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Daniel Esquivel Alvarado, Gerardo Rodríguez Rodríguez, Sergio Madrigal Carballo 304
UNICIENCIA Vol. 27, No. 1, [304-318]. Enero – junio 2013 ISSN 1101 – 0275
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ABSTRACT: The purpose of this research work was in the first instance, to
conduct a study of the content of phyllantosides and lignans in samples from
different parts of the tree known as “Chilillo” (Phyllanthus acuminatus Vahl),
collected at different sites of the country. The first objective of the study was
focused on the characterization of the samples using high efficiency liquid
chromatography (HPLC). The results obtained by this technique showed variation
not only in the number of peaks in each chromatogram, but also in the peak
intensity, also significant variations in the composition of the samples were found
among the different collecting sites. The second objective of this work, was to
develop a simple, fast and inexpensive colorimetric method to quantify the content
of phyllantosides and lignans in different samples of Chilillo that was comparable
to the HPLC data. The results obtained with the new method were correlated with
the results obtained by HPLC, the coefficient of determination obtained in this
correlation was excellent and statistically significant (R2 = 0,99; p < 0,05). Finally,
the last objective of the study was to evaluate the antioxidant activity in all the
samples of Chilillo and its correlation with its total polyphenolic content, using the
free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) for antioxidant activity
determinations and Folin-Ciocalteu for total polyphenolic content. Traditionally
there is a good correlation between total polyphenol content and antioxidant
activity, but in this study the correlation between the two methods was relatively
low (R2 = 0.4334). These results clearly show that Chilillo tree can not be consider
as an important source of polyphenols or natural antioxidants, especially when
compared with other plant samples rich in phenolic compounds such as blackberry
(Rubus sp) or rambutan (Nephelium lappaceum).
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El presente trabajo tiene como objetivo realizar una bioprospección del árbol de
chilillo (Phyllantus acuminatus Vahl) con el propósito de identificar, en forma
cuantitativa, la presencia de sustancias activas de interés biológico en esta especie
(antineoplásicas y antioxidantes). Se realizó un muestreo del árbol en diferentes sitios
geográficos donde crece esta especie y se procedió a realizar extracciones con diferentes
disolventes para determinar la mezcla óptima que permite la extracción del mayor
contenido de metabolitos secundarios. Una vez optimizado el proceso de extracción, se
realizó un estudio cuantitativo orientado a desarrollar un método analítico colorimétrico
rápido y económico para la cuantificación química de metabolitos no fenólicos como los
filantósidos y los lignanos, responsables de la actividad antineoplásica, presentes
igualmente en los extractos del árbol de chilillo. Este nuevo método en desarrollo sería
comparado con un ensayo paralelo, pero empleando la técnica de cromatografía liquida
en fase reversa de alta eficiencia (RP-HPLC) para evaluar su eficiencia. Finalmente, se
procedió a determinar el contenido total de polifenoles y la actividad antioxidante de los
extractos, con el empleo del método de Folin Ciocalteu y de radical libre 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH), respectivamente.
MATERIALES Y MÉTODOS
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Tabla 1
Sitios en el país en donde se realizó el muestreo del árbol de chilillo (Phyllanthus
acuminatus Vahl)
Lugar Latitud Longitud
Tucurrique de Cartago 9°51’10.82”N 83°43’01.25”O
Grecia de Alajuela 10°02’56.59” N 84°16’39.68” O
San Isidro de Dota. San José 9°29’06.54” N 84°00’28.93” O
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metanol disolvente B. El gradiente de elución estuvo formado por una serie de pasos: de
40% a 30% A durante 4 min, de 30% a 10% A durante 6 min, se mantuvo a 10% A por
2 min, de 10% a 0% A durante 2 min y de 0% a 40% A en los últimos 2 minutos, para
un tiempo total de corrida de 16 min. La longitud de onda (λ) empleada para monitorear
el cromatograma fue de 277 nm, y se utilizó el software Shimadzu LC Solution para
procesar y analizar los cromatogramas en dos y tres dimensiones.
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Análisis estadístico
El análisis estadístico de los resultados obtenidos debido a los tratamientos
aplicados a las muestras se realizó empleando un ensayo ANOVA, y la diferencia entre
los tratamientos se determinó por medio de la prueba de medias de Tukey, ambos
utilizando el programa estadístico ASSISTAT®.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la investigación fitoquímica cuantitativa es fundamental no solo una buena
escogencia del disolvente o de la mezcla de disolventes para extraer eficientemente los
metabolitos de interés, sino también el número de extracciones a realizar a las muestras.
Para lograr este objetivo se probaron diferentes disolventes y mezclas de estos, al igual
se probaron diferentes números de extracciones para obtener la máxima eficiencia de
extracción de filantósidos, lignanos y compuestos fenólicos.
Los resultados obtenidos sobre el mejor disolvente indican que una mezcla de
disolventes es lo mejor y se encontró que la combinación: diclorometano:metanol (1:1
v/v) es la más eficiente. Tomando en cuenta este resultado de solubilidad y la
posibilidad de realizar varias extracciones, se realizó un análisis de varianza
completamente al azar, con el propósito de determinar el número óptimo. Los resultados
obtenidos mostraron que para todas las partes del árbol de chilillo a las cuales se le
realizaron 5 extracciones, y de acuerdo con los tratamientos de medias obtenidas, se
determinó, para la raíz, tallo y hojas, el número óptimo de extracciones con la mezcla
diclorometano:metanol (1:1 v/v), es de 3, 4 y 2, respectivamente.
Tabla 2
Resultados del análisis espectroscópico realizado a 277* nm para la determinación del
número óptimo de extracciones efectuadas a la raíz de chilillo, empleando la mezcla
diclorometano:metanol (1:1 v/v) como disolvente
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En este estudio también se encontró que durante los muestreos de las raíces del
árbol de chilillo de diferentes localidades del país, no todas las muestras presentaban el
mismo grosor, por lo tanto, se procedió a realizar una pequeña comparación de acuerdo
con el diámetro de la raíz. Al respecto se encontraron diferencias cualitativas y
cuantitativas en cuanto a la presencia de los metabolitos secundarios, como se puede
observar en la figura 5.
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Una vez obtenidos los cromatogramas de las diferentes muestras en relación con
las partes seleccionadas del árbol de chilillo y sus respectivos sitios de colecta, se
procedió a determinar las áreas totales de los picos correspondientes a los metabolitos
secundarios presentes. Se confirmaron diferencias entre las partes del árbol, sitio de
muestreo y el grosor de las raíces. Se debe entender que el área de los picos es
proporcional a la concentración de los metabolitos secundarios representados en cada
pico del cromatograma.
En la siguiente figura 6 se representan las áreas totales de los cromatogramas,
los cuales corresponden al contenido total de metabolitos secundarios en relación con la
parte de la planta (raíz o tallo) y del sitio de recolección del material vegetal analizado.
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CONCLUSIONES
Los resultados evidencian que la mezcla de disolventes idónea para extraer
cuantitativamente los filantósidos y lignanos presentes en las diferentes partes del árbol
de chilillo, resultó ser la combinación de diclorometano:metanol (1:1 v/v). También se
encontró que el número de extracciones óptimas a realizar al tallo, raíz y hojas del árbol
de chilillo, resultó ser de 4, 3 y 2 respectivamente.
A partir del análisis cuantitativo de metabolitos secundarios, mediante el método
de cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC), se determinó que
la muestra de raíz de San Isidro de Dota presentó la máxima concentración (expresada
en unidades de área), mientras que todas las muestras de tallo, sin importar el sitio de
muestreo, resultaron ser despreciables con respecto al contenido de filantósidos y
lignanos.
Se logró obtener un excelente coeficiente de determinación (R2= 0,989) para el
análisis de correlación entre el método espectrofotométrico y la técnica de
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el financiamiento del Fondo FEES del Consejo Nacional
de Rectores (CONARE), por medio del cual fue posible completar las actividades
descritas en el presente trabajo.
REFERENCIAS
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