular. Si se RDXvinculante en este sitio en
XPLA, a continuación, la actividad se observó en el ausencia de oxígeno. Actividad de recombinantes XPLA hacia RDX
fuedemostrado en condiciones anaerobias (O1 O2 ppm) siguiendo la desaparición de RDX y el aumento de formaldehido
(Fig. 1e). La relación entre la degradación de RDX a la oxidación de NADPH fue 1:0.9 (datos no presentados). Ferredoxina
reductasa fue agregó a la mezcla de ensayo como una reductasa de alquiler, la transferencia de electrones a XPLA de
NADPH durante la reacción. Con citocromo otros sistemas P450, tanto ferredoxina reductasa ferredoxina y se requieren
la transferencia de electrones a la P450 heme12. XPLA actividad hacia RDX se produce en ausencia de ferredoxina
agregó. Esto implica que el XPLA flavodoxina dominio está activo y capaz de recibir los electrones de reductasa
ferredoxina antes de transferirlos a la citocromo P450 hemo, o que los electrones pueden pasar directamente de la
ferredoxina reductasa a el hemo XPLA. En condiciones aeróbicas, la tasa de remoción RDX era doble más lenta, lo que
sugiere la inhibición de la degradación de RDX por el oxígeno (datos no presentados). Estos datos muestran claramente
que es capaz XPLA de degradar el RDX. Para investigar si esta actividad podría ser diseñado en las plantas, hemos
introducido XPLA en A. thaliana por Agrobacterium tumefaciens- mediada por la transformación y expresó que bajo el
control deel promotor 35S casi constitutiva. RDX es fácilmente absorbido por la planta roots13-16 y trasladadas a la
organs13 aérea de 17. Aunque algunas plantas poseen una capacidad intrínseca dedegradan los bajos niveles de RDX16,
RDX acumulada sobre el suelo se biológicamente disponible para la cadena alimentaria a través de la herbivoría o
posteriormente regresó a la tierra cuando las plantas mueren. El RDX naturales de degradación habilidades es poco
probable que sea suficiente para eliminar las altas concentraciones de RDX presentes en las aguas subterráneas y la
escorrentía del suelo de los sitios contaminados y, además, el RDX es fitotóxico en estos levels4. Cinco de forma indpen
transforma las líneas de A. thaliana, cada homocigotos para XPLA, se producido y caracterizado en el cultivo líquido y la
contaminación del suelo los estudios. El análisis de Northern blot revelaron que XPLA se expresa en todos los cinco
líneas, con los más altos niveles de transcripción se ve en las líneas 6, 7 y 12, un patrón similar de expresión de la
proteína se observó con un anticuerpo para XPLA (Fig. 2a). en medio mínimo líquido se utiliza p/ determinar las tasas
de captación de RDX, el uso de plantas de 10 días de edad tratados con 180 mm (40 mg / l) RDX. Este nivel es más de
tres veces que se mide en aguas residuales procedentes de fabricación sites18 y cerca del límite de solubilidad acuosa de
RDX19. Después de 5 d, el RDX había sido completamente eliminado de la medio por dos XPLA que expresan las líneas
(las líneas 35S:: XPLA-6 y35S:: XPLA-10), y los niveles de RDX reducido en un 57%, 42% y 32% por líneas 35S:: XPLA-12,
35S:: XPLA-7 y 35S:: XPLA-1, respectivamente (Fig. 2b). Ni formaldehído ni nitritos se detectó en el medio de la
naturaleza o el tipo de líneas transgénicas de A. thaliana. La mayoría de probable, deshidrogenasas endógena
formaldehido y nitrito reductasas presentes en A. thaliana asimilar estos productos en las plantaciones. Hicimos no se
observa una correlación entre los niveles de transcripción o de la proteína y las tasas de remoción RDX por las líneas de
plantas transgénicas. Esto puede resultar de efectos de posición en los niveles de expresión en varios tejidos de la raíz.

Los estudios que utilizan RDX-tierra contaminada se han realizado p/comparar el crecimiento de la línea 35S:: XPLA-10
con la de las plantas de tipo silvestre a nivel equivalentes de RDX a los encontrados en la formación contaminados
ranges4. plántulas de cinco días de edad, fueron trasladados en un suelo no contaminado y suelo contaminado con 50,
250, 500 y 2.000 mg / kg RDX. Eightweek-edad plantas transgénicas mostraron ninguno de los signos de toxicidad RDX
demostrado por las plantas de tipo silvestre, tales como el blanqueo y se encrespa de la hoja los márgenes y el tamaño
de la planta reducida (Figura 3a). La biomasa aérea y radical del 35S:: XPLA-10 plantas que crecen en suelos
contaminados fueron hasta tres veces mayor que las de las plantas de tipo salvaje (Fig. 3b). Por otra parte, brotes de las
plantas de tipo salvaje acumulado hasta tres veces más RDX que los del 35S:: XPLA-10 plantas (Fig. 3c). Los bajos niveles
de RDX que se encuentran en las hojas de la línea de plantas transgénicas y el aumento de resistencia a la toxicidad
sugieren que degrada XPLA RDX en planta. Para comprobar que este resultado se relacionó con la expresión de XPLA,
que crecieron las cinco líneas de expresión XPLA-en el suelo con y sin 2.000 mg / kg RDX. Raíz de biomasa de 35S:: XPLA-
6, 7, 10 y 12 fueron igualmente superiores a los de tipo silvestre, 35S línea:: XPLA-1, con tanto de tipo salvaje y 35S::
XPLA-1 roseta hojas con síntomas de toxicidad RDX (Véase la figura complementaria. 1 línea). La combinación de los
resultados de ambos suelos experimentos, la raíz de biomasas 35S:: XPLA-6, 7, 10 y 12 mayor en presencia de RDX que la
raíz biomasas de estas líneas, y del tipo salvaje, que se cultiva sin el RDX. Esto sugiere que los transgénicos líneas de uso
del nitrógeno derivado de la degradación de RDX para el crecimiento. Nuestro enfoque muestra que las enzimas
identificados en bacterias aisladas de los sitios contaminados pueden ser redistribuidos en las plantas para ampliar su
la fisiología, la tolerancia creciente de los contaminantes mediante la concesión de la capacidad para desintoxicar. Esta
técnica combina con éxito la biodegradación capacidades de las bacterias del suelo con la biomasa de alta y la captación
propiedades inherentes a las plantas. Ahora estamos de ingeniería más robusta especies de plantas tales como árboles y
pastos perennes en situ RDX fitorremediación. Aunque nuestro trabajo ofrece un medio eficaz de la limpieza de tierras
contaminadas con explosivos, sino que también proporciona una posible ejemplo de cómo las plantas pueden ser
modificados genéticamente para resistir altamente niveles tóxicos de los contaminantes orgánicos. Desde nuevos genes
microbianos mediaciónvías para la degradación de compuestos xenobióticos se pueden encontrar en los sitios
contaminados, este tipo de enfoque será aplicable a muchos otros tipos de contaminantes orgánicos.

MÉTODOS
RDX fue proporcionada por la Defensa de la Ciencia y Tecnología de Laboratorio(DSTL) (Fort Halstead, Kent, Reino
Unido). Purificación, expresión y caracterización de XPLA en E. coli. El XPLA gen  de pHSX1  (ref. 1),  diseñado  para 
contener  dos mutaciones silenciosas a eliminar los emplazamientos internos de BamHI, fue clonado en el vector de
expresión pET-16b (Novagen) y sobreexpresado en E. coli (Rosetta gami B, Novagen). Culturas se cultivaron  en caldo 
Luria en un agitador rotatorio (180 rpm) a 20 1C anOD600 de 1,0, 5 mg / l de riboflavina, 1 mM una aminolevuleic-
ácido y 0,5 mM de FeCl3 se añadido y la expresión inducida por la adición de 100 mM de IPTG. Las células fueron
cosechadas  después de 24 h, se resuspendieron en tampón fosfato 50 mMde sodio, pH 8.0, 200 mM  PMSF  y  lisadas
en 1500 p.s.i. en una prensa francesa (Thermo IEC) y centrifuga a 10.000 g. El sobrenadante se cargó en SU-Seleccione la
resina (Sigma) en tampón fosfato de sodio, pH 8,0, 0,3 M de NaCl (tampón A) y incubados  en lotes  separados por
2 h. Después de un lavado con tampón A, XPLA  se eluyó con 250 mM imidazol en un buffer y, a continuación se
dializan menos 4 1C en contra de dos cambios de 50 mM fosfato potásico pH 7,0. La proteína se
luego se almacena en alícuotas de 50% de glicerol a -80 C.

Actividad de XPLA. XPLA actividad se ensayó en un volumen de 1 ml que contiene 50 mM fosfato de potasio,  pH 7,0,

300 mM de NADPH, 100 mM de RDX, 0,1 unidades de ferredoxina reductasa (Sigma) y 15 mg XPLA. La reacción fue
terminó con el 10% 1,5 M de ácido tricloroacético. Líquida de alto rendimiento cromatografía  (HPLC)  el análisis se
llevó a cabo en una columna C18 Techsphere con  metil  50%  cyanide /50% H2O fase móvil, usando un HPLC Aguas
sistema que comprende un Módulo de separaciones 2695 y 2996 arsenal del fotodiodo Detector. El análisis se llevó a
cabo utilizando el software EmpowerPro. RDX fue seguimiento a 205 nm. El nitrito se detectó  utilizando  Greiss 
reagent20 y formaldehído por el Hantsch assay21. Reactivos y soluciones se hicieron anaeróbico antes de los ensayos
se realizaron por incubación durante la noche en un cámara  anaeróbica  (Coy Laboratorio de Productos), con  una 
atmósfera de nitrógeno. Los niveles de oxígeno se controlará mediante un modelo 10 Gas Analyzer
(CoyLaboratorioProductos)  y mantenido por debajo de 1 p.p.m. utilizando una mezcla de hidrógenodel 5% en el
presencia de un catalizador de paladio.
La sobreexpresión de XPLA en A. thaliana. El gen XPLA se clonó en el sistema de vector binario, pMLBart22 bajo
el control del promotor CaMV35S y el terminador ocs para producir el pMLBart vectores XPLA. A. tumefaciens-
mediada florales inmersión se utilizó para transformar pMLBart-XPLA en A. thalianaecotipo Columbia-0.

Experimentos de cultivo líquido. Esterilizado semillas de A. thaliana fueron germinadas en placas de agar. Después de 

48 h, 200 plántulas se transfirieron a matraces cónicosde 100 ml que contiene 20 ml de medio Murashige fuerza  y 
medianas Skoog23 y 20 mM sacarosa. Las plántulas se cultivaron asépticamente en un agitador  rotatorio (100rpm) a
20 1C, con 50 m mmoles-2 s-1 luz blanca y fotoperíodo de 24 horas. Después de 7 días de la medio fue  reemplazado
con 20 mM de sacarosa y 180 mM de RDX.

Estudios de suelos contaminados. Cinco días de edad de tipo salvaje y 35S::XPLA-10 plántulas fueron plantados  en 

macetas que contenían 30 g de John Innes no. Un suelo contaminado con 50, 250, 500 y 2.000 mg / kg s RDX  y  crecido 
a 180 mmol m-2-1 blanco luz y un fotoperíodo de 12 h con 20 días 1C, 18 1C temperaturas nocturnas.  Raíces
se burlan de la tierra con pinzas, y se enjuaga. Por los resultados presentados en datos complementarios, las plántulas
de 5 días de edad fueron plantados en macetas que contenían 50 g de del suelo, con o sin  2.000 mg  / kg RDX,  el
suelo se lavó suavemente de la soilrootbola de masa.

Extracción de RDX. RDX en extractos de plantas se determinó mediante método EPA 8330 (ref. 24). RDX se extrajo de la

tierra, liofilizado tejido de la planta utilizando2 volúmenes de 10 ml de metanol. Después de la evaporación de
disolventes en unvacío rotatorio,Las muestras se resuspendieron en 4 ml de metanol. RDX se determinó usando
HPLC condiciones que el anterior.
Nota: La información complementaria está disponible en la página web de Nature Biotechnology.

Figura 1 Caracterización del citocromo P450 de XPLA. (a) Esquema de la propuesta

de distribución RDX pathway8, 9. (b) la purificación de proteínas, el 10% SDSPAGE.
El carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, solubiliza proteínas recombinantes,carril 3, purificado por
afinidad XPLA. (c) absorción UV-visible del espectro purificada  XPLA:  oxidado, ditionito de
sodio reducido, reducido burbujea con monóxido de carbono. 
(d) espectros de absorción UV-visible del cofactor de flavinaextraído.
(e) Actividad de la proteína purificada en condiciones  anaeróbicas. 
Formas sólidas,activa XPLA; formas abiertas, cocidos XPLA. Los resultados son medias ± D.E. detres mediciones
repetidas.

Figura 2 Caracterización de XPLA que expresan A. thaliana líneas. (a) análisis de Northern blot expresión que

muestra de XPLA y constitutivamente  elactina  expresó gen (ACT2, la adhesión no NCBI.U41998).  MW, los
marcadores de peso molecular en kb. Análisis de Western blot que muestra los niveles de XPLA y la  membrana 
inmunoblot teñidas con Ponceau-S. MW en kDa. ARN y proteínas roseta de hojas de A. thaliana. WT, de tipo salvaje.
(b) La adopción de RDX por medio de A. thaliana plántulas. Los resultados son medias ± s.e.m. de cinco mediciones
repetidas.

Figura 3 RDX-estudios de suelos contaminados en la de tipo salvaje y 35S:: XPLA-10plantas. (a) las instalaciones de

ocho semanas de edad cultivadas en  suelo contaminado y el suelo con 50,250, 500 y 2.000 mg / kg RDX. WT, de tipo
salvaje. (b) Planta de biomasa aérea y radical. peso pf, frescos. (c) Los niveles  de RDX en el tejido disparar. Los
resultadosse media ± s.e.m.  de  cinco  mediciones repetidas.