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revisión revisión
Bichos de bioingeniería 1: 6, 395-403; Noviembre / diciembre de 2010; © 2010 Landes Bioscience

Transformación de Saccharomyces cerevisiae

y otros hongos
Métodos y posible mecanismo subyacente
Shigeyuki Kawai, wataru Hashimoto y Kousaku Murata *

Laboratorio de Biotecnología Molecular Básica y Aplicada; Escuela de Graduados en Agricultura; Universidad de Kyoto; Kyoto, Japón

Palabras clave: hongos Saccharomyces cerevisiaetransformación, transfección, polietilenglicol, acetato de litio, pared celular, esferoplasto,
electroporación, endocitosis

abreviaturas: AMPc, monofosfato de adenosina cíclico; DMSO, dimetilsulfóxido; DTT, ditiotreitol; LiAc, acetato de litio;
LiCl, cloruro de litio; PEG, polietilenglicol; WT, tipo salvaje; YPD, extracto de levadura, peptona y dextrosa

La transformación (es decir, la modificación genética de una célula
mediante la incorporación de ADN exógeno) es indispensable para
manipular hongos. Aquí, revisamos los métodos de transformación
paraSaccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida
albicans, Pichia pastoris y especies de Aspergillus y discutir algunas
modificaciones comunes para mejorar la eficiencia de transformación.
también presentamos un modelo del mecanismo subyacenteS.
cerevisiae transformación, basada en informes recientes y el
mecanismo de transfección en sistemas de mamíferos. Este modelo
predice que el ADN se adhiere a la pared celular y entra en la célula a
través de la invaginación de la membrana endocitótica, aunque se
desconoce cómo llega el ADN al núcleo. El polietilenglicol es
indispensable para la transformación exitosa de células intactas y la
unión del ADN y posiblemente también actúa sobre la membrana para
aumentar la eficiencia de transformación. Tanto el acetato de litio
como el choque térmico, que mejoran la eficiencia de transformación
de las células intactas pero no la de los esferoplastos, probablemente
ayuden al ADN a atravesar la pared celular.
Introducción
La transformación es una técnica importante en la que se introduce
ADN exógeno en una célula, lo que da como resultado una modificación
genética. En el caso de los hongos, los esferoplastos de la levadura en
ciernesSaccharomyces cerevisiae se transformaron con éxito por
primera vez en 1978.1 Se han desarrollado varios métodos para
transformar células intactas, incluidos los de litio, electroporación,
biolísticos y perlas de vidrio, y se ha mejorado la eficiencia de cada
método.2-19 Estos métodos se pueden utilizar para transformar otros
hongos como las levaduras (p. Ej., Schizosaccharomyces pombe,
Candida albicans y Pichia pastoris) y hongos filamentosos
(por ejemplo, especies de Aspergillus),17,18,20-34 aunque la eficiencia de
transformación de estos hongos es generalmente menor que la de
S. cerevisiae.
Para una transformación fúngica exitosa, el ADN exógeno debe
atravesar la pared celular y la membrana plasmática y ser entregado en
el citosol para llegar al núcleo. Sin embargo, durante la transformación
de los esferoplastos, el ADN exógeno no necesita atravesar la pared
celular. El mecanismo subyacente a la transformación no se ha aclarado
completamente ni siquiera enS. cerevisiae, aunque ha sido propuesto
por varios estudios recientes.35-38
En 2001, Gietz y Woods39 revisó los métodos de transformación
fúngica y discutió los mecanismos involucrados, en el contexto de
S. cerevisiae. Sin embargo, se han logrado varias mejoras desde
entonces. Por tanto, conviene revisar estos métodos,
especialmente el mecanismo deS. cerevisiae transformación y
centrarse en los desarrollos recientes. A continuación, revisamos
los métodos de transformación deS. cerevisiae, S. pombe,
C. albicans, PAG. pastoris y especies de Aspergillus y discuten algunas
modificaciones comunes para mejorar la eficiencia de transformación. Los
protocolos básicos deS. cerevisiae también se proporcionan transformación.
También presentamos un modelo del mecanismo subyacente
S. cerevisiae transformación, basada en los informes recientes35-38 y el
mecanismo subyacente a la transfección en el sistema de mamíferos.
Aunque se describen métodos que requieren equipos especiales (por
ejemplo, electroporación y el método biolístico), nos enfocamos en aquellos
que no requieren equipos especiales, concentrándonos en componentes y
eventos biológicos. Hemos utilizado el término "eficiencia de
transformación" para referirnos al número de transformantes por
microgramo de ADN y el término "frecuencia de transformación" para
indicar la eficiencia de transformación por número de células viables.
Transformación de S. cerevisiae

* Correspondencia a: Kousaku Murata; Correo electrónico: kmurata@kais.kyoto-

u.ac.jp Enviado: 30/09/09; Revisado: 25/01/10; Aceptado: 05/08/10
Publicado anteriormente en línea: www.landesbioscience.com/
journals/biobugs/article/13257 DOI: 10.4161 / bbug.1.6.13257
método del esferoplasto. Transformación de S. cerevisiae por el método del
esferoplasto fue realizado por primera vez por Hinnen et al.1 Transformaron
esferoplastos, preparados por digestión enzimática de S. cerevisiae leu2 3–
112 células mutantes, con ADN plasmídico quimérico que contiene LEU2
pero no un replicón de levadura. La transformación

www.landesbioscience.com Errores de bioingeniería 395

 Tabla 1. Protocolo para el método de esferoplastos desarrollado por
Burgers y Percival7
Centrifugue las células y los esferoplastos a 400-600 gy 200-300 g,
respectivamente.
1. Cultivar las células durante la noche con aireación vigorosa en 50 ml de YPD (extracto de
levadura al 1%, bactopeptona al 2% y dextrosa al 2%) hasta una concentración de
aproximadamente 3 x 107 células / ml y cosecha.
2. lavar las células sucesivamente con 20 ml de agua esterilizada y 20 ml de
sorbitol 1 M mediante resuspensión, seguido de centrifugado de 5 min.
resuspenderlos en 20 ml de SCeM [sorbitol 1 M, citrato de sodio 0,1 M (pH
5,8), eDTA 10 mM y 2-mercaptoetanol 30 mM], añadir 1000 U de líticasa e
incubar a 30 ° C con inversión ocasional.
3. Después del esferoplastos, mida la disminución de la DO de una dilución
800
de 10
veces de esferoplastos en agua. Coseche los esferoplastos durante 3 a 4 minutos
cuando el esferoplastos llegue al 90% (~ 15 a 20 minutos).
4. Resuspenda suavemente los esferoplastos en 20 ml de sorbitol 1 M utilizando una
pipeta de 1 ml y un sedimento durante 3-4 min. Luego, resuspenda suavemente
en 20 ml de STC [sorbitol 1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y 10 mM
CaCl] y sedimentar nuevamente durante 3-4 min. resuspender este sedimento en 2 ml de
2
STC.
5. Mezclar alícuotas (100 µl) con ADN plasmídico y ADN portador (timo de ternero o
mi. coli) añadido a un total de 5 µg de ADN en <10 µl.
6. Después de 10 min a temperatura ambiente, añadir 1 ml de PeG [Tris-HCl 10 mM (pH
7,5), CaCl 10 mM y PeG 8000
2
al 20%; esterilizado por filtro], resuspender suavemente los
esferoplastos y cosecharlos durante 4 minutos después de otros 10 minutos.
7. resuspender el gránulo en 150 µl de SOS (sorbitol 1 M, CaCl 6,5 mM, extracto de
2 más adelante en esta revisión.
levadura al 0,25% y bactopeptona al 0,5%; esterilizado por filtración) y dejar a 30
° C durante 20-40 min. Las diluciones de los esferoplastos se realizan en el
mismo medio.
8. Añada 8 ml de TOP [sorbitol 1 M y agar al 2,5% en medio selectivo SD (base
nitrogenada de levadura al 0,67% y glucosa al 2%)] mantenido a 45–46 ° C.
invierta el tubo rápidamente varias veces para mezclar y colocar la suspensión
inmediatamente en placas selectivas de SOrB (placas SD que contienen sorbitol
0,9 M y glucosa al 3%).
la eficiencia fue de solo 30-50 transformantes / μg de ADN plasmídico, que
debe integrarse en el ADN cromosómico para establecer transformantes
estables. En el mismo año, Beggs6 mejoró la eficiencia de este método a 1 x
104 transformantes / μg de ADN plasmídico mediante el uso de ADN
plasmídico quimérico que lleva un elemento de levadura de 2 μm de
replicación autónoma endógena. La mayor eficiencia de transformación: 2 x
107 y 5 x 106 transformantes / μg de ADN plasmídico monocatenario y
bicatenario, respectivamente, ha sido logrado por Burgers y Percival.7
Redujeron el número de pasos requeridos para preparar esferoplastos, la
concentración de células requeridas en la etapa de esferoplastos y la
concentración de esferoplastos requerida durante la transformación, así
como las fuerzas g requeridas para la sedimentación de esferoplasto. La
frecuencia de transformación fue sorprendentemente alta,
aproximadamente 0,10, cuando la concentración de esferoplastos era de 3 x
10.7–3 x 108/ ml y la cantidad de ADN de mPY2 monocatenario fue de 1-3 μg.
Sin embargo, la frecuencia disminuyó drásticamente a 0,0014 cuando la
concentración de esferoplastos era 2 x 109/ ml y la cantidad de ADN de mPY2
fue de 16 μg, lo que indica que la concentración de esferoplastos y la
cantidad de ADN son críticas para una alta frecuencia de transformación.
Cuando los autores utilizaron ADN portador (timo de ternero oEscherichia
coli), la frecuencia de transformación dependió de nuevo de la concentración
de los esferoplastos y el ADN portador. Transformación
396
Tabla 2. Protocolo original para el método del litio desarrollado por ito et
al.2
1. Cultivar las células de levadura aeróbicamente en 100 ml de medio YPD a 30 ° C
con reciprocidad. En la fase de registro medio, cosechar las células por
centrifugación, lavar una vez con Te [Tris-HCl 10 mM (pH 8.0) y eDTA 1.0 mM] y
suspender en Te hasta una concentración final de 2 x 108 células / ml.
2. A una porción de 0.5 ml de esta suspensión celular, agregue un volumen igual de iones
metálicos 0.2 M (LiAc). Después de 1 ha 30 ° C con agitación (140 rpm; carrera, 7,0 cm),
incube 0,1 ml de la suspensión celular estáticamente con 15µl de una solución de ADN
plasmídico (670 µg / ml) a 30 ° C durante 30 min.
3. Añada un volumen igual de PeG 4000 al 70% disuelto en agua y esterilizado a 120 °
C durante 15 min y mezcle bien en un mezclador vórtex. Después de reposar
durante 1 ha 30 ° C, incubar la suspensión a 42 ° C durante 5 min.
4. Enfriar inmediatamente las células a temperatura ambiente, lavar dos veces
con agua y suspender en 1,0 ml de agua.
5. Para seleccionar los transformantes de levadura, esparcir directamente 0,1 ml
de la suspensión celular en medio sólido selectivo.
con ADN bicatenario fue generalmente dos o cinco veces menos
eficiente que con ADN monocatenario, pero la razón de esta diferencia
aún no se ha aclarado. El protocolo para el método de esferoplastos
desarrollado por Burgers y Percival7 se presenta en tabla 1. Cabe
señalar que el acetato de litio (LiAc) y el choque térmico (incubación de
esferoplastos a 42 ° C durante un corto tiempo en presencia de ADN
plasmídico) no son necesarios para la transformación, como se discutirá
A pesar de la alta frecuencia de transformación, el método de
esferoplastos no logró convertirse en un protocolo importante y popular,
probablemente debido al procedimiento tedioso y complejo y porque los
transformantes están incrustados en agar de regeneración, lo que dificulta
la reproducción en placas. Este método sigue siendo útil para la
transformación con cromosomas artificiales de levadura que tienen una
longitud de 100 a 1000 kb y con partículas priónicas infecciosas.40,41
método de litio. Durante un seminario celebrado el 15 de mayo de
1981 en el Instituto de Investigación para la Ciencia de los Alimentos
(Universidad de Kyoto, Japón), la posibilidad de transformar intactos S.
cerevisiae cell fue presentado por primera vez por uno (KM) de los
autores de esta revisión, junto con otros resultados obtenidos durante
su estancia en el Mitsubishi-Kasei Institute of Life Sciences (Tokio,
Japón). El método del litio se publicó en 1983.2 Uno de los hallazgos
importantes fue que los cationes monovalentes como el Na+, K+, Rb+, Cs
+ y particularmente, Li+ pero no cationes divalentes como Ca2+ (efectivo
para E. coli transformación) mejorar la eficiencia de transformación de
intactos S. cerevisiaecélulas. La razón de la eficacia de estos cationes
monovalentes podría atribuirse a su leve efecto caotrópico durante la
transformación,42 y también se analiza más adelante en esta revisión. El
protocolo original para el método del litio desarrollado por Ito et al.2
se presenta en Tabla 2. Se encontró que LiAc era 1,7 veces más eficaz que el
cloruro de litio (LiCl). Es importante destacar que el litio no fue el único
contribuyente a la transformación de células intactas. Ito y col.2
mostró que (1) la incubación de células intactas con polietilenglicol
(PEG) y ADN plasmídico es esencial para la transformación, (2) la
incubación a corto plazo de células intactas con PEG y ADN plasmídico a
42 ° C (choque térmico) mejora la eficiencia de transformación y ( 3) la
transformación de las células es más eficaz en la fase de registro medio.
El método del litio desarrollado por Ito et al.2 produjo aproximadamente
450 transformantes / μg de ADN plasmídico. PEG se probó de acuerdo
Errores de bioingeniería volumen 1 número 6
a su uso en el método esferoplasto. El litio se probó porque se sabe
que es eficaz para eluir polifosfato inorgánico, una macromolécula
cargada negativamente similar al ADN, de columnas de
intercambio de aniones (Murata K, et al. Agric Biol Chem 1978; 42:
2221-6).
Por sus resultados, Ito et al.2 estableció 4 principios del método
del litio: (1) el PEG es esencial; (2) LiAc y (3) choque térmico mejoran
la eficiencia de transformación; y (4) la mayor eficiencia se obtiene
cuando las celdas están en la fase de registro medio (DO = 1.6).
Como610 este método es más rápido, más simple y más fácil de
realizar que el método de esferoplastos y no necesita agar de
regeneración ni equipo especial, se ha vuelto popular.
Con base en estos 4 principios, se han reportado varias
modificaciones que mejoran la eficiencia de transformación del método
del litio. Gietz y sus compañeros de trabajo lograron mejorar la
eficiencia a 5 x 106–1 x 107/ μg de ADN plasmídico de 108 células
mezclando inmediatamente las células intactas lavadas con PEG, LiAc,
ADN plasmídico y ADN portador monocatenario e incubándolos a 42 ° C
durante 40-60 min sin pretratamiento.8-11 El protocolo para el método
modificado (LiAc / método de ADN portador monocatenario / PEG)
descrito por Gietz y Woods11 se describe en Tabla 3. Además, Gietz y
Schiestl12 células intactas almacenadas como células competentes
congeladas en glicerol al 5% con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%. Cabe
señalar que el ADN portador monocatenario no es eficaz en el método
del esferoplasto, mientras que el ADN bicatenario sí lo es, lo que indica
que la contribución del ADN portador al método del esferoplasto es
diferente de la del método LiAc / ADN portador monocatenario / PEG. .
7,8 El papel del ADN portador aún no se ha dilucidado. Las células
intactas sólo se transformaron pobremente con ADN monocatenario en
el método LiAc / ADN portador monocatenario / PEG, aunque los
esferoplastos se transformaron eficazmente con este ADN.7,10
Otras modificaciones del método del litio incluyen la
adición de 2-mercaptoetanol,43 ditiotreitol (DTT),44 DMSO,45
o etanol.46 Aunque estos reactivos fueron efectivos en el método
original del litio, al menos 2-mercaptoetanol y DMSO no fueron
efectivos en el método LiAc / ADN portador monocatenario / PEG.10
Chen y col.13 informó que la adición de DTT 100 mM es eficaz
incluso en el método LiAc / ADN portador monocatenario / PEG. En
particular, incubaron una mezcla de DTT, LiAc, ADN portador
monocatenario, PEG, células intactas y ADN plasmídico a 45 ° C,
pero no a 42 ° C, y afirmaron que la incubación a 42 ° C o 48 ° C
reduce drásticamente la eficiencia. . Otra modificación es excluir
LiAc.14,15 Es decir, las células intactas se transforman con ADN
plasmídico incubando las células con PEG y ADN plasmídico a 30 ° C
y luego a 42 ° C (choque térmico). Los resultados de esta
transformación varían según la cepa y la mezcla de reacción es
simple, lo que implica que interviene un componente biológico.14,15
Como se describe más adelante en esta revisión, intentamos
aclarar el mecanismo subyacente a dicha transformación.35,36
electroporación. La electroporación se utilizó por primera vez para
transformar intactos S. cerevisiae células de Hashimoto et al.3 Delormedieciséis
intentó establecer las condiciones óptimas para la electroporación,
suspendiendo intactos S. cerevisiae células en medio YPD (extracto de
levadura, bactopeptona y dextrosa), realizando electroporación y
colocándolas directamente en medio selectivo. El óptimo
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Tabla 3. Protocolo para el método LiAc / ADN portador monocatenario / PeG
desarrollado por Gietz y Woods11
1. inocular la cepa de levadura en 5 ml de medio líquido (2x YPAD o medio de
selección sintético completo [SC]) e incubar durante la noche a 30 ° C. Coloque
también una botella de caldo YPAD de concentración doble (2x YPAD) y un matraz
de cultivo de 250 ml en la incubadora.
2. Determine el título del cultivo de levadura midiendo la DO de una solución
600
de 10 µL de las células se añaden a 1,0 ml de agua en una cubeta de
espectrofotómetro. Para muchas cepas de levadura, una suspensión que
contiene 1 x 106 células / ml dará una DO
600
de 0,1.
3. Transfiera 50 ml de 2x YPAD precalentado al matraz de cultivo precalentado y
agregue 2.5 x 108 células para dar una densidad de 5 x 106 células / ml. Incubar el
matraz en un agitador rotatorio o alternativo a 30 ° C y 200 rpm. (Nota: es
importante permitir que las celdas completen al menos 2 divisiones. La eficiencia
de transformación permanece constante para 3 a 4 divisiones de celda).
4. cuando el título de células es de al menos 2 x 107 células / ml, que debería tomar alrededor
de 4 h, se recolectan las células por centrifugación, se lavan las células en 25 ml de agua
esterilizada y se lavan de nuevo en 1 ml de agua esterilizada.
5. Agregue agua hasta un volumen final de 1.0 ml y agite vigorosamente con vórtice
para resuspender las células. Pipeta 100µl muestras (~ 108 células) en tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, uno para cada transformación, centrifugar a velocidad
máxima durante 30 sy desechar el sobrenadante.
6. Agregue 360 µl de mezcla de transformación, compuesta por 240 µl PeG 3350
[50% (p / v)], 36 µl LiAc (1,0 M), 50 µl ADN monocatenario hervido (2,0 mg / ml) y
34 µl ADN plasmídico más agua, a cada tubo de transformación y resuspender las
células mediante una vigorosa mezcla en vórtice.
7. Incubar los tubos en un baño de agua a 42 ° C durante 40 min. [Nota: el tiempo óptimo
puede variar para diferentes cepas de levadura].
8. Microcentrifugar a velocidad máxima durante 30 sy retirar la mezcla de transformación con
una micropipeta. Pipetee 1,0 ml de agua esterilizada en cada tubo, agite el sedimento con
una punta de micropipeta y agite en el vórtex.
9. Coloque las diluciones adecuadas de la suspensión celular en un medio de
selección SC.
las condiciones fueron las siguientes: (1) voltaje de 900 V, (2)
electroporación de células de fase logarítmica
600
tempranas (DO = 0.3-1.0)
a una densidad
600
celular de DO 10-20 en presencia de menos de 0.1 μg
de ADN plasmídico para una alta eficiencia de transformación y (3)
ausencia de ADN portador porque no es efectivo. Delorme obtuvo entre
1000 y 4500 transformantes / μg de ADN plasmídico. Sin embargo,
Weaver et al.47 demostró que entre el 35 y el 75% de los S. pombe
células (14-25 μl de una solución que contiene 6 x 107 células / ml)
podrían absorber macromoléculas (dextrano marcado; 70 kDa) dentro
de los 5 min de un pulso, lo que sugiere que se puede obtener un
número mucho mayor de transformantes por electroporación. Becker y
Guarente48 atribuyó la baja eficiencia de transformación de la
electroporación al soporte inadecuado de las celdas eléctricamente
comprometidas. Proporcionaron soporte osmótico continuo (con
sorbitol 1 M) y obtuvieron de forma rutinaria 2-5 x 105 transformantes /
μg de ADN plasmídico en S. cerevisiae transformación. Desde entonces,
el sorbitol se ha incluido en el protocolo estándar del método de
electroporación deS. cerevisiae transformación. Además, Thompson et
al.17 encontraron que la preincubación de células en presencia de LiAc
100 mM y DTT 10 mM mejora la eficiencia de transformación en un
orden de magnitud de uno a dos. LiAc y DTT fueron efectivos
sinérgicamente. Su método también se aplicó a la transformación deC.
albicans.17 Suga y Hatakeyama18 informó que la congelación de células
intactas de S. cerevisiae y S. pombe en
397
 Cuadro 4. Protocolo para la electroporación de células competentes congeladas
desarrollado por Suga y Hatakeyama18
1. Crecer S. Pombe células en medio SD suplementado con los nutrientes apropiados
a una densidad de aproximadamente 1 x 107 células / ml a 30 ° C. CrecerS.
cerevisiae células en medio YPD a una densidad de aproximadamente 1 x 107
células / ml a 30 ° C.
2. Coloque los cultivos en hielo durante 15 minutos justo antes de la recolección.
Recoger las células por centrifugación y lavar el sedimento resultante tres veces
con agua esterilizada helada. Suspenda este sedimento en tampón de congelación
helado que contenga sorbitol 0,6–2,5 M, CaCl 5–10 mM y ácido2 2- (4- [2-hidroxietil]
-1-piperazinil) etanosulfónico (HePeS; pH 7,5) 10 mM para obtener un densidad de
aproximadamente 5 x 108 células / ml.
3. Dispense alícuotas (0,1 ml) de la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml,
congélelos lentamente y almacénelos colocándolos directamente en un congelador a -80
° C (velocidad de enfriamiento = ~ 10 ° C / min).
4. Para cada electroporación, descongelar rápidamente las células competentes congeladas
en un baño de agua a 30 ° C (velocidad de calentamiento = ~ 200 ° C / min) y lavar una vez
con 1 ml de sorbitol 1,0 M helado por centrifugación. resuspender el sedimento final en
1,0 M de sorbitol para obtener una densidad de 1 a 2 x 109 células / ml.
5. Mezcle la suspensión celular con 0,5–10,0 ng de ADN plasmídico purificado y
luego transfiéralo a una cubeta refrigerada con un espacio entre electrodos de
0,2 cm. Aplique un pulso eléctrico alto a la suspensión celular, utilizando Biorad
Gene Pulser ii con Pulse Controller Plus.
6. diluir inmediatamente las células electroporadas en 1 ml de sorbitol 1,0 M
helado y esparcir una alícuota (0,1-0,2 ml) en placas de selección mínima. ParaS.
cerevisiae, las placas de selección mínima contienen 1,0 M de sorbitol como
estabilizador osmótico.
7. Las colonias transformantes aparecen en 4-6 días a 30 ° C.
sorbitol (0.6-2.5 M) con calcio (5-10 mM) a -80 ° C da como resultado
una alta eficiencia de transformación por electroporación, dando más
de 106 transformantes / μg de ADN plasmídico después de descongelar.
El protocolo para Suga y Hatakeyama18 método de electroporación de S.
cerevisiae y S. pombe se describe en tabla 4.
método biolístico. Las células se pueden transformar con microproyectiles
metálicos recubiertos de ADN que se inyectan en las células.49 Armaleo y col.4
demostró que intacto S. cerevisiae las células pueden transformarse
mediante el método biolístico (bombardeo). Descubrieron que las células en
la fase estacionaria media, a diferencia del caso de los métodos de litio y
esferoplasto, son las más efectivas. Similar al método del esferoplasto, se
necesita soporte osmótico con sorbitol 0,75 M y manitol 0,75 M para una alta
eficiencia de transformación. Entre los metales probados (W, Pt, Fe, Au e Ir),
el tungsteno (W) es el más efectivo. Los transformantes nucleares estables
resultan principalmente de la penetración de una sola partícula con un
diámetro de 0,5 a 0,65 μm. Para recubrir el tungsteno, es importante la
adición de una cantidad adecuada de CaCl y espermidina al ADN plasmídico.2
Las condiciones óptimas, sin embargo, producen solo alrededor de 500
transformantes / μg de ADN plasmídico de 108 células. Aunque la eficiencia
de transformación del método biolístico es baja, la transformación
mitocondrial de
S. cerevisiae hasta ahora solo ha tenido éxito con este método.19
Johnston y col.19 tungsteno de 1 μm recubierto con YEp352 (plásmido
multicopia que lleva el tipo salvaje [WT] nuclear URA3) y pQAoxi3 que
lleva ADN mitocondrial. El tungsteno recubierto fue bombardeadoS.
cerevisiae deficiente respiratorio-) células que tienen una lesión en el
núcleo URA3. Entre los 3.600 Ura+ Los transformantes nucleares
obtenidos, solo seis eran competentes para la respiración y se
demostró que eran transformantes mitocondriales.
398 Errores de bioingeniería
método de cuentas de vidrio. Constanzo y Fox5 demostró que intacto S.
cerevisiae las células se pueden transformar mediante agitación con perlas
de vidrio en presencia de ADN portador y ADN plasmídico con una eficacia
muy baja, es decir, aproximadamente 300 transformantes / μg de ADN
plasmídico. Se requiere soporte osmótico (con sorbitol 1,0 M) en el medio
sólido selectivo.
Transformación de otros hongos
transformación de S. pombe. El método esferoplasto rindió 1 x 10
4–5 x 104 transformantes / μg de ADN plasmídico en S. pombe.20
Este método fue mejorado por Allshire50 para dar 5 x 105
transformantes / μg de ADN plasmídico de 4 x 107 esferoplastos
mediante el uso del reactivo catiónico formador de liposomas
lipofectina. En este procedimiento, se introdujo un minicromosoma
lineal de más de 500 kb en elS. pombe células. Con respecto al método
del litio, Okazaki et al.21 estableció un protocolo que arrojó 106
transformantes / μg de ADN plasmídico de 108 células. Encontraron que
el litio es el más eficaz entre los cationes probados (Li, Na, K, Rb y Cs) y
que el acetato es mejor que el cloruro, como en el caso de
S. cerevisiae.2 Sorprendentemente, la eficiencia de transformación dependió
en gran medida del pH de LiAc, con un pH óptimo que oscilaba entre 4,9 y
5,1. El ADN portador no se incluyó en el protocolo. Morita y Takegawa51
informaron de un procedimiento simplificado para dar aproximadamente
8.000 transformantes / μg de ADN plasmídico y utilizaron una colonia
cultivada en medio mínimo sólido. El ADN portador se incluyó en su
protocolo, lo que mejoró la eficiencia en aproximadamente 60 veces. Suga y
Hatakeyama52 estableció un procedimiento rápido utilizando células
competentes criopreservadas. Como crioprotector, encontraron que el
glicerol (concentración óptima; 30%) era mejor que el DMSO. El glicerol
también mejoró la eficiencia de transformación. Este procedimiento arrojó
más de 106 transformantes / μg de ADN plasmídico. La electroporación
podría usarse para transformar
S. pombe células y rindió 104–106 transformantes / μg de ADN
plasmídico (tabla 4).18
transformación de otras levaduras. PAG. pastoris las células se
han transformado a 105 transformantes / μg de ADN plasmídico por el
método del esferoplasto y a 4 x 106 transformantes / μg de ADN
plasmídico por electroporación.22,23 En el método de electroporación,
PAG. pastoris Las células se pretratan con LiAc 100 mM y DTT 10 mM,
como en el caso de S. cerevisiae.17 Este pretratamiento aumenta la
eficiencia de transformación de PAG. pastoris y S. cerevisiae células en
aproximadamente 150 y 6 a 300 veces, respectivamente. El método del
litio también es aplicable aPAG. pastoris (protocolo disponible en http://
www.invitrogen.com/). LiCl, pero no LiAc, es eficaz pero la eficacia es
muy baja, concretamente alrededor de 17 transformantes / μg de ADN
plasmídico.
El método de esferoplastos se ha utilizado para transformar C. albicans
células, produciendo de 0,5 a 5 transformantes / μg de ADN plasmídico.24
Este método se ha mejorado para producir 103–104
transformantes / μg de ADN plasmídico.25 El método del litio
produjo sólo 50-100 transformantes / μg de ADN plasmídico.26 El
protocolo para el método de litio de C. albicans La transformación
ha sido descrita en detalle por Ramón y Fonzi.53 Con respecto al
método de electroporación, el pretratamiento de las células con
LiAc 100 mM y DTT 10 mM mejora la eficiencia en 3,5 veces y
volumen 1 número 6
produce aproximadamente 160 transformantes / μg
de ADN plasmídico.17 De Backer y col.27 optimizó las
condiciones y mejoró la eficiencia para producir 4.500
transformantes / μg de ADN plasmídico. Redujeron la
concentración de pretratamiento de LiAc de 100 mM a
5 mM, utilizaron una cantidad menor de ADN
plasmídico (0,1 μg) e inmediatamente sembraron las
células pulsadas en un medio sólido selectivo que
contenía sorbitol 1 M.
transformación de especies de Aspergillus. El
método esferoplasto establecido para
S. cerevisiae La transformación se adaptó a
Aspergillus nidulans por Tilburn et al.28 en 1983.
Lograron una eficiencia de solo 25
transformantes / μg de ADN plasmídico. Más
recientemente, Dawe et al.29 mejoró la eficiencia a Figura 1. eficiencia de transformación relativa (barra blanca) y frecuencia (barra gris) de los mutantes
varios cientos de transformantes por microgramo de baja transformabilidad (A) y mutantes de alta transformabilidad (B).35 Los valores son relativos a los
de ADN plasmídico. En resumen, las conidiosporas del wT (BY4742), establecido en 1.0. Se muestran los promedios y mínimo o máximo de 3 experimentos
independientes.
germinaron y sus paredes celulares se digirieron
enzimáticamente.29,30 Los protoplastos se
incubaron con ADN plasmídico, PEG y CaCl. 2
y difundir en la eficiencia y la frecuencia de transformación. También se identificaron
medio sólido selectivo. En este medio se obtuvieron transformantes varios otros mutantes de baja transformabilidad, incluidosvrp1,pan1-9,
heterocarióticos. Como los conidios son generalmente uninucleados, los pan1-20 y las17,35 al igual que myo3myo5, arp2, arp3,arco15 y arc19 (
transformantes homocarióticos pueden obtenerse fácilmente a partir de los nuestros datos inéditos). La muy baja transformabilidad deella4, arco18
heterocarióticos volviendo a seleccionar la progenie. El protocolo para y vrp1 se muestra en figura 1a. El complejo Arp2 / 3 consta de 7
Aspergillus oryzae La transformación por el método de esferoplasto ha sido subunidades (Arp2, Arp3, Arc35, Arc19, Arc18, Arc15 y Arc40), cada una
descrita en detalle por Kitamoto.31 Transformación de de las cuales contribuye de manera diferente al ensamblaje y función
A. nidulans por electroporación y el método biolístico ha sido del complejo.58 La activación del complejo Arp2 / 3 requiere Myo3 / 5,
informado por Sánchez y Aguirre32 y Barcellos y Fungaro,33 Vrp1, Las17 y Pan1.54,55,59
respectivamente. Gouka y col.34 describió la transformación de She4 es un acompañante molecular necesario para la función de Myo3 / 5.60
Aspergillus awamori mediante el uso Agrobacterium tumefaciens. Por tanto, todos estos mutantes de baja transformabilidad carecen de un
Mediante su método, es posible construir cepas de moho componente del complejo Arp2 / 3 o de un componente necesario para la
recombinantes libres de ADN bacteriano y otro ADN extraño y se activación de este complejo. El complejo Arp2 / 3 y su activación son
espera que este sistema estimule la aceptación en el mercado de necesarios para la captación endocitótica que acompaña a la invaginación de
productos derivados de hongos al evitar la introducción de ADN la membrana.54-57 Además, la evidencia creciente confirma que los complejos
bacteriano y otro ADN extraño en los hongos. catiónicos lípido-ADN (lipoplejos) y el complejo catiónico polímero-ADN
(poliplexos) ingresan a las células de mamíferos a través de endocitosis.61-66
Mecanismo molecular Teniendo en cuenta todos estos informes, proponemos que durante la
Subyacente S. cerevisiae Transformación transformación de S. cerevisiae, el ADN exógeno ingresa a la célula a través
de la invaginación de la membrana similar a la endocitosis.35 Sin embargo,
endocitosis. S. cerevisiae las células pueden transformarse únicamente cabe señalar que otros mutantes endocitóticos como sac6,end3, rvs161,
incubando las células con ADN y PEG.14,15 La eficiencia de transformación rvs167, akr1, erg2, sla1, kcs1 y arg82 mostró transformabilidad normal.35 La
depende del fondo de la cepa y la composición de la mezcla de reacción es razón de esto sigue siendo desconocida.
simple, lo que sugiere que los componentes y eventos biológicos están En el caso de células de mamífero, se usa el término "transfección" en
involucrados en este tipo de transformación.14,15 lugar de transformación. La transferencia de genes mediada por lipoplejos y
Con el fin de dilucidar el mecanismo subyacente, utilizamos este método para poliplexos es útil para la transfección celular, potencialmente para la terapia
determinar la eficiencia de transformación y la frecuencia de aproximadamente génica no viral e implica endocitosis.61-66 Rejman y col.63 concluyeron que los
5.000 cepas en las que se elimina cada uno de los genes no esenciales.35 La lipoplejos ingresan a las células a través de la endocitosis mediada por
endocitosis es una vía de transporte vesicular utilizada por las células eucariotas clatrina, mientras que los poliplexos son captados por 2 rutas endocitóticas,
para internalizar las moléculas de la membrana plasmática, el líquido extracelular una que involucra a las caveolas y la otra a las fosas clatrinvestidas. Hufnagel
y las partículas.54-57 Como se describe a continuación, obtuvimos evidencia de que y col.66 proporcionó evidencia de que la captación de polyplexes también
el ADN ingresa a la célula a través de la invaginación de la membrana endocitótica. implica endocitosis en fase líquida que se considera que es una de las vías
macropinocitóticas. Solo se conoce endocitosis dependiente de clatrina enS.
Nuestra búsqueda integral de transformabilidad inicialmente identificada cerevisiae.57
ella4 y arco18 como mutantes de baja transformabilidad. Usamos el término mejora de la transformabilidad mediante la alteración de la estructura de la

'transformabilidad' para indicar tanto la transformación pared celular. Nosotros identificamos pde2, pmr1 y spf1 como de alta transformabilidad

www.landesbioscience.com Errores de bioingeniería 399

mutantes en S. cerevisiae (higo. 1b).35 los spf1 mutante exhibió la mayor
transformabilidad (higo. 1b). Enpde2, que carece de fosfodiesterasa de
adenosina monofosfato cíclico (cAMP) de alta afinidad, el cAMP basal
está elevado. Por otro lado, elpde1mutante, que carece de cAMP
fosfodiesterasa de baja afinidad (donde el nivel de cAMP no se ve
afectado), mostró transformabilidad normal. Por lo tanto, predecimos
que el cAMP basal elevado mejora la transformabilidad. Aunque la
proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es un objetivo principal de
AMPc en la vía Ras-AMPc,67 no pudimos determinar el objetivo de PKA
porque encontramos msn2, msn4, llanta15 y sok2, en el que se alteran
los factores de transcripción conocidos controlados por PKA, tienen una
capacidad de transformación normal.67 Tomlin y col.68 reportó que pde2
exhibe una alta capacidad de transformación y sensibilidad frente al
choque hipotónico. Estas 2 características también se observan en el
mutante dependiente de sorbitol,srb, que tiene un defecto en la
integridad de la pared celular.68 Además, PDE2es un supresor
multicopia de la dependencia de sorbitol del srbmutante. Por tanto,
Tomlin et al.68 sugirió que la vía Ras / cAMP puede modular la
construcción de la pared celular. Por tanto, proponemos que la alta
transformabilidad depde2 es atribuible a la estructura alterada de la
pared celular.
Spf1, una ATPasa de tipo P ubicada en el retículo endoplásmico (ER), está involucrada
en Ca2+ homeostasis en la sala de emergencias. Pmr1 es un Mn ubicado en Golgi2+/
California2+ ATPasa tipo P. La interrupción deSPF1 o PMR1por lo tanto, altera las funciones
del ER-Golgi, lo que da como resultado una amplia variedad de fenotipos, incluidos
aquellos con estructura de la pared celular alterada.69-71
Descubrimos que la transformabilidad de pde2spf1, pde2pmr1, spf-1pmr1 y
pde2pmr1spf1 no es sinérgicamente más alta que la depde2, pmr1 y spf1, lo
que indica que los efectos de cada eliminación dePDE2, PMR1 y SPF1 no son
aditivos (nuestros datos no publicados). Estos datos sugieren que la
eliminación dePDE2, PMR1 o SPF1 tiene el mismo efecto en las células para
mejorar la transformabilidad. Proponemos que, al menos en el caso despf1,
la estructura alterada de la pared celular, que puede absorber una gran
cantidad de ADN, contribuye a la alta transformabilidad, como se describe en
la siguiente sección.
visualización del proceso de transformación. YOYO-1 es una sonda de
ADN fluorescente impermeable a las células ampliamente utilizada.72
La intercalación de YOYO-1 en ADN de doble hebra aumenta su
intensidad fluorescente en más de 1000 veces.73 Al utilizar este enfoque,
Zheng et al.37 observaron que el ADN plasmídico marcado con YOYO-1
(pUC18) (YOYO-1 / pUC18) se adhiere a la región alrededor de las
células intactas incubadas con PEG, ADN portador monocatenario, LiAc
y YOYO-1 / pUC18 a 30 ° C durante 30 min y luego a 42 ° C durante 15
min. Este hallazgo está de acuerdo con la observación de Gietz et al.10
quien informó que PEG deposita ADN plasmídico radiomarcado en la
superficie celular. Además, después de lavar las células, Zheng et al.37
observaron algunas señales fluorescentes en forma de puntos, que se
consideraron sitios de unión al ADN. Chen y col.38 observaron que
YOYO-1 / pUC18 se adhiere a la región alrededor de los esferoplastos.
También observamos el mismo comportamiento de YOYO-1 / YEp13
después de incubar células intactas con PEG y YOYO-1 / YEp13, que
pueden transformarS. cerevisiae.74 Además, confirmamos que el PEG es
indispensable para la unión de YOYO-1 / YEp13 en las células y su
transformación exitosa.74
como lo demostraron Chen et al.38 Usando YOYO-1 y citometría de
flujo, la incubación de células intactas con LiAc o PEG a 30 ° C
400 Errores de bioingeniería
o se encontró que el tratamiento de las células a 42 ° C (choque térmico)
aumentaba la permeabilidad de las células intactas a YOYO-1.37
Debido a la baja resolución de la microscopía de fluorescencia, no se
obtuvo información sobre la entrada de ADN en las células y la entrega
de ADN al núcleo. Sin embargo, junto con nuestra propuesta de que el
ADN ingresa a las células a través de la invaginación de la membrana
endocitótica, creemos que el ADN adherido a la superficie celular debe
atravesar con éxito la pared celular antes de ingresar a las células a
través de la invaginación de la membrana. En consecuencia,
confirmamos que lavar las células para eliminar YOYO-1 / YEp13 de la
superficie celular reduce la eficiencia de transformación.74
Además, encontramos que (1) las células del mutante de alta
transformabilidad spf1 absorben mucho más YOYO-1 / YEp13 en sus
superficies celulares que las células WT y (2) los esferoplastos de spf1
muestran una transformabilidad normal, lo que sugiere fuertemente que la
estructura alterada de la pared celular de spf1 mejora la transformabilidad.74
Esto significa que el ADN adherido a la pared celular, pero no el ADN en
solución, atraviesa la pared celular y entra en la célula durante la
transformación. Las células intactas con ADN alrededor de sus paredes
celulares generalmente se esparcen en un medio sólido selectivo durante el
procedimiento de transformación. Por tanto, es posible que la entrada de
ADN en las células y la entrega de ADN al núcleo se produzcan
principalmente en células diseminadas en el medio sólido selectivo.
análisis transcripcional del papel de la clavija en la transformación
de células intactas. Descubrimos que la preincubación de intactos
S. cerevisiae Las células con PEG mejoran la eficacia y la frecuencia de
transformación, lo que solo se puede lograr incubando las células con
PEG y ADN, lo que sugiere que el PEG puede provocar una respuesta
intracelular.36 Para comprender esta respuesta, se realizaron análisis de
microarrays y metabolomas.36 El análisis de micromatrices reveló que la
incubación de las células sin PEG provoca la regulación positiva de
varios genes, incluidos los implicados en el metabolismo de la fuente de
carbono (p. Ej., El metabolismo de los ácidos grasos que produce acetil-
CoA) y los implicados en las respuestas al estrés. Contrariamente a este
hallazgo, la incubación de células con PEG no produjo ningún cambio
transcripcional. Estos resultados de microarrays están respaldados por
los resultados del análisis del metaboloma de los metabolitos aniónicos,
lo que implica que el efecto físico del PEG en la membrana celular, en
lugar del efecto del PEG en sí mismo sobre la respuesta intracelular, da
como resultado una alta eficiencia y frecuencia de transformación.
Zheng y col.37 informó que la incubación de células intactas con PEG
aumenta su permeabilidad a YOYO-1. Este efecto puede explicar la
mayor eficiencia y frecuencia de transformación que observamos.36
efectos de liac, choque térmico y clavija sobre la transformación de
células intactas y esferoplastos. Comparamos los efectos de LiAc, choque
térmico y PEG sobre la eficiencia o frecuencia de transformación de células
intactas y esferoplastos (tabla 5). Se requieren LiAc y choque térmico para
mejorar la transformación de células intactas, pero no tienen ningún efecto
sobre la transformación de esferoplastos.2,15,38
lo que implica que el LiAc y el choque térmico ayudan al ADN a atravesar la
pared celular. Esto es congruente con la observación de Zheng et al.37 que
LiAc y el choque térmico aumentan la permeabilidad de las células intactas a
YOYO-1.
El PEG es esencial para la transformación de células intactas. También es
indispensable para la unión de ADN alrededor de células intactas y
volumen 1 número 6
 Cuadro 5. efectos de LiAc, choque térmico y PeG en la transformación de células intactas y esferoplastos

Células intactas Esferoplastos

mejora la eficiencia y frecuencia de la transformación

LiAc Sin efecto sobre la frecuencia de transformación.38
(aunque no indispensable).2,38
aumenta la permeabilidad de las células intactas.37

mejora la eficiencia de la transformación (aunque no indis-

Golpe de calor Sin efecto sobre la eficiencia de transformación.74
pensable).2,15

aumenta la permeabilidad de las células intactas.37

No indispensable para la frecuencia de transformación pero

Clavija indispensable para la eficiencia de la transformación.2,15
realza la frecuencia.38
La preincubación mejora la eficiencia de la transformación y
frecuencia.36

aumenta la permeabilidad de las células intactas.37

indispensable para la unión del ADN.38 indispensable para la unión del ADN.38

esferoplastos.2,15,38 Cabe señalar que el PEG no es indispensable para la

transformación de esferoplastos, pero mejora su frecuencia de
transformación.38 En el caso de las células intactas, la unión del ADN
alrededor de la pared celular es probablemente indispensable para la
transformación. Varios informes sugieren que el ADN adherido, pero no
el ADN en solución, atraviesa la pared celular y entra en la célula a
través de la invaginación de la membrana endocitótica (bajo sumisión).
35,37,74 En los esferoplastos, el ADN en solución puede entrar en las
células sin adherirse alrededor de los esferoplastos en ausencia de PEG.
La unión de ADN alrededor de los esferoplastos puede aumentar la
posibilidad de que el ADN ingrese a la célula a través de la invaginación
de la membrana endocitótica.
También existe la posibilidad de que el PEG actúe directamente sobre la
membrana para mejorar la frecuencia de transformación de los esferoplastos,38
aumentar la permeabilidad de las células intactas,37 y mejorar su eficiencia y
frecuencia de transformación.36 Como se describió anteriormente, revelamos que
el PEG no provocó una respuesta intracelular.36
Figura 2. Mecanismo putativo de S. cerevisiae transformación. El ADN se
Además, el PEG podría deshidratar la membrana,75 elevar la adhiere inicialmente a la pared celular. La PeG es indispensable para esta
temperatura de transición de la fase de gel a fluido de la membrana,76 unión y para la transformación exitosa de células intactas. Posiblemente, PeG
disminuir la fluidez de la membrana,77 y mejorar la también actúa sobre la membrana para aumentar la frecuencia de
permeabilidad de la membrana al Ca2+ y otros iones.78 transformación y la eficiencia, así como la permeabilidad a YOYO-1. El ADN
adherido atraviesa la pared celular. LiAc y el choque térmico ayudan al ADN a
atravesar la pared celular. Luego, el ADN ingresa a la célula a través de la
Conclusión y perspectiva invaginación de la membrana endocitótica. Parte del ADN de los endosomas se
envía a las vacuolas y se digiere. Sin embargo, aún no está clara la forma en
Hemos presentado un modelo del mecanismo de transformación de intactos que el ADN escapa a la digestión, llega al núcleo y entra a través del poro
S. cerevisiae celdas en Figura 2, aunque este mecanismo no está nuclear.

evidenciado de manera convincente. En este modelo, proponemos que (1) el

ADN se adhiere inicialmente a la pared celular, (2) pasa a través de la pared
celular y (3) ingresa a las células a través de la invaginación de la membrana
endocitótica. El PEG es esencial para la unión del ADN. LiAc y el choque
térmico ayudan al ADN a atravesar la pared celular. El PEG posiblemente
también actúa sobre la membrana para aumentar la frecuencia de
transformación y la eficiencia tanto de las células intactas como de los
esferoplastos. El papel del ADN portador aún no se ha dilucidado.
Después de que el ADN ingresa a la célula a través de la invaginación de
la membrana, el ADN de los endosomas se envía a las vacuolas. Por lo tanto,
este ADN debe escapar a la digestión para lograr una transformación
exitosa. Además, tiene que entrar en el núcleo. Sin embargo, los poros
nucleares solo permiten el transporte de moléculas con un tamaño inferior a
70 kDa o un diámetro inferior a 10 nm, que es mucho más pequeño.
que el tamaño del ADN.79 En el caso del sistema de mamíferos,
el escape de ADN de los endosomas (escape endosomal) se
considera significativo para la transfección y se han propuesto
varios modelos de escape endosómico.61 Además, en el sistema
de los mamíferos, se ha propuesto que el ADN entra en el
núcleo durante la mitosis o mediante la fusión de los lipoplejos
con la membrana nuclear.61 En el caso de transformación de
S. cerevisiae, no se dispone de información sobre cómo el ADN llega al
núcleo y entra en él después de entrar en las células. Se requiere más
investigación para comprenderlo y confirmar la exactitud de nuestro
modelo (higo. 2). En particular, la visualización del proceso de
transformación deS. cerevisiae El uso de microscopía electrónica y ADN
marcado es esencial. Además, el análisis cuantitativo

www.landesbioscience.com Errores de bioingeniería 401

de la transformación de S. cerevisiae es requerido. Por ejemplo, en células de
mamíferos, la transfección exitosa puede evaluarse cuantitativamente
mediante clasificación de células activadas por fluorescencia o mediante la
expresión de un gen indicador.63 Por el contrario, la transformación exitosa
de S. cerevisiae solo se puede controlar contando el número de
transformantes y células viables, lo que requiere de 3 a 4 días y es menos
cuantitativo que los métodos utilizados para el sistema de mamíferos.
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402
Transformación de S. cerevisiae y otros hongos es indispensable
para manipular estos organismos. Sin embargo, el mecanismo
subyacente a la transformación aún se desconoce.S. cerevisiae tiene
muchas ventajas como organismo modelo y se puede utilizar para
comprender el mecanismo de transformación. La elucidación del
mecanismo contribuirá a aumentar la eficiencia de transformación de
los hongos y aclarar el mecanismo subyacente a la transfección de
mamíferos.
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