Resumen (1998).
Este trabajo se llevó a cabo en
En este informe se registraron los
resultados obtenidos de la
observación e identificación de
hongos y bacterias, partiendo de los
cultivos sembrados en la Práctica No
4 (Aislamiento de hongos y bacterias
Fitopatógenos a partir de material
vegetal enfermo), se tomaron
improntas y muestras del material que
creció a partir de la siembra de
Sphaerotheca pannosa de hojas de
fresa (Fragaria ananassa),
Sphaerotheca pannosa de hojas de
una planta ornamental de jardín,
Colletortichum spp de fruto de fresa (F.
ananassa), Fusarium oxiporum en
tallo de clavel (Dianthus caryophyllus
L.) y Xanthomonas spp en follaje de
fresa (F. ananassa). Para la
identificación y observación de
Hongos y Bacterias, es indispensable
observar las estructuras reproductivas
y el uso de claves taxonómicas para
su descripción. Para observar las
estructuras reproductivas se hizo una
coloración con Azul de lactofenol, las
improntas se tomaron con cinta
transparente y su montaje en seco y
con una gota de agua, las claves
taxonómicas para la descripción
morfológica utilizadas Barnett y Hunter
el laboratorio de fitopatología de la
universidad de Cundinamarca
extensión Facatativá, teniendo en
cuenta las normas de bioseguridad.
Palabras clave: Impronta, tinción,
claves taxonómicas, observación,
identificación.
Abstract
In this report the results of the
observation and identification of fungi
and bacteria were recorded, based on
crops planted in Practice No 4
(Isolation of fungi and bacteria from
sick Phytopathogenic plant material)
imprints and material samples were
taken which grew from the seed of
Sphaerotheca pannosa leaves of
strawberry (Fragaria ananassa),
Sphaerotheca pannosa leaves of an
ornamental garden plant,
Colletortichum spp fruit strawberry (F.
ananassa), Fusarium oxiporum in
stem carnation (Dianthus caryophyllus
L.) and Xanthomonas spp in foliage of
strawberry (F. ananassa). For the
identification and observation of fungi
and bacteria, it is essential to observe
the reproductive structures and the
use of taxonomic keys to their
description. To observe the
reprouctive structures made a Materiales
Lactophenol blue staining, the imprints
were made with transparent tape and
mounting in dry and with a drop of
water, taxonomic keys used for
morphological description Barnett and
Hunter (1998). This work was
conducted in the laboratory of plant
pathology at the University of
Cundinamarca, Facatativá extension,
taking into account biosafety
standards.
Keywords: Imprint, staining,
taxonomic keys, observation,
identification.
Introducción
Los hongos fitopatógenos son de gran
importancia debido a que reducen el
valor del producto en el mercado. La
mayoría de los hongos fitopatógenos
afectan cultivos de gran importancia
económica, debido a esto se aplican
miles de toneladas de agroquímicos
en todo el mundo, con la necesidad de
establecer un sistema de control, sin
conocer el agente causal de la
enfermedad. (Becerra, Sosa, & Lopez,
2010)
Para controlar una enfermedad es de
vital importancia reconocer el agente
causal, si no se reconoce es probable
que los métodos de control sean
infructuosos. Para evitar esto es
indispensable realizar un correcto
diagnostico que provea de una
cantidad de información básica y
verídica, con la cual podemos
seleccionar el método de control
acorde con el agente cusal. (Deras,
2014).
1. Cámara de flujo laminar.
2. Nevera.
3. Mecheros.
4. Incubadora.
5. Plantas enfermas o anormales.
6. Lupas.
7. Bisturí y cuchillas.
8. Servilletas.
9. Marcadores.
10. Pinzas estériles.
11. Papel vinipel.
12. Cajas de Petri con los
microorganismos aislados en medios
de cultivo (Agar – agua y PDA).
13. Láminas y laminillas
14. Tinciones de Gram y azul de
lactofenol.
15. Microscopio
16. Hipoclorito de sodio (Clorox).
Tener en cuenta los siguientes
materiales para así cumplir las
normas de bioseguridad:
1. Protector naso-bucal.
2. Bata manga larga, cerrada color
blanco.
3. Zapato cerrado en suela anti-
deslizante.
4. Pantalón largo holgado.
5. Gorro desechable.
6. Gafas de laboratorio.
7. Guntes de nitrilo o vinilo.
Metodología
Esta práctica se llevó a cabo en el
laboratorio de Fitopatología de la
Universidad de Cundinamarca
extensión Facatativá, a una altura de
2.586 msnm. Esta localidad presenta
una temperatura promedio de 19°C y
una humedad relativa promedio de 60-
90%, la precipitación media anual es
de 200 - 300 mm (IDEAM, 2015).
En primer lugar se realizó la
desinfección de los mesones y de la
cámara de flujo con la ayuda de
hipoclorito, agua y las toallas estériles.
Ya con el espacio desinfectado, se
tomaron los medios de cultivo PDA y
Agar Nutritivo esterilizados
preparados en la práctica anterior, se
colocaron en la cámara de flujo
mientras se realizaban los repiques
para purificar las muestras.
Luego de esto se realizaron los
montajes de hongos y bacterias para
observaciones microscópicas en los
que se hicieron:
 Montaje coloreado directo con
azul de lactofenol y una porción
del hongo con aguja de
disección y se observó a 4X,
10X y 40X
 Montaje de impronta con cinta
transparente con ayuda de
azul de lactofenol, observando
a 4x, 10X y 40X)
 Cortes de cuerpos fructiferos
cortes a mano alzada, en los
que se realizaron cortes
transversales para observar la
forma y ubicación interna de las
esporas, con ayuda de azul de
lactofenol. Se observa al
microscopio.
Cuestionario
1. Por qué hay que hacer
tinciones para observar al
microscopio?
Las técnicas de tinción destacan las
características morfológicas de los
microorganismos para lograr ser
vistas con mayor nitidez en el
microscopio y lograr observar todos
sus detalles, aunque los
microorganismos vivos se pueden
observar directamente en fresco al
y microscopio óptico, la mayoría de las
veces es necesario teñirlos para que
por medio del uso de colorantes, sea
mucho más fácil su identificación,
Existe una gran variedad de tinciones
que pueden ser aplicadas dentro de
este campo. Las tinciones están
compuestas por un colorante la cual
es capaz de dar color a células, tejidos
o fibras. (López , Hernández, Colín, &
Cendejas, 2013)
Químicamente, el colorante está
constituido de un componente
cromóforo y un auxócromo. El
cromóforo tiene la capacidad de que
sus electrones absorban energía o luz
visible y emitan diversos colores de
acuerdo con la longitud de emitida
como resultado del cambio en el nivel
energético. Los auxócromos son
grupos funcionales o radicales que
constituyen una molécula y poseen
carga parcial positiva; tienen la función
de intensificar la formación de color
mediante la acción de grupos de  Para phytophthora fragarie.
átomos no saturados; su función es fresa y mora
desplazar a los cromóforo hacia  Para Xanthomonas:
longitudes de ondas largas para Ornamental (Begonia dregei),
aumentar la intensidad. (López , Árbol de caucho (Ficus
Hernández, Colín, & Cendejas, 2013) elástica), Filodendro de hoja
acorazonada. (Philodendron
Los colorantes tienen las siguientes
scandens)
funciones:
 Para Colletotrichum, tomate de
1. Permiten hacer visibles a los objetos arbol (Solanum betaceum),
microscópicos y transparentes. tomate de guiso (Lycopersicon
esculentum L.), aguacate
2. Revelan su forma y tamaño.
(Persea americana. Mill.)
3. Muestran la presencia de  El hongo de marchitamiento
estructuras internas y externas. bascular (Fusarium oxysporum)
causa infección en plantas de
4. Produce reacciones químicas
clavel y de rábano, tomate.
específicas.
2. Realice una descripción de los
géneros fúngicos encontrados
y mencione por lo menos dos
cultivos en los que causan
enfermedades, diferentes al
cultivo del que fueron aislados.
La descripción de los géneros se
encuentra en las tablas de análisis de
muestras (ver tablas de análisis de
muestra)
En cuanto a los cultivos que son
afectados por las enfermedades
encontramos.
 Tabla 1. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Observación de Colletortichum spp
Observaciones
Figura 1. Aislamiento de Colletotrichum en
fresa, tomado por (Barrantes 2015)
Figura 2. Agrupación de conidios fusiformes
(tomado por Alarcón, 2015)
Figura 3. forma fusiformes de conidios
encontrados en Colletotrichum (tomado por
Alarcón, 2015)
Luego del aislamiento del hongo
Colletortichum sp, (Identificado por los
síntomas en el fruto y formas de
colonia) a través de los explantes de
fruto en papa dextrosa agar (PDA), (ver
figura 1) , en los que se forman colonias
blancas, variando a gris salmón, se
realizaron improntas para ver las
estructuras de los hongos y confirmación
la identificación del hongo.
Agrupación de conidios
La producción de conidios es
característicamente abundante y
muestran en masa un color salmón-
anaranjado (Farrera , Zambrano, & Ortiz ,
2007) (Cordero, Muñoz, Onorato, &
Contreras), lo que se puede corroborar
con lo observado en el microscopio a 40
x (Ver figura 2)
Conidios lisos, unicelulares, aseptados,
fusiformes y de aproximadamente 10-14
x 4- µm. (Cedeño & Carrero, 2000),
conidios que se pudieron observar en la
impronta del micelio de Colletotrichum,
además de confirmar la forma fusiforme
de sus conidios a través del microscopio
a 40 x, además de la observación de la
posible formación de un haustorio (ver
figura 3)
Por lo anterior y según la literatura se
confirma que el aislamiento realizado del
hongo pertenece al género Colletotrichum
Formación de haustorios
Hifas sin septos, presencia de poros
 Tabla2. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Fresa (Fragaria ananassa) - Xanthomonas sp.
Fotografía Observaciones

Se puede observar en la figura 4

manchas irregulares, necróticas en el
follaje de la planta de un color café a rojizo
oscuro. Por lo general localizadas al
borde de las hojas (foliolos).

Según lo observado corresponde a

síntomas provocados por Xanthomonas,
en fresa la enfermedad es “bacterial leaf
blight” o en español “tizón bacteriano”.
Siendo sus síntomas manchas foliares
necróticas de color café (secas) (Figura 1)
y lesiones grandes en forma de “V” a lo
largo del borde de la hoja (Ustun et al.,
2007).
Figura 4, daño provocado por
Aún no se tiene información disponible
Xanthomonas spp, en foliolos de fresa
sobre las vías de diseminación de la
(Atuesta 2015). enfermedad, sin embargo la diseminación
a grandes distancias ocurre con la
movilización de material propagativo
entre países. (EPPO, 2011).

En la caja Petri con el medio nutritivo se

observa el crecimiento de las colonias de
la bacterias Xanthomonas sp, identificada
anteriormente gracias a las rutas
taxonómicas de la enfermedad y la forma
de la colonia, (ver figura 5) a las cuales
se les hicieron una impronta para
observar sus estructuras al microscopio.

Figura 5, medio de cultivo nutritivo con

crecimiento de colonias de Xanthomonas
sp, para realizar las improntas en el
microscopio. (Atuesta 2015).
Observación en el microscopio
Figura 6, Xanthomonas sp observadas al
microscopio en 40x por medio de una
impronta al medio de cultivo anteriormente
mencionado (Atuesta, 2015).
Figura 7, Micrografía de
Xanthomonas arborícola pv.
fragariae, que muestra la forma de
bacilo de la bacteria y su flagelo
polar. (Fuente: Janse et al., 2001).
Se observa en la figura 6 la gran cantidad
de bacilos pertenecientes al género de
Xanthomonas que aunque sin aplicar
ningún tipo de colorante para hacer
tinción muestran una coloración entre
amarilla y rojiza vista al microscopio en el
objetivo 40x.
Posición Taxonómica:
Dominio: Bacteria.
Phylum: Proteobacteria.
Clase: Grammaproteobacteria.
Orden: Xanthomonadales.
Familia: Xanthomonadaceae.
Género: Xanthomonas.
(CAB International, 2011).
Según BACMAP Genome Atlas, las
Xanthomonadaceae son una familia de
bacterias Gram negativas pertenecientes
a los Xanthomonadales orden del
Grammaproteobacteria. Por lo general se
caracterizan como organismos
ambientales que se encuentran en el
suelo y el agua, así como en tejidos
vegetales. Son Bacilos en forma de
bastones rectos que pueden llegar a
medir 0.4 a 1.0 x 1.2 a 3 um.
Se han reportado observaciones hechas
al microscopio y lo que se ha podido
observar son bacterias en forma de
bacilos con un flagelo polar la cual es una
característica propia del genero de las
Xanthomonas (Janse et al., 2001).
(Figura 7).
También se ha observado que este tipo
de bacterias tiene un tipo de
pigmentación basado en carotenos
llamados “Xanthomonadins”, estos
pigmentos son bromados y compuestos
por un grupo arilo-polieno los cuales, son
compuestos orgánicos que componen
conjugados como los carotenos, en este
caso amarillos, insolubles en agua y que
están asociados a la membrana externa
de la pared celular de las bacterias.
Estos pigmentos son marcadores
 quimiotaxonómicos útiles para la
identificación de estas bacterias, según
sus características, por medio de
diferencias y similitudes de sus
componentes bioquímicos. La
producción de Xanthomonadins, es una
característica principal de las
Xanthomonas spp. (American Physical
Society, 2002).

Entre las especies de este género hay

grandes similitudes, se ha reportado que
en 1993 se llegó a confundir algunas
cepas de Xanthomonas arboricola pv.
fragariae fueron identificadas como
Xanthomonas fragariae (Janse et al.,
2001; Weller et al., 2007).

Tabla 3. ANÁLISIS DE MUESTRAS

1. Fresa (Fragaria ananassa) - Sphaerotheca pannosa
Fotografía Observaciones
Se observan en la Figura 8
principalmente manchas de color café
necróticas en las hojas de fresa. Aunque
también las manchas se pueden observar
en algunas partes localizadas de toda la
planta, también se observan manchones
blancos, amarillos crema o grisáceos de
forma continúa.

Según lo observado corresponde a

lesiones provocadas por el hongo Mildeo
polvoso (Sphaerotheca pannosa), que
causa manchas polvorientas en un
principio blancas, amarillas color crema
y en el transcurso que se manifiesta mas
la enfermedad comienzan a tornarse
colores cafés o grises muy oscuros en la
planta de fresa (Villate, 2014).

Posición taxonómica de Sphaerotheca

Figura 8. Ataque de Sphaerotheca pannosa más conocido como Mildeo
pannosa, en los hojas de fresa Polvoso
(Calderón, 2015).
Reino: Fungí
División: Ascomycota
Clase: Leotiomycetes
Orden: Erysiphales
Familia: Erysiphaceae

Figura 9, observación de Sphaerotheca
pannosa, en medio de cultivo PDA
(Calderón, 2015).
Morfología microscópica del hongo Sphaerotheca pannosa
Figura 10. Morfología microscópica
de Sphaerotheca pannosa.
(Calderón, 2015).
Género: Sphaeroteca
Especie: Sphaerotheca pannosa
(Bayer, 2014).
Se observa la caja Petri con el medio PDA
( ver figura 9) este medio incluye dextrosa
e infusión de papa blanca (Solanum
tuberosum), haciendo que los hongos
crezcan más y se reproduzcan fácilmente
(Pérez, 2012). Con la muestra de
Sphaerotheca pannosa conocido como
Mildeo polvoso en este se observa el
crecimiento del hongo, su apariencia fue
algodonosa color blanca y color amarillo
crema.
Se puede observar el crecimiento del
hongo, Mildeo polvoso (Sphaerotheca
pannosa), donde se observa el micelio un
poco algodonoso, con una superficie
pareja y un borde liso. (ver figura 9)
En la impronta se observan Hifas que son
estructuras filamentosas cilíndricas, (ver
figura 10), que son característica principal
de los hongos de tipo vegetativo, donde
la reunión de estas hifas forma el micelio
(Rodríguez, 2014)
 Tabla 4. ANÁLISIS DE MUESTRAS
1. Fusarium oxysporum
Generalidad

Fusarium oxysporum es un hongo

cosmopolita que existe en muchas
formas patogénicas, parasitando
más de 100 especies de plantas
Gimnospermas y Angiospermas,
gracias a los diversos mecanismos
que tiene el hongo para vencer las
defensas de muchas plantas. Se
caracteriza por producir colonias de
rápido crecimiento, con una tasa
diaria cercana a un centímetro en
medio papa- dextrosa agar (PDA) a
25ºC (Garcés et al., 2001)

Se presenta principalmente como

saprófito en el suelo, o también como
patógeno especializado,
denominado forma especial (f. sp.),
según la planta hospedante u
hospedantes relacionados que
afecte. Es posible distinguir patotipos
o razas fisiológicas de una misma
forma especial (Bosland, 1988)

Esta enfermedad es la más limitante

y la más importante en el cultivo del
clavel en Colombia (Figura 11),
debido a la fácil propagación del
patógeno a través de esquejes
infectados, a la resistencia del hongo
a condiciones adversas y al alto
costo y relativa baja eficiencia de las
medidas de control utilizadas
(Garcés et al., 2001)
Figura 11. Ataque de Fusarium
oxysporum, en tallo de clavel.
2. Fusarium oxysporum en cultivo PDA
Observaciones

En el medio de cultivo PDA (Figura 12),

se observó un crecimiento micelial
aéreo, su apariencia fue algodonosa, de
coloración entre blanco a rosado
salmón.
También se puede observar que el
crecimiento que tuvo fue concéntrico
(Booth, 1970)

Figura 12. Cultivo de Fusarium

oxysporum, en medio de cultivo
PDA.
3. Morfología microscópica de Fusarium oxysporum. Azul lactofenol, 40x.
Observaciones

Se observan hifas ramificadas

hialinas y septadas, (ver figura 13)
clamidosporas hialinas esféricas y
grandes corroborado por (Amaro,
2014).

Se observan macroconidios, en
forma elipsoidal, hialinos y septados
(C., 2011).

Figura 13. Morfología

microscópica de Fusarium
oxysporum. Azul lactofenol, 40x.
 Tabla 5. ANÁLISIS DE MUESTRAS
 Aislamiento de hojas de fresa
Observaciones

De acuerdo con las caracteristicas del

sintoma y de micelio, presentado en
informes anteriores, esta muestra se
habia identificado como mildiu en fresa.
Pero observando las estructuras vistas
se puede determinar que posiblemente
es Phytophthora fragrarie. Dado que:

1. Según la autora (Echemedina,

2004) En los medios de cultivo el
micelio se presenta aéreo, el cual
puede ser marcadamente
radiado o ligeramente estrellado,
presentándose los bordes de la
colonia redondeados o sinuosos
y sumergido en el medio siendo.
(ver figura 14 ).
Figura 14: aislamiento de hoja enferma de
fresa (Alarcon, 2015)

2. Muestra del micelio visto al microscopio

El autor (Bolda, 2010) menciona que las
hifas no son septadas, además de ser
hialinas. (Ver figura 15).

Todas las especies del género poseen

un micelio hialino, continuo, de paredes
paralelas o irregularmente calibradas,
donde pueden observarse abundantes
gotas oleaginosas. El micelio es
cenocítico, observándose solo
raramente la presencia de algunos
tabiques que normalmente se
encuentran separando las partes viejas
carentes de protoplasma. (Echemedina,
2004).

Figura 15: hifas de Phytophthora fragrarie.

(Bolda, 2010)
 3. Morfología microscópica. Azul lactofenol, 40x.
Figura 16: hifas de Phytophthora fragrarie.
(Ortiz, 2015)
Conclusiones:
 Gracias a la observación de los
signos, la planta y la parte de la
planta que está afectada por el
patógeno, y las rutas taxonómicas
para identificar la enfermedad, se
puede dar un estimado del
patógeno que está atacando, pero
en muchos casos estos se
parecen, hasta el punto de tejer la
misma forma y color de la colonia,
por eso es indispensable
complementar estas labores con
la observación de las estructuras
de los hongos y bacterias al
microscopio, logrando así realizar
una mejor identificación del
patógeno casi llegando al géneros
a los que pertenece.
 Para lograr una buena
observación de las estructuras
tanto de hongos como de
bacterias, es necesario realizar
Observaciones
En esta grafica se puede observar que
las hifas no presentan septos. No se
pudo observar otras estructuras del
hongo (ver figura 16)razón por la cual no
se pude dar afirmar la especie de hongo
que sea aunque se supone que por la
apariencia sea Phytophthora fragrarie
tinciones, de acuerdo al tipo de
organismo que se quiera observar
y hasta donde se quiera llegar a
identificar, como es el caso de la
tinción de gran, utilizada para la
clasificación de bacterias gran
positivas y gran negativas,
practicas indispensables para la
identificación del patógeno.
Bibliografía
Alarcon, K. 2015. Fotografias de la
practica de laboatorio 5 de
fitopatologia de la universidad
de Cundinamarca. Facatativá.
Amaro, C. T. 2014. Genero Fusarium.
Retrato Microbiológico, 85 - 86.
APS. 2002. Xanthomonadins, Unique
Yellow Pigments of the Genus
Xanthomonas.
The Plant Health Instructor.
University of Idaho, Moscow. En
línea:
http://www.apsnet.org/edcenter/a
 dvanced/topics/Pages/Xanthomo
nadins.aspx.
Bayer cropscience. 2014. Problemas
biologicos. Mildeo. Laboratorios Bayer
Centro
América y del Caribe. En línea
http://www.bayercropscience-
ca.com/contenido.php?id=241&
cod_afeccion=51
Bolda, M. 29 de Abril de 2010. Fresas
y moras. Obtenido de Lluvias
primaverales fomentan
pudrición de Phytophthora de
la fruta de fresa en Watsonville
y Salinas:
http://ucanr.edu/blogs/fresamor
a/index.cfm?tagname=Phytoph
thora
Booth, C. 1970. Fusarium oxysporum
CMI descriptions of plant
pathogenic fungi and bacteria.
Commonwealth Agricultural
Bureaux, 211.
Bosland, P. W. 1988. Fusarium
oxysporum a pathogen of
many plant species. Advances
in plant pathology, 281 - 289.
CAB International. 2011. Crop
Protection Compendium, 2011 Edition.
Wallingford,
UK: CAB International. En
línea: http://www.cabi.org/cpc.
Cedeño, l., & Carrero, C. 2000. Primer
reporte en Venezuela de
Colletotrichum acutatum
causando antracnosis en frutos
de fresa. Venezuela.
Cordero, F. T., Muñoz, F. R.,
Onorato, J. M., & Contreras, A.
S. (n.d.). Antracnosis en fresa:
Sintomatología y desarrollo de
la infección . Universidad de
Sevilla.
C., V. T. 2011. Fusarium spp. Escuela
de Microbiología, Universidad de
Antioquia.
Echemedina, Y. 2004. FAO. Obtenido
de Phytophthora:
Características, diagnóstico y
daños que:
http://www.fao.org/docs/eims/u
pload/cuba/1060/cuf0022s.pdf
Emira Garcés De Granada., M. O.
(Julio de 2001). Fusarium
oxysporum, el hongo que nos
falta conocer. Acta Biológica
Colombiana, 6, 8-25.
EPPO. 2011. Xanthomonas arboricola
pv. fragariae. Bacterial leaf blight –A
new
disease of strawberry. En línea:
http://www.eppo.org/QUARAN
TINE/Alert_List/bacteria/XANT
AF.htm.
Farrera , P., Zambrano, V., & Ortiz ,
M. 2007. Identificación de
hongos asociados a
enfermedades del fruto de la
fresa en el municipio Jáuregui
del estado Táchira. Tachira:
Scielo.
López , L., Hernández, M., Colín, C.,
& Cendejas, R. 2013. Las
tinciones básicas en el
laboratorio de microbiologia .
Mexico: Laboratorio de
Infectología, Centro Nacional
de Investigación y Atención a
Quemados.
Ortiz, C. 2015. Fotografias de la interna/infectologia/docs/micolo
practica de laboratorio 5 de gia.pdf
fitopatologia de la Universida
de Cundinamarca. Facatativá. Villate Paola, 2014, Mildeo polvoso.
Presentación prezi. En línea:
https://prezi.com/mrbbr8886giu
Pérez Yago, 2012, Medio de cultivo /mildeo-polvoso/
para hongos: Agar PDA.. Blog
naturaleza
España. En Línea:
http://www.blog.naturaleza.eldi
etista.es/2012/01/medio-de-
cultivo-para-hongos.html

Rodríguez Gloria, 2014, Micología.

Unidad De infectologia. Universidad
de la
Frontera Chile.. En línea:
http://www.med.ufro.cl/clases_
apuntes/medicina