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Bio Cat A Liz Adores Della Bala Industria
Bio Cat A Liz Adores Della Bala Industria
https://www.facebook.com/pages/Interfase-
IQ/146073555478947?ref=bookmarks
Rector
Gustavo Eduardo Lugones
Vicerrector
Mario E. Lozano
Biocatalizadores.
Del laboratorio a la industria
Elizabeth Lewkowicz
(compiladora)
Bernal, 2011
Colección Nuevos enfoques en ciencia y tecnología
Dirigida por Florencia M. Rembado
ISBN 978-987-558-221-7
ISBN: 978-987-558-221-7
Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723
ÍNDICE
Los autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Agradecimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
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Paola Panizza, Cátedra de Microbiología, Departamento de Biociencias,
Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay;
<ppanizza@fq.edu.uy>.
Sonia Rodríguez, Cátedra de Microbiología, Departamento de Biocien-
cias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay; <soniar@fq.edu.uy>.
José María Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones (btg), De-
partamento de Química Orgánica y Farmacéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad Complutense de Madrid, España; <jsanchez@farm.ucm.es>.
10 | LOS AUTORES
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar a los autores de los capítulos que conforman esta obra
por su disposición a participar en la difusión de la biocatálisis entre
los miembros de la comunidad científica de habla hispana y su siem-
pre amable colaboración en todos los emprendimientos que venimos
llevando a cabo para hacer importante esta poco conocida rama de la
ciencia.
A la Universidad Nacional de Quilmes por darnos el espacio y el
apoyo necesarios para que el Laboratorio de Biocatálisis pueda crecer
día a día.
A las entidades nacionales (Conicet, anpcyt, etc.) e internacionales
que subsidian nuestras investigaciones.
A todos los integrantes del Laboratorio de Biocatálisis por su esfuer-
zo y su dedicación y por crear un ámbito maravilloso de trabajo.
Al doctor Adolfo Iribarren, alma máter del grupo, por su fuerza para
llevarlo adelante, por compartir el cariño por la ciencia y principalmen-
te por su calidez humana y su apoyo incondicional.
Y finalmente a mi familia, Roberto, Florencia y Vanesa, por estar
siempre a mi lado, por entender y soportar las tardanzas, las ausencias y
las preocupaciones que involucra el trabajo científico y por ser las per-
sonas maravillosas con las que amo compartir la vida.
Elizabeth Lewkowicz
| 11
PRÓLOGO
Elizabeth Lewkowicz
| 13
En el capítulo 1 se puede hallar un panorama general de los dis-
tintos tipos de biocatalizadores, de sus usos y sus fuentes y también de
las diversas técnicas de screening y selección que permiten una rápida
identificación de actividades enzimáticas con propiedades adecuadas
para su aplicación en biocatálisis. En el capítulo 2 se presenta un aná-
lisis particularmente detallado del uso de catalizadores de origen vege-
tal, de sus diversas formas y de sus múltiples aplicaciones, que ofrecen
alternativas únicas frente a otros sistemas.
En la naturaleza los biocatalizadores desarrollan su actividad óptima en
entornos acuosos y ambientes con pH neutro, temperaturas por debajo de
40 °C y presión osmótica baja. A la hora de optimizar una reacción, estas
condiciones pueden resultar una complicación en cuanto a la relación es-
pacio-tiempo-rendimiento o bien para obtener una alta concentración
de producto a fin de facilitar el procesamiento posterior. Por ese moti-
vo existe una búsqueda continua de condiciones alternativas que permi-
tan lograr mejoras respecto de la solubilidad del sustrato, la selectividad,
el rendimiento y la estabilidad del biocatalizador. El uso de medios no
convencionales de reacción fue uno de los grandes hitos de la biocatálisis
durante el siglo xx. Si bien los solventes orgánicos fueron los compuestos
más utilizados, en los últimos años se han desarrollado medios más favo-
rables en términos ambientales, los que se describen en el capítulo 3. Más
recientemente la ingeniería de proteínas ha añadido nuevas y potentes
herramientas para el desarrollo de mejores biocatalizadores. En el capítu-
lo 4 se explica la forma de mejorar los procesos biocatalizados mediante
el uso de enzimas fácilmente accesibles en cantidad y con propiedades
que puedan ser modificadas a demanda. La bioinformática también ha
contribuido a este propósito. El modelado molecular constituye una he-
rramienta de gran utilidad pues permite interpretar de manera racional
los procesos biocatalizados, como se describe en el capítulo 5.
Finalmente, todos los avances mencionados han confluido para favorecer
la transformación del proceso biocatalizado desarrollado en el laboratorio
en un proceso industrial. En los capítulos 6 y 7 se analizan los requeri-
mientos, las características y las motivaciones, junto a diversos ejemplos,
para diseñar procesos industriales biocatalíticos rentables y sostenibles.
Esta obra, dirigida a un público interdisciplinario y de habla caste-
llana, ha sido diseñada como libro de texto para cursos de pregrado y
posgrado sobre biocatálisis y temáticas relacionadas, aunque también se
espera que sea de interés para todos los que trabajan en este campo.
14 | PRÓLOGO
CAPÍTULO 1
Fuentes de biocatalizadores
Elizabeth Lewkowicz y Daniela Gamenara
INTRODUCCIÓN
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más significativas consisten en que los procesos pueden tener baja pro-
ductividad debido a la potencial toxicidad celular de los sustratos o al
gran volumen de biomasa que suele dificultar la recuperación de los
productos. En el caso de sustratos o productos quirales el transporte
hacia la célula y desde ella puede influir en la especificidad de la reac-
ción global y determinar que los procesos sean menos eficientes. Otro
problema frecuente en los procesos biocatalizados por células enteras
es su baja selectividad, que puede deberse a: 1) que ambos estereoisó-
meros sean sustratos de una misma enzima y que el proceso transcurra
a través de estados de transición con valores similares de energía libre
para ambos estereoisómeros y 2) que dos enzimas con preferencias es-
tereoquímicas opuestas compitan por el mismo sustrato. En este caso
la pureza óptica de los productos está determinada por las velocidades
relativas de las reacciones individuales.
Trabajar con enzimas aisladas tiene la ventaja de que se pueden de-
sarrollar procesos altamente eficientes y selectivos y eliminar reacciones
competitivas catalizadas por otras enzimas del sistema. Por otra parte,
el aislamiento de los productos de biotransformación suele ser sencillo,
en particular si se trabaja con enzimas inmovilizadas. Los reactores pue-
den ser más pequeños que los requeridos en procesos de fermentación
y la posibilidad de reutilizar el biocatalizador permite diseñar procesos
continuos con una mejora de su productividad y su eficacia. Las des-
ventajas más significativas del uso de enzimas aisladas son la necesidad
que existe en algunos casos de incorporar cofactores al sistema y rege-
nerarlos adecuadamente así como el elevado costo tanto de las enzimas
como de los cofactores mismos. El uso de enzimas aisladas también es
limitado, porque estas enzimas pueden inactivarse fácilmente al carecer
del “entorno protector” de la célula. El costo de un proceso enzimático
debe reducirse utilizando enzimas más estables, sin perder la actividad
de la enzima original. El proceso enzimático está directamente vincu-
lado con los procesos de producción y purificación de la enzima y estos
deben diseñarse de un modo que permita obtener enzimas estables y con
alto grado de pureza, lo que reducirá los costos de producción. Lo pri-
mero que debe hacerse para lograr ese objetivo es encontrar una fuente
adecuada de la enzima. Las fuentes naturales (tejidos de origen animal
y de plantas superiores y cepas naturales de microorganismos) por lo
general producen cantidades insuficientes de cada enzima por lo que el
paso que sigue a la obtención de una enzima a partir de cepas natura-
1
<http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/fcnNavigation.cfm?rpt=grasListing>.
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 17
papaya, Carica candamarcensis), también tienen importancia industrial
y representan el 5% del mercado (Baladrin et al., 1985; Uhlig, 1998).
Otras enzimas, como la invertasa (Pressi et al., 2003), la proteasa neutra
(Cimino et al., 2006) y la fosfatasa ácida (Su y Arias, 2003), son pro-
ducidas in vitro en cultivos de células vegetales mediante procesos de
gran complejidad y de costo elevado por lo que su utilización a nivel
industrial es limitada (Chu y Robinson, 2001). Algunas glicoenzimas
(glutamina sintetasa) se producen también in vitro en cultivos de líneas
celulares de origen animal (Barnes et al., 2000).
Si bien los orígenes de los biocatalizadores son muy diversos, los
microorganismos constituyen una fuente muy rica y el uso de micro-
organismos o enzimas microbianas como biocatalizadores es por lejos
el más descrito en la bibliografía. Las enzimas microbianas han reem-
plazado a las de otros orígenes desde la década de 1960 y hoy en día
representan más del 90% del mercado total (Illanes, 2008). En la ac-
tualidad, uno de los objetivos más importantes de la biocatálisis es la
explotación de la diversidad microbiana en busca de otras enzimas con
actividades novedosas, complementada con el diseño racional de enzi-
mas y su producción y sobreexpresión en huéspedes microbianos me-
diante técnicas de ingeniería genética (Beloqui et al., 2008).
Animales y plantas
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 19
Las cepas salvajes de microorganismos también se utilizan cuando
se quieren buscar enzimas “nuevas” que puedan catalizar la conversión
o la degradación de un compuesto determinado.
En catálisis enzimática habitualmente se utilizan levaduras, hongos y
bacterias, que constituyen las fuentes de biocatalizadores más usadas con
fines de síntesis tanto en la industria química como en la alimentaria.
Levaduras
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 21
al., 2008), transesterificación (Chojnacka et al., 2007; Devaux-Bas-
séguy et al., 1997; Domínguez de María et al., 2005; Domínguez de
María et al., 2006b), N-acilación (Domínguez de María et al., 2005;
Gotor Fernández et al., 2006a; Gotor Fernández et al., 2006b), alco-
hólisis (Capello et al., 2007), aminólisis y amonólisis (López García
et al., 2003), epoxidación y apertura de epóxidos (Kroutil y Faber,
2000; Orellana-Coca et al., 2007), reacciones de Baeyer y Villiger
(Ten Brink et al., 2004), etc. Las lipasas tienen la ventaja de que no
necesitan cofactores y es sencillo utilizarlas como enzimas aisladas.
El hecho de que sean extracelulares facilita su purificación y hay una
gran variedad de lipasas comerciales disponibles. Las principales leva-
duras productoras de lipasas pertenecen a los géneros Candida (rugosa,
antarctica), Geotrichum (candidum, asteroides), Trichosporon, Yarrowia
(lipolytica) y Kluyveromyces. Su utilización en biotecnología, en las
industrias farmacéutica y agroquímica, en el tratamiento de los resi-
duos y en las industrias alimentaria y del cuero se lleva a cabo tanto
con el microorganismo en crecimiento (fermentación) como con las
células en reposo o utilizando las enzimas aisladas con diferente gra-
do de purificación.
Las epóxido hidrolasas también tienen un potencial sintético im-
portante puesto que catalizan la apertura de epóxidos en forma enan-
tioselectiva y regioselectiva. No requieren cofactores y se puede trabajar
fácilmente con la enzima aislada –los preparados enzimáticos liofiliza-
dos son muy estables– o con la célula entera. Las principales levaduras
productoras de epóxido hidrolasas pertenecen a los géneros Rhodotorula
y Rhodosporidium. Estas enzimas aceptan una gran diversidad estruc-
tural de sustratos, entre ellos epóxidos con impedimento estérico. Al
igual que las lipasas, las enzimas aisladas son muy útiles para trabajar en
sistemas bifásicos y en biotransformaciones con células enteras pueden
utilizarse disolventes orgánicos. Otro aspecto que debe considerarse es
que las epóxido hidrolasas de diferentes microorganismos pueden te-
ner enantioselectividades o regioselectividades complementarias por lo
que constituyen una potente herramienta sintética.
La formación de enlaces C-C es un objetivo sintético fundamental
para la química orgánica. Un ejemplo de utilización de liasas de levadu-
ras en síntesis de intermedios farmacéuticos es el descrito por Kostraby
(Kostraby et al., 2002). El objetivo es la producción de l-fenilacetilcar-
binol (l-pac), un intermediario en la síntesis de drogas vasodepreso-
Hongos
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 23
tienen gran utilidad en síntesis. Se han descrito reacciones de Baeyer y
Villiger catalizadas por monooxigenasas fúngicas (Fantin et al., 2006),
reacciones de epoxidación (Dembitzky, 2003), sulfoxidaciones (Fernán-
dez y Khiar, 2003), hidroxilaciones (Kinne et al., 2009) y oxidaciones
(Bastos Borges et al., 2009), tanto con células enteras en fermentación
o en reposo como con enzimas aisladas. Las lacasas de origen fúngico
también se destacan en reacciones de oxidación y acoplamiento (Go-
chev y Krastanov, 2007).
Las reacciones catalizadas por hidrolasas fúngicas están menos des-
critas que las reacciones de oxidación-reducción; básicamente se trata de
reacciones de hidrólisis o transesterificación que se llevan a cabo tanto
con enzimas aisladas como con células enteras en reposo (Hernández
Rodríguez et al., 2009; Méndez et al., 2007).
Bacterias
Microorganismos recombinantes
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 25
los clones se sobreexpresan en microorganismos huéspedes que aportan
el sistema de cofactores necesarios sin necesidad de incorporarlos en
cantidades estequiométricas o de desarrollar técnicas eficaces para su
reciclado.
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 27
Junto con el crecimiento del interés por la biocatálisis preparativa
se fueron estableciendo fuentes de provisión de biocatalizadores tanto
públicas como privadas, lo que condujo a una mayor accesibilidad y por
consiguiente a una reducción de los costos.
FUENTES DE BIOCATALIZADORES
Fuentes de enzimas
Fuentes de microorganismos
Colecciones
ncimb National Culture of Industrial and Marine Bacteria Aberdeen, Reino Unido
Ambientes naturales
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tir un tipo determinado de microorganismos. Así, por ejemplo, a partir
de residuos alcalinos de industrias procesadoras de papa y fruta se han
aislado microorganismos alcalófilos productores de amilasas (Gee et al.,
1980) mientras que de suelos tratados con compuestos organofosfora-
dos en Filipinas se obtuvieron bacterias que contenían fosfotriesterasas
(Zhongli et al., 2001).
b. Cultivo enriquecido. Se manipulan las condiciones de cultivo de
manera que puedan crecer y sobrevivir microorganismos que expresen
una enzima determinada. Para ello se cultivan en un medio muy rico
microorganismos provenientes de un medio natural propicio para de-
terminada actividad enzimática y luego se los somete a un medio míni-
mo que contenga como única fuente de carbono el sustrato de interés.
Williams y col. (Vickers et al., 1984) usaron una combinación de ami-
noácidos e hidratos de carbono con antibióticos y sin ellos para favore-
cer el crecimiento de una especie no común de estreptomicetos. Estos
microorganismos son fuentes promisorias de metabolitos con actividad
antibiótica. Asano y col. (Asano, 2002) utilizaron esta técnica para ais-
lar las cepas R. rhodochrous J1 y P. chlororaphis B23, específicas para la
degradación de acetonitrilo e isobutironitrilo, respectivamente.
c. Aclimatación. El uso de sustratos tóxicos o no naturales puede
extender en gran medida los tiempos de análisis mediante la técnica
de cultivo enriquecido. Como alternativa se puede inducir la adapta-
ción de microorganismos a medios sintéticos que contengan el sus-
trato de interés. Los microorganismos que se pueden aislar, llamados
extraquimófilos (como una clase especial de los extremófilos, o sea es-
pecies que viven en ambientes extremos), en general presentan cam-
bios genéticos y por consiguiente pueden descubrirse nuevas enzimas a
partir de ellos (Asano, 1996). La enzima d-aminoácido amidasa fue
aislada de la cepa Ochrobactrum anthropi SV3, obtenida de una mues-
tra de suelo aclimatada por tres meses a un medio que contenía d-va-
linamida (Asano et al., 1989).
Metagenómica
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 31
Por otro lado, encontrar una nueva enzima significa encontrar una
nueva función microbiana. En ese sentido, las técnicas de screening clási-
cas son herramientas potentes porque involucran células vivas que man-
tienen sus funciones originales. Sin embargo, la combinación con las
nuevas tecnologías (biblioteca de genes, técnicas de evolución dirigida,
entre otras) ofrece interesantes posibilidades cuando lo que se requiere
es modificar enzimas de actividad conocida (Ogawa y Shimizu, 1999).
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 33
La reducción enzimática de 4-cloroacetoacetato de etilo a 4-cloro-3-
hidroxibutanoato de etilo suele ser estereoespecífica. Esta actividad se
distribuye en forma amplia en las levaduras, los hongos y las bacterias
para dar generalmente el enantiómero S. En el caso particular de C.
magnoliae se ha demostrado su cualidad de excelente productor de
una enzima que genera dicho enantiómero. Sin embargo, a través
de un screening se comprobó que S. salmonicolor, Micrococcus luteus y
Cellulomonas sp. producen en forma predominante el enantiómero R
con alta conversión molar. La aldehído reductasa de S. salmonicolor ha
sido clonada, modificada y expresada en E. coli para la obtención de
4-cloro-3-hidroxibutanoato de etilo, producto intermedio en la síntesis
industrial de L-carnitina (Kita et al., 1996).
Métodos de screening
Screening jerárquico
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 35
realizar estudios de evolución dirigida se desarrollaron diversos hts con
el propósito de superar las limitaciones de las enzimas naturales sobre
diferentes sustratos, como el descrito para el polímero vegetal guar, uti-
lizado como aditivo en la industria del papel (Delagrave et al., 2001).
Ensayos de detección
CONCLUSIONES
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 37
llo de técnicas de detección que permitan analizar un gran número
de muestras en forma simultánea. Se trata de un problema multidis-
ciplinario que requiere los conocimientos de químicos, ingenieros y
microbiólogos.
La búsqueda de nuevos biocatalizadores es un desafío importante
para la biotecnología. Cabe esperar que los avances en las áreas de in-
geniería genética y de proteínas tengan una repercusión sustancial so-
bre la generación de nuevos sistemas, si bien por ahora ese progreso se
ve sobre todo a nivel de la optimización del producto.
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FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 39
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INTRODUCCIÓN
| 47
Afortunadamente, muchos catalizadores de origen vegetal exhiben una
amplia tolerancia de sustratos, aceptan una considerable cantidad de
compuestos xenobióticos y conservan en buen grado su quimio-, regio-
y enantioselectividad.
Durante décadas, los químicos han usufructuado esas caracterís-
ticas para realizar biotransformaciones de productos naturales, sobre
todo con cultivos celulares, mediante la incorporación como sustratos
de moléculas de diverso origen biogenético. En algunos casos se han
transformado intermediarios de rutas biosintéticas propias de la espe-
cie en cuestión para que fueran “metabolizados” a compuestos termina-
les de esas vías o incluso para generar compuestos novedosos. En este
sentido, los estudios de biotransformación han permitido interpretar
interacciones alelopáticas.
A pesar de que los químicos se sienten atraídos por las ventajas me-
todológicas que representa el uso de enzimas aisladas y de sistemas de
reciclado de cofactores, para muchas enzimas estas herramientas todavía
se encuentran en los comienzos de su desarrollo. Como consecuencia,
el uso de microorganismos sigue cobrando importancia, al igual que el
de catalizadores de origen vegetal, como una fuente alternativa de en-
zimas. Estas últimas pueden provenir del empleo de material obtenido
de plantas silvestres o cultivadas, de órganos específicos desarrollados
in vitro o de células indiferenciadas.
O OH
S S
L L
O OH
N3 D. carota N3
c: 99%, ee: 99%
RO H2O, Tamb. RO
H2 (Pd/C)
MeOH, Tamb
OH
NH2
RO
O 50% NaOHaq /Cl 2CH2
R1 Cl tolueno 5-10ºC
OH H OH H
N N
MeO O MeO O
Tembamida Aegelina
OH H
N OMe
HO O OMe
Denopamina
O OH OH
D. carota
+
H2O, Tamb.
R O R O R O
(+/-) (-)-2S,4S (+)-2R,4S
R= aril o alquil
OH O OH
Biooxidación + *
R R R
Biorreducción
Carbonil reductasas
OR
OR
OH OH OH
OH
N. tabacum N. tabacum
OH
OH OH OH
α y β-terpineol γ -terpineol
Monooxigenasa OH
O
OH
O O
Digitalis lanata
OH
HO
H
Strophanthus intermedius
OH HO OH
OH
O O
D. carota
N. tabacum
O O
G. augusta
OH OH HO
Enoato reductasas
O OH
OR' D. carota OR'
O O
R R
c: 100%; ee: 92-99%
Glicosidaciones
O Medicago sativa O
Glycine max
Vinca minor
Catharanthus roseus
Marchantia polimorfa
R R
N. tabacum
O M. sativa O
O O O O
R M. polimorfa R
N N (R/S)-carvona
O O O O
R1 R1
CH 2 OH CH 2 OH O OH
C. roseus C. roseus
HO
CH 2 OH
Geraniol (-)-carvona
OH OH
O HO O
HO O OH
HO HO
OH O
O COOH
O
OH
HO O Esterificaciones
HO O con raíces de OH
OH OH
O Panax ginseng OH
HO O O OH
HO OH OH
O O
OH OH OH OH
HO HO O HO O
G. jasminoides O O
HO HO
OH OH
HO
OH
HO HO O
G. jasminoides O
HO
HO O OH
O
HO O O
OH
O O OH
O OH HO O
HO HO
OH
C. sativus O OH
O OH
OH HO
HO O
HO OH
OH HO O
OH O O OH
HO O
HO
OH
O OH
HO
OH
Infección con
A. rhizogenes
Plántula Clon de RT
Medio de cultivo
HO HO MeO CH2O-Glc
Alcohol vainillínico
HO
RT de Pharbitis nil
OH
OH
O
O
17β-hidroxiandrost-4-ene-3-ona OH
18 O O 6a,17β-dihidroxiandrost-4-ene-3-ona
19 Anisodus
tanguticus RT
O
HO
Androst-4-ene-3,17-diona O
Dehidroepiandrosterona C-19 O
O
O
O Androst-4-ene-3,6,17-triona
OH
6α-hidroxiandrost-4-ene-3,17-diona
O O OH O
RT de B. Napus
O O
c: 78%
ee: 99% (S)
BIBLIOGRAFÍA
Biocatálisis en medios
no convencionales
Adolfo M. Iribarren
INTRODUCCIÓN
| 77
La rama más analizada involucra el uso de solventes orgánicos pero
esa temática no será abordada en este capítulo porque se la trata en
forma inclusiva a lo largo de todo el libro.
Aquí nos concentraremos en la realización de una breve reseña de
los fundamentos y las aplicaciones de otros medios no convencionales
como los líquidos iónicos, los solventes con eutécticos profundos y los
solventes supercríticos.
LÍQUIDOS IÓNICOS
Generalidades
78 | ADOLFO M. IRIBARREN
FIGURA 1. Cationes y aniones más utilizados en líquidos iónicos
R2
R1 R1
R CH3
N N
R4 N R2 R4 P R2
N R3 R3
1-alquil-3-metil R1
imidazolio 1,4-Dialquilpiridinio Tetraalquilamonio Tetraalquilfosfonio
BF4 PF6 CF 3 SO 3
Tetrafluorborato Hexafluorofosfato Triflato
(CF3 SO 2 )NH CF 3 CO 2
Bistriflicimida Trifluoroacetato
Agua 1,000
Etanol 0,654
Acetonitrilo 0,460
Dietiléter 0,116
Estabilizante Desestabilizante
80 | ADOLFO M. IRIBARREN
CUADRO 2. Miscibilidad en agua de algunos líquidos iónicos
EMIM BF4 Sí
TfO Sí
Tf2N No
BMIM BF4 Sí
PF6 No
Tf2N No
TfO Sí
PF6 No
ButMe3N Tf2N No
82 | ADOLFO M. IRIBARREN
Es difícil generalizar y la estabilidad no siempre se condice con la
actividad; algunas enzimas, como la α-quimotripsina, la cal-b y la es-
terasa de Bacillus stearothermophilus, son más estables en algunos líqui-
dos iónicos que en solventes orgánicos, aunque no necesariamente más
activas; el motivo se desconoce pero se supone que puede estar relacio-
nado con interacciones coulómbicas.
Cabe resaltar que los solventes orgánicos y los líquidos iónicos de
polaridades semejantes pueden comportarse como medios muy distin-
tos. Por ejemplo, un estudio realizado con la lipasa de Pseudomonas ce-
pacia (pcl) demostró que esta se inactiva en solventes como metanol o
dimetilformamida mientras que mantiene su actividad en líquidos ióni-
cos con polaridades parecidas como [RMIM][BF4] y [PF6] (Seongsoon
y Kazlauskas, 2003).
84 | ADOLFO M. IRIBARREN
Respecto de la biocompatibilidad, se llevaron a cabo estudios com-
parativos de viabilidad celular en los que se utilizaron E. coli y una
concentración de 20% (v/v) de distintos solventes. Se demostró que
la mayoría de los solventes orgánicos dañaban la integridad de la
membrana, con excepción del decano, mientras que los líquidos ióni-
cos insolubles en agua ensayados –[BMIM][PF 6], [BMIM][Tf2N] y
[OMA] (metil-trioctilamonio) [Tf2N]– eran biocompatibles, y podían
ser usados como reservorios de sustratos y como agentes extractivos de
productos. La eficiencia de estos procesos se puede ejemplificar con la
reducción asimétrica de 4-cloroacetofenona con L. kef ir, que genera
(R)-1-(clorofenil)etanol con un rendimiento del 50% en el sistema
acuoso, mientras que en el sistema bifásico aumenta al 80-90%, lo que
indica que a pesar de la mayor viscosidad de los líquidos iónicos la
transferencia de masa es buena (Pfruender et al., 2006).
Las consideraciones mencionadas en la figura 3 fueron propuestas
para identificar líquidos iónicos adecuados para biotransformaciones
bifásicas con células enteras y sentar las bases de un sistema de scree-
ning útil en procesos industriales (Pfruender et al., 2006).
Precondiciones para
Disponibilidad, costo, datos toxicológicos, estabilidad, corrosividad
uso industrial
LI*= Lis.
86 | ADOLFO M. IRIBARREN
Además, el agregado de esas mezclas en medios acuosos también
aumentó tres veces la actividad de la hidrólisis catalizada por las este-
rasas de hígado de cerdo (ple, pig liver esterase) y de Rhizopus oryzae.
Se observó un efecto aún mayor, consistente en un aumento de 20 ve-
ces en la conversión de óxido de estireno en estireno mediada por una
epóxido hidrolasa de Agrobacterium radiobacter, causado por la adición
de 25% de la mezcla colina/glicerol al medio de reacción.
La condición para que se formen estos sistemas de bajo punto de
fusión es la presencia de un dador de puentes de hidrógeno y un acep-
tor como el ion cloruro en una relación molar dada. Como dadores de
puentes de hidrógeno pueden utilizarse distintos compuestos, como al-
coholes, azúcares, amidas y diversos tipos de estructuras, muchas de ellas
productos naturales renovables, lo que hace de estos medios un vasto
campo de investigación en el marco de las tecnologías verdes.
FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
CUADRO 3. Propiedades del CO2 scf comparadas con las de la fase líquida y
gaseosa
88 | ADOLFO M. IRIBARREN
FIGURA 4. Esquema del equipo para reacciones con solventes supercríticos
Enfriador
Reciclador
Bombas Separador
Reactor
Productos
CO2 Sustratos
90 | ADOLFO M. IRIBARREN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
92 | ADOLFO M. IRIBARREN
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Aplicaciones de la biología
molecular en biocatálisis.
Técnicas de clonación,
sobreexpresión y evolución
dirigida
Paola Panizza y Sonia Rodríguez
INTRODUCCIÓN
| 95
de crecer en tolueno como única fuente de carbono y energía y con
capacidad de acumular alguno de los intermediarios llevó a la obtención
de la cepa de Pseudomonas putida 39D usada ampliamente en biocatálisis
para la producción de cis-dioles a partir de sustratos aromáticos (Gibson
et al., 1970; 1974).
Así fue como se llegó a los primeros microorganismos genéticamen-
te modificados de aplicación en biocatálisis. No obstante, la modifica-
ción no se conocía sino que se generaba al azar y no se caracterizaba.
El progreso en las áreas de biología molecular y de tecnologías del
ADN recombinante permitió avanzar hacia el desarrollo de mutantes
por mutagénesis dirigida, anulación de vías alternativas y sobreproduc-
ción de enzimas de interés. En este sentido, constituyen hitos relevan-
tes la expresión de la tdo de Pseudomonas en E. coli (Zylstra y Gibson,
1989) y la expresión posterior de la Bayer-Villiger monooxygenasa de
Acinetobacter sp. ncib 9871 en S. cerevisiae (Stewart et al., 1998). Ade-
más, la combinación de la deleción de enzimas que compiten por el
sustrato con la sobreexpresión de la enzima de interés resultó ser una
herramienta interesante en la construcción de cepas con alto grado de
estereoselectividad (Rodríguez et al., 2001).
En la última década, las herramientas de la biología molecular han
sido cada vez más útiles para el descubrimiento y el desarrollo de
nuevos biocatalizadores y también para viabilizar su uso (Steele et al.,
2009; Demain y Vaishnav, 2009; Stewart, 2006; Bornscheuer, 2005;
Kayser, 2009). El requerimiento de nuevas capacidades biocatalíticas
que amplíen el rango de sustratos, la estereoselectividad o la regioquí-
mica de determinada reacción y además la estabilidad o la tolerancia
a los solventes ha potenciado el trabajo en el área. Asimismo, surge la
necesidad de que los biocatalizadores o los procesos se modifiquen de
una forma que posibilite su empleo a escala industrial (Luetz et al.,
2008). En ese sentido, la expresión heteróloga de las enzimas ha sido
crucial en cuanto a su disponibilidad y su fácil utilización así como
en la provisión de sistemas que permitan la modificación posterior de
las propiedades de dichas enzimas. El desarrollo del concepto y de las
técnicas que han permitido la evolución in vitro de enzimas adecuadas
para una función determinada ha revolucionado el área (Bershtein y
Tawfik, 2008; Zhao, 2007; Otten y Quax, 2005). Al mismo tiempo, el
conocimiento creciente de genomas y la aparición de herramientas que
permiten estudiar metagenomas abren posibilidades de explorar la in-
Clonación
Sistemas de purificación
Si se desea obtener una enzima para usarla en forma aislada, una vez
producida debe ser extraída, purificada y separada de las otras proteínas
que se producen en el sistema elegido (Waugh, 2005; Terpe, 2003). Si la
enzima se encuentra en el citoplasma de la célula va a estar acompañada
de un gran número de proteínas. Si se encuentra en el sobrenadante del
cultivo la cantidad de proteínas presentes en general será menor y la
purificación resultará más fácil. También puede suceder que la extracción
deba realizarse a partir de la fracción periplasmática o de los cuerpos de
inclusión.
En todos los casos la purificación puede facilitarse si se le agrega a
la proteína de interés una secuencia de aminoácidos exógena con alta
afinidad por un ligando químico o biológico específico (Arnau et al.,
2006). Estas secuencias, denominadas colas o “etiquetas” (tags en inglés),
se agregan en el momento de la clonación y son expresadas en forma de
fusión con la proteína clonada. Existen diversos tipos de colas disponi-
bles, que determinan el sistema cromatográfico que se va a utilizar. En
el cuadro 1 se muestran algunos de los sistemas empleados.
El sistema más utilizado consiste en la purificación mediante cro-
matografía de afinidad por unión a un metal inmovilizado (imac por
sus siglas en inglés). La histidina presenta gran afinidad por metales
de transición como Co2+, Ni2+, Cu2+ o Zn2+, por lo que se usan colas de
polihistidina. Como matriz de la cromatografía habitualmente se uti-
liza una resina del ácido nitriloacético (nta), la que forma un quelato
con el metal (con frecuencia Ni2+) y deja dos posiciones libres para la
formación de quelatos entre el ion metálico y la cola de histidinas. Al
ser pequeña la cola de histidinas por lo general no afecta la actividad
2-10
Poli-His 0,84 Ni2+-NTA, Co2+-CMA (Talon)
(generalmente 6)
Strep-Tactin (estreptavidina
Strep-tag II 8 1,06
modificada)
27-189
Dominios de unión a la celulosa 3,00 - 20.000 Celulosa
(distintos tipos)
1
Biolabs, N. E. Impact Kit. Disponible en <http://www.neb.com/nebecomm/products/
productE6901.asp>.
2. Generación de diversidad
1. Selección de interés mediante mutaciones
3. Clonado de la genoteca
en un vector de expresión
La mejor variante se utiliza cada vez
como punto de partida para un nuevo
ciclo de generación de diversidad y
selección, hasta alcanzar el objetivo
deseado
4. Transformación de
la cepa hospedera
5. Selección de los
mejores mutantes
(distintos métodos)
Mutagénesis al azar
Recombinación in vitro
dna shuffling
St ep
Digestión al azar
con DNAsaI
Hibridación
Extensión Desnaturalización
Producto resultante:
combinaciones de los
genes parentales
cncm
cast
Genomas y metagenomas
Clonación
BIBLIOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
| 125
tructura tridimensional tanto del ligando como del receptor (cuadro 1).
Por ejemplo, las dos estrategias seguidas habitualmente en modelado,
cuando se pretende diseñar un nuevo fármaco que actúe sobre deter-
minado receptor (perfectamente extrapolables a la interacción sustrato-
enzima), se denominan directa e indirecta. En la primera se requiere el
conocimiento de las características tridimensionales de un receptor y
se interpreta la actividad o la inactividad de las moléculas en términos
de complementariedad con el receptor. Esto es lo que se conoce por el
término docking (que podría traducirse como atraque, aplicado a un bar-
co que entrara en un puerto, aunque generalmente se emplea el término
inglés) o estudios de interacción entre el fármaco y el receptor.
La segunda estrategia, en la que la estructura tridimensional del re-
ceptor biológico no se conoce, se basa en el análisis comparativo de las
características estructurales de sustancias conocidas, activas o inactivas,
con el fin de definir un farmacóforo apropiado para la actividad bioló-
gica estudiada, cuya aplicación más destacada se conoce como método
qsar 3d (three-dimensional quantitative structure-activity relationships o
relaciones cuantitativas estructura-actividad en tres dimensiones). Estos
avances en ciencias computacionales nos permiten describir en detalle
la maquinaria del biocatalizador.
No obstante, la predicción cuantitativa in silico de la actividad en-
zimática y la selectividad sigue siendo un objetivo de gran interés en
biocatálisis. Así, los estudios de las dos últimas décadas han demostrado
cómo pueden utilizarse adecuadamente las enzimas, tanto en disolución
acuosa como en entornos no convencionales, lo que permite nuevas me-
todologías por desarrollar, incluso en condiciones experimentales más
extremas (Klibanov, 2001).
Estos avances han beneficiado en gran medida el modelado mole-
cular, al simular algunos de los fenómenos que tienen lugar a nivel de
las moléculas durante la biocatálisis y de ese modo proporcionar la base
para el diseño de estrategias racionales en la experimentación. Las si-
mulaciones moleculares ayudan a la construcción de modelos virtuales
de sistemas químicos. El principal interés del modelado molecular en
biocatálisis es el conocimiento de las interacciones enzima-sustrato a
nivel molecular y en general, como se comentó anteriormente, con el
propósito de predecir la actividad y la selectividad. Hay distintos algo-
ritmos que sirven para predecir el docking de un sustrato en el centro
activo de una enzima así como para calcular su energía de interacción y
qsar 2d y 3d
Química combinatoria
BIBLIOGRAFÍA
Biocatálisis enzimática
industrial
Andrés Illanes
| 151
Las enzimas han sido diseñadas naturalmente para actuar en condi-
ciones fisiológicas y exhiben propiedades notables como catalizadores
en cuanto a especificidad y reactividad en condiciones moderadas. Sin
embargo, la biocatálisis se refiere al uso de enzimas como catalizadores
de procesos en condiciones artificiales (in vitro) y el gran desafío de la
biocatálisis enzimática es poder transformar esos catalizadores fisioló-
gicos, sin perder sus buenas propiedades de reactividad y especificidad,
en catalizadores robustos capaces de actuar en condiciones de proceso
rigurosas. Las enzimas presentan propiedades muy diferentes de las de
los catalizadores químicos, lo que en gran medida se debe a su compleja
estructura molecular. En el cuadro 1 se resumen sus potencialidades y
sus limitaciones como catalizadores de procesos.
Las enzimas son catalizadores altamente deseables cuando la espe-
cificidad de la reacción es un aspecto clave del proceso, como ocurre
en sus múltiples aplicaciones en síntesis orgánica para la producción de
fármacos (Woodley, 2008) y productos químicos (García-Junceda et al.,
2004) y también cuando la reacción debe llevarse a cabo en condiciones
moderadas, sea debido a la inestabilidad de los sustratos o productos de
la reacción, sea para minimizar reacciones secundarias indeseables. Las
crecientes regulaciones ambientales representan un nicho de oportuni-
dad para los procesos enzimáticos frente a tecnologías alternativas por
su menor impacto ambiental y por ser catalogados como tecnologías
compatibles con el ambiente (Bommarius y Riebel, 2004). Sin embargo,
las enzimas son estructuras moleculares complejas, lábiles y de produc-
ción costosa, lo que representa el principal escollo para su aplicación a
nivel industrial (Ó’ Fágáin, 1997). La baja estabilidad operacional de
las enzimas es su principal desventaja, por lo que el desarrollo de tec-
nologías para incrementarla constituye un aspecto central de la bioca-
tálisis (Illanes, 1999). Se han propuesto diversas estrategias, entre las
que cabe destacar la modificación química de la estructura enzimática
(Mislovičová et al., 2006; Rodrigues et al., 2009), la inmovilización en
soportes y nanoestructuras (Mateo et al., 2005; Kim et al., 2006; Wang,
2008) y la autoinmovilización mediante cristalización (Roy y Abraham,
2006) y agregación (Wilson et al., 2006; Illanes et al., 2006; Sheldon et
al., 2007), las que se complementan con modernas técnicas de ingeniería
de proteínas como la mutagénesis dirigida y la evolución acelerada (Ar-
nold, 2001; Adamczak y Hari Krishna, 2004; Bardy et al., 2005; Morley
y Kazlauskas, 2005; Boersma et al., 2007). La búsqueda de enzimas con
Potencialidades Limitaciones
1
<http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/>.
S P
1 E E
CoE
S
2 E E - CoE
P
CoE
3 E E E - CoE
CoE’
P S
Más del 80% del mercado de las enzimas está dirigido a su uso industrial
como catalizadores de procesos. No obstante, su impacto tecnológico no
se circunscribe al ámbito industrial y existen importantes aplicaciones
en campos como el análisis químico y clínico, la biomedicina y la inves-
tigación experimental. El alto grado de especificidad y sensibilidad de
las enzimas las hace atractivas en análisis porque mediante su acción es
posible detectar analitos (sustrato o coenzima que la acción enzimática
convierte en una señal detectable) en muy bajas concentraciones con un
mínimo de interferencias. El problema asociado con la baja estabilidad
de las enzimas ha sido resuelto mediante el uso de enzimas inmoviliza-
das que incrementan la vida útil del dispositivo. Así se han desarrollado
electrodos enzimáticos muy robustos en los que el analito es converti-
do por la enzima inmovilizada dentro del dispositivo (usualmente en
la forma de una membrana) y el producto formado es detectado por
C
F
P1 P2 Pn D
F1 F2
E S
Disrupción celular
Permeabilización celular
Modelo cinético
Balance materia
v = f (E, X)
Modelo de comportamiento
η k ∙ E (t) = f (s1, X)
F ∙K
X = si - s
si
v = k∙e∙s
K + s Ec. 2
si X - 1n(1 - X) = k ∙ e t
K K Ec. 3
- de = kD ∙ t
dt Ec. 4
e = e0 ∙ exp(-kD) Ec. 5
a= V
h∙K
√
Φ = L eq V
D∙K
∫ v dX
efectiva
= ∫ v (e, X)
dX
∙ η(X)
= t
si Ec. 7
Ec. 8
1 .0
kd = 0
0 .9
0 .8
0 .7
k d = 0.1
0 .6
Conversión
0 .5 k d = 0.2
0 .4
k d = 0.3
0 .3
0 .2
0 .1
0 .0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo, horas
∫ 1 + a +2b∙ a(1∙ b- X) - √Q =
0,i
0,i k∙e ∙t
K Ec. 9
BIBLIOGRAFÍA
Procesos industriales
biocatalizados
Pablo Domínguez de María
| 191
Consumo energético. En la industria muchos procesos químicos se lle-
van a cabo en severas condiciones de reacción, a presiones altas y con
temperaturas elevadas. El empleo de enzimas –que cumplen su función
vital en condiciones de reacción mucho más suaves– puede contribuir
de manera significativa a esa reducción con el consiguiente ahorro de
energía y una menor contaminación.
NH2 O NH2 O
Lipasa de P. cepacia
O OH
Mini-emulsión ("Nanorreactor")
O O
Lipasa de páncreas porcino
O OH
NH2 Mini-emulsión ("Nanorreactor") NH 2
O
OH O
OH
P CO2 Me
O
OH O
CO2 Me COOH
CH 3 Esterasa hígado de cerdo
HOOC CO2 Me
Me
N O
Br
H NH
CO2 Me N O
O O HO O OR
H HOOC N
COOMe OH
O H2 O 2 O
Lipasa
R OH R OOH
H2O
O O
O Esterasa (Metagenómica) OH
O O
O O
H 3C OH
O O
O Esterasa (Metagenómica) O
O OH
O O
H3 C OH
O HO CN
Hidroxinitrilo Liasa
+ HCN
R1 R2 R1 R2
OH OH
O
CN CN
OH OH
CN CN
O
O OH
H Hidroxinitrilo Liasa
+ NO 2
NO 2
Rendimiento: 67%
ee.: 95 % (anti/syn 9/1)
NH
OH OH
O N
O
OH
Lipitor
F (Atorvast atina)
Oxidorreductasas
O
Glucono-lactona NAD(P)+
R1 R2
OH
D-Glucosa + R1 R2
NAD(P)H + H
OH OH OH OH
O Br
Cl O O Br
31 h; 94%; ee.: > 99% 27 h; 93%; ee.: 96% 25 h; 95%; ee.: > 99% 26 h; 94%; ee.: 97%
156 g/L 210 g/L 212 g/L 140 g/L
O O O O
O BAL (Sobre-expresada en células E. coli )
H + H O
O Sistema bifásico: MTBE/Buffer OH
23 h; ca. 60 g/L;
ee.: > 99%
O NH 2
OH OH
O O
Ácido Pirúvico Alanina
(Aceptor Amina)
O
CN Rhodococcus rhodocrous
NH 2
Acrilamida
ca. 400 g/L
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
BIBLIOGRAFÍA