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UNIDAD 01
Semana 03
Semana 03

MICRE
50810

Curso:
o "a

EECEA
EA
Biotecnología Ambiental
H. OSORIO
H. OSORIO T.
T.
 EVOLUCIÓN DE LOS CULTIVOS
CELULARES

*% F.D. Von Recklinhausen (1.866) ===»>

*« ===»>. mantuvo
ww» vivas
células sanguíneas de anfibios durante 35 días.

%« Wilhelm Roux (1.885) www») realizó cultivos de células

de embrión de pollo en solución salina.

%%wY Ross Harrison (1.907) mm»)

mw» cultivó tejido nervioso de
rana y obtuvo crecimiento y diferenciación de los axones.

«<Y Burrows (1.910) ww)»

ww) empleó plasma de pollo para
nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo.
 EVOLUCIÓN DE LOS CULTIVOS
CELULARES
« NS
Alexis Carrell (1.912)
O ERRANTE
MIN ww) demostró Oque
IEAla vida
E
ES del
cultivo se puede prolongar mediante subcultivos aplicando
técnicas
CA
CA ESE asépticas.
ESSE

E%ww EI
Eagle (1.955) www»
www) desarrolló ER
medios RATO
de cultivo.

% Hayflick yRADAR
EN Moorhead (1.961 ) ww» implementaron
NBI EAN el uso
Td doo
oido
ollo

% Moscona (1.952) www)»

www) utilizó técnicas de tripsinización
para disociar células.
 CONCEPTOS Y DEFINICIONES

Cultivo Celular: Conjunto de técnicas que permiten el

mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo
sus propiedades fisiológicas,
RA bioquímicas yNA genéticas.
io

Cultivo de
Cultivo de Órganos
Órganos yy Tejidos:
Tejidos: Cultivo
Cultivo y/o
y/o mantenimiento
mantenimiento de
de
AM ARE
ARRIETA
AREA AAN E
UTA
UA RITA
ITA
IEA

¡AUN MATTE
MRE
MATTE RA NI IA NAME
MATEO
organizadas en tejidos, incluyendo el cultivo de células
Lalo
 CONCEPTOS Y DEFINICIONES

Tipos de Cultivos Celulares

> Cultivos Elis
OIM cli
Primarios
> Línea Celular

Cultivos Primarios: Cultivo de células, tejidos u órganos

tomados
(o directamente
A NR del MN
organismo y puestos
IIA MA
a MAA
crecer en O
un
Moe
Miel
Mel
 CONCEPTOS Y DEFINICIONES

Línea Celular: Cultivo celular que tiene alta capacidad de

NI
multiplicarse in vitro,ME establecido
A a partir del primerE subcultivo
AiO
ANN
de un cultivo primario y que RAE tiene las mismas
EU E características
aci
URACRIA Mein meo Moein
Me ein

o Línea celular continua: Línea celular que ha

demostrado posibilidades de ser subcultivada in vitro
por lo menos 70 veces (270 subcultivos)
indefinidamente.
io
NA

O Línea celular finita: Línea celular que tiene un

número limitado de posibles subcultivos (alrededor de
50)
 CONCEPTOS Y DEFINICIONES
Líneas celulares diploides: El 75% de la población celular
II
¡CIR RAMTM TRE ERAN
TRES AS NE
NE ERES
ESE
RESTA RES TA
TA
elilor=i9R
origen.

Líneas celulares heteroploides: Tienen menos del 75% de las

células con cromosomas diploides.

RSS o TA
Pasaje AN
subcultivo: SERA
Transplante de células
NENE de un envase de
UM
UM OS

Número de subcultivos: Número de veces que las células

ESSE
ETE Teen
Aloe
 do ee]
eooO
OA MN
* Crecimiento en monocapa. Las células se adhieren al
sustrato, creciendo y dividiéndose en una única capa celular
(monocapa). Puede ser:

* Estacionario: Las células incubadas sin agitación,

sedimentan y Ase adhieren
STAN NIN al fondo del envase,
ESSE usualmente
INE
[Eo
liso.
OJO]
OE (Oli1 TO%
To% Envase de cultivo cilíndrico, que gira
lentamente de modo que las células se unen a la superficie
ME del frasco.
interna Ric

« Crecimiento en suspensión. Las células se multiplican en

EE
MEE TS
ETS
 VENTAJAS DE LOS CULTIVOS
CELULARES

OM
OM lo A AE OM
AE Mel
medio en el que se cultivan las células.

% Las células en cultivo asumen una constitución

homogénea, evitando el problema inherente a la
heterogeneidad de las muestras asociado al uso de
MIRAR
ARMAR
IRIS TS leon le olAn

% Economía
*% en ensayos de reactivos o drogas a
UE
OU Ele
EA
 DESVENTAJAS DE LOS
MAA)
MARIANO) ROCA
CULTIVOS
O
CELULARES

TAE
STATE
SNAltos
*« NL CON OO
costos para
os
ls LO Oproducir
Lolo
LOTO [OOO
[OLOT MOTE
una pequeña
TOO UA Morcantidad
Ta Lio de
Tomo
Tool
células.
« Pérdida
MS SAM irreversible
EE de las rolls
propiedades
o eel
funcionales de
las células.
* Dificultad MARA
*< en relacionar células
NE RAcultivadas
NAME con las células
ASES
¡ERA
¡NEAR
¡NARA el
e
ll
ol IEEE
IEEEEi
IEEE ie
io Mt
MtTE rl lOlO
lr
varios pases.
*«+ Validez del modelo
*% in vitro.
 LOS CULTIVOS CELULARES Y SU
eN
¡ne
NN

Factores:

EME 22 ICI

¡APIS
¡ANI o AE
E(ole Ola]!
ola]!
MAMAA
MIRA
EAN
lA RAEE TOS
Rd ote
ote [ola
ola
 Naturaleza del sustrato

Capacidad de las células para adherirse al sustrato

ATAR PAS
SPA RIN ESA
RINES

Tipos de sustrato
a. Vidrio.
A To LAA
Bajo costo, fácil limpieza
o A y ESE
esterilización.
lao olaR
. Plástico desechable. Material descartable y
mola elote
o
ol elote
tell oah
oa%
lolAR
. Microsoportes.
LE IS Soportes EN plásticos
E esféricos a
¡llos!
AMAN
MAINE
AMA EEES
EAS
 ¡eCondiciones
AE fisicoquímicas
a yEN
fisiológicas del medio de cultivo

ly
[y
pH
¡eS
¡eEElle
Elle
Sales inorgánicas (mantienen el medio isotónico)
Glucosa (fuente de energía)
AAA
A RR AR
ARA A SN
la síntesis de proteínas)
AMS
All)
A Mel)
 ¡RAS
¡RAS
¡ANA A EA
fisiológicas del medio de cultivo

>>» Suero (biosíntesis celular, promueve el

ANI
crecimiento, EME
estimula la E ANDINA ARN
síntesis de ADN, NY y
NU
proteínas, y facilita la adhesión al sustrato por
ME
MEN EA

> Antibióticos: — (evita el desarrollo de

contaminantes microbianos en el cultivo).

NE
Nai
Na ra ERA ERARA rie le r=0A
r=9h
ras ler=0A
 Naturaleza y composición
de la fase gaseosa

La supervivencia de las células depende de la

LETAL
ET
EST TAE
AER ANN
RAN A TM To ESMAS
MSM
MESAS
RO
Ro
MO

Oxígeno: El área de superficie del medio debe ser

EM lle ol ies
ESTO
ie lis TAO
Tam O [Or
[ar slo
slo TOO
TO]
TO] elo
pelo[ol Te IU
IeIe Ur To
Te Melo
MolS
oo
To

Dióxido de carbono: influye en la cantidad de CO,

disuelto, mantiene el pH y la cantidad de ¡ones
bicarbonato.
 Temperatura de Incubación

YATemperaturas
DETER por encima
AEREA de la temperatura o
óptima MOS
de
crecimiento
Aa RN
AA destruyen aEElas células.
ASES
ASEO

ME
MEA
E EAE NM EA OO
O E
OE
SUMATE
JM ALTEA

Y La temperatura óptima para el crecimiento celular

AT MA MO MMIOIMO ro TMTorn rT0N ri0n

Tejidos de aves y mamíferos: 36-38%C

IIA
¡OA
IAEA ETA
EA TAIANA ELO
 CONTROL DE LOS MEDIOS

ANA
AER
AER NA AAole
ole
AA
AO
HOT ARNES
TRES
RIRS
ele
ete
OT
AT RRA ANNA
A NANA o le
4 ATINA
Conservación AAlos ios
de
A os
medios
 ¡ASMA
¡SMA
¡SMA ee Te

oo
oo o A A SERE EPREARSE lira oo
oo
io om ee
Ree
eS
detecten posibles contaminantes: bacterias
aerobias y anaerobias, levaduras, hongos y
lle
micoplasmas.
Mid

¡AV
¡ERA ER EAO ir
rz Tolo
lo (or
lor
1 loo
lolo lo
loo ll TM Mm lero
rrolr rLo ln
triptosa fosfato, tripticasa de soya, maltosado
ST
Solololo UF
lolo UOR
UE 1UOR
*Agares: nutritivo, sangre, Sabouraud glucosado.
 [ASSIM
[ANSIA le Te
To

« Se inoculan los medios con muestras (medios de

cultivo u otras soluciones) y se incuban a 37%C y
temperatura
Cid ambiente,
NR durante
ET un período no menor ml
de
10
(LOMAS
LOMO días.

LE Mo
Mo Le
EME
EM ER
ER O
SE IEA
EEES
EIA
un 10%.

% ETA EM
Se efectúan pruebas confirmatorias,
il alo
ale [U[UNT
NETA
ploTo (oO una
incluyendo pts
0 LMC MC A ICAA
MS ICAA NE
¡Ncde contaminación.
fuente Aroa
 Conservación de los medios

>» E
A A
Los medios son Ealmacenados
AEa bajas temperaturas
ENEENE
(4-8%C).

>» Soluciones que favorezcan el crecimiento

bacteriano deben almacenarse estériles.

> Evitar o acortar la exposición de los medios a la

All MEA EIA
IA
 IN
IE o MM
MT o RA RAT
AUS
celulares y preparación de medios

>Ambiente controlado de presión, temperatura,

SINN ARI
SANA AI
ARI NE

pS TEM
MATEO OOOO
IU oli
UTM ole
A ole
lola Mol
aire filtrado (filtros HEPA).
ci AYYA

>Presión atmosférica positiva (entre 15 y 20 mm de

nleph
Hg).
mleph
E
IR oe A
AM RAT
celulares y preparación de medios

AITANA
TARA
AITANA o
oo lolas
jolla
jolla: o ¡loe
¡oe
además de desinfecciones diarias con luz uv.

>Equipos y materiales utilizados sólo para cultivo

celular.

pd
UN
UREA
REE eee
EEE ollo
eee lA
 Área de lavado y preparación de
material

AENA IS
AENA A IR CIERRA
IE
ECM ROA NA ER
ES
para ser esterilizado y posteriormente utilizado en el
cultivo de las líneas celulares.

9ElEl material debe ser puesto en agua

inmediatamente después de su uso, se lava con
ATANASIO
LATA
detergente especial para MAMAS
cultivo celularRAEy se UE Te
enjuaga
NEIRA
NIE IEEE ERA E SE
 TARA
Equipos que debe
TRAE tener un laboratorio
SEN de
cultivo celular

laminar
Cabinas de flujo AT RELICCN))
ENTES REACCION
congeladores
Centrífugas refrigeradas Baños de MAJA

Microscopios o lupas eS
ASA invertidas Agitadores magnéticos

Estufas con NAMOOS

WEA y sin CO, : - A
Equipos de esterilización:
pHmetro hornos, autoclaves

Pipeteadores TEA
TEA an
ca

ARS
AR ito Neveras
de agua
 Preparación de las células

ER RT AUTE
AUTLE
* Tipo de célula
*e Condiciones de crecimiento
e Estado fisiológico de las células
*e Cantidad de células presentes en la suspensión celular

TASAS
TA SARA NS Ace
Ae
Aces
CPES
CPES NENA
NENA LEEN
 Preparación de las células

% Reducir el número de pases a partir de la

muestra
MI
AI originalMAT
MAT
certificada.
iitesToTo A
ie

«%« Ajustar las poblaciones de células animales a

concentraciones que garanticen recuperar una
MAMANI
MNAE
MAME Noel
ole
olle
 MM
UAM
AM ANS
ANS Ae
Aeea

y Medio de crecimiento con 2 veces la

concentración normal de suero + glicerina y/o DMSO al
5-10%.

y> El agente crioprotector debe ser diluido

previamente a la concentración deseada en el medio de
crecimiento para minimizar los efectos nocivos.
 dodo
TT
AT E More
METAL
META

E Al tripsinizar
*%
A SA lasERAN
E células,
ERES
se resuspenden en el elo
medio de
mS
Y

eel
congelación.
elle lil o]9N
o]9h

EDITA ARNES
ESOS
EDITAR
Y
MNR NN
SANS
ANN ESE
ESAS
EE AS
y/o viales plásticos o crioviales.

AMARA Riot
AAA Rio
Riola Tetela
Tetela
lela
de cristales que rompan las células

J]0
DONNA
Disminuir 1%C por minuto
1?C NEhasta llegar
ER a -20%C
OOO o 25%C y
luego congelando rápidamente hasta -70%C o temperaturas
inferiores
 Condiciones
ARS
¡ARS de almacenamiento
AT
ATI lo

Condiciones de almacenamiento Sobrevivencia

%«Y Nitrógeno
¡Mo[U [elo
Líquido SENO
RIO

Gas -150% a 0
O -180%CO

%« Congelador
JA a -80%C
IE
-70% (MI
ST A A AE TÍO
4 TOS
TOS

ro a Eo
-45% o O
-65C 6 meses a 1 año
 TN
Proceso de descongelación
TAN
TAN NÓ
N3ÓE AA

Y La descongelación debe ser rápida (agitar en baño

de María a 37*C).

A
YALimpiar
TN RNenvases
los EIA con ollo
alcohol alEEIA
IAOA
70%.

MASA TEAM
Y” Resuspender las células en el MATA Eo
medio de crecimiento
NM NS
A
AS LA EA

TA TASA
TA AE EErslip Lip
Lip asa= MoMOTO
eT0TO reia
Mei
Moo =lLo
=lLo
lpo
de
ARI
ARIAS
pases para
AR evitar
E ecambios
e llo morfológicos,
A pérdida Mos MOS
de
susceptibilidad viral y pérdida de las células por
A
 CONGELACIÓN
Ao NATA MoHACULTIVOS
DE AOS
CELULARES

« Selección de los cultivos en la fase logarítmica activa

«*

OE
Oo AE

* Uso de D.M.S.O o glicerina al 5% o 10%

oSA NS

EE MTMOTE!

DA
DT olle
atole
CARACTERIZACIÓN DE LOS CULTIVOS
CELULARES

Correlación con el tejido de origen para:

. Identificar el linaje al que la célula pertenece
. determinar la posición de las células dentro de ese linaje
siJETA
ITAson células
NE Elotransformadas o no

MTRS
MTRS PERS
PERS AN cla
El alle

Willlol
lo MoMo Meat
Metal
Metalero
lalo Miralo
Miralo
Mpio oie
oirlo MolS
MOS
las especies de origen.

it
diiio MAS EEES
EEES TA EMS
ES
AMM
PM LME
E
 CARACTERIZACIÓN DE LOS
CULTIVOS CELULARES

Cultivo iniciador

|
¡eolica
Control de contaminantes
LT arios ¡cedo
Muestra
IRA congelada
do ——>
Verificación de especies
Isoenzimología
Cariología
Semilla celular descongelada

¡Ae!
Ae!
Ensayos A inmunológicos
0 lo (oo os
Banco
MANE Celular Maestro ———> MI E!
AE!
AS |]] verificar fuente
Urol
lot ol
Aloe
Alo Banco Celular de Trabajo
Microscopía electrónica
 CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS
CELULARES

Los agentes más

MEETS EEE usuales de contaminar
e los
AO
cultivos
AIMAR
NARRAN celulares
IS son:

Arce
lA riE
AE
« Hongos
ERAS
ERASE y levaduras
dE o LEEN
SEVA
AVES
VAS
doy
doy
oo y 40140
Lor
AO IalOS
140
Oleo
OTOo Tio lol MA
MAReyes
pUpU yA
rd TOOOE!E!
 AM
Fuentes
UM deMON
MOContaminación
TalaTalarrtetetola
lola

Tejidos y células contaminadas

¡EEEde cultivoo)
Medios
Personal de laboratorio
AR ASE
Medio ambiente
Eo

ST UT MAMio Miloio oh
Y Empleo de procedimientos efectivos, estandarizados y
CARNAL SRA NS IERES
ERES LAS PNS
contaminación.
ole Talar le lolAr

Y Mantener
NE una lo
vigilancia continua
Ulea para verificar el manejo
TOO)
adecuado de los cultivos celulares.
 TA
Características
TA RE
de la
Alea
ela lelela

. OCambios
O NAAA
ARANA
bruscos de pH

. Turbidez del medio

. Se observan gránulos en los espacios intercelulares de

la monocapa y en el sobrenadante.

. Contaminación bacteriana se observa uniforme y

1000
lo JU lpLOTTO
loTo FTAs
TO oAA
 Dto
DT Me
Mo AMO AS
AOS LAS

%* No
NDANM existe un medio NAM
MIR
único que permita elERRATA
RAT
crecimiento de
MA A toos
todos
oleo
[IS
[INS

Ulla
lll lM
l AMATOTO
MATO ER
ERER

= Observación del cultivo a simple vista o a través del

microscopio.
ler

" Uso de múltiples medios de cultivo para la siembra de

muestras.

""= Empleo de procedimientos que aumenten el desarrollo de los

lero
lero eS os os

= Identificación por técnicas especiales.

 , 3<8
ao
5 3
¡En

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33
E arigató
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E
Schoukrane
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E choukrane Dakujem

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Cinphtuyiaii:
Cola
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Picaflor admirable (Loddigesia mirabilis)