EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR MEDIANTE TINCIÓN FDA

Determinar si las células de las algas están vivas o muertas es útil para una variedad de
aplicaciones que incluyen, entre otras: análisis de aguas residuales, pruebas de alguicidas,
experimentos de mesocosmos y monitoreo del agua de lastre. La tinción de viabilidad es un
enfoque común utilizado en citometría de flujo para evaluar la abundancia relativa de células vivas
y muertas en una muestra. La FlowCam 8400, equipada con un láser, una cámara digital y 2
canales de detección de fluorescencia, se puede combinar con varias tinciones fluorescentes para
evaluar la viabilidad de las células de las algas. En esta nota de aplicación, describimos cómo
emparejar un ejemplo de una de estas tinciones, el diacetato de fluoresceína (FDA), con la
FlowCam 8400 equipada con un láser azul de 488 nm.

La FDA en sí misma no es una molécula fluorescente. Sin embargo, cuando una célula viva con
enzimas de hidrólisis activa se encuentra con la FDA en una muestra acuosa, la célula convierte a
la FDA en isotiocianato de fluoresceína (FITC), una molécula que tiene una fluorescencia verde. Si
una célula está viva y su membrana está intacta, emitirá una señal de fluorescencia verde cuando
sea activada por el láser de FlowCam. Las células muertas también pueden seguir emitiendo
fluorescencia verde, pero lo harán a niveles más bajos que las células vivas.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Esta nota de aplicación contiene datos de dos experimentos: uno usando un cultivo del alga verde
Staurastrum y el otro a partir de una muestra natural recolectada de un pequeño estanque
eutrófico.

1. Para preparar la solución madre primaria de la FDA, mezcle DMSO para formar una solución de
5 mg / ml. A continuación, prepare un caldo de trabajo mezclando 25 µL del caldo primario con 10
ml de agua desionizada y almacénelo a 4 ° C.

2. Filtre el cultivo y la muestra del estanque a través de un colador de 70 µm para asegurarse de

que no haya partículas grandes que obstruyan la celda de flujo.

3. Teñir dos alícuotas de 10 ml del cultivo de Straurastrum y la muestra del estanque. Se utilizará
una alícuota de cada muestra para analizar las células vivas y la otra para analizar las células
muertas. Para matar las células en cada una de las dos alícuotas de "prueba muerta", incube las
muestras en un baño de agua a 70-90 ° C durante 30 minutos.

4. Una vez preparadas las muestras de algas, agregue una alícuota de 250 µL de la solución de
trabajo FDA a 1 ml de cada muestra e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10
minutos.

PROCEDIMIENTO DE FLOWCAM

Después de la incubación, procese cada muestra en una FlowCam 8400 con un láser de 488 nm en
modo de disparo utilizando el campo de visión con objetivo 10X, celda de flujo de 100 µm y jeringa
de 1,0 ml.
Cuando se opera la FlowCam en modo Disparo, las celdas que contienen niveles suficientes de
clorofila o FDA “dispararán” la cámara para capturar una imagen. Dado que FlowCam 8400
contiene dos detectores de emisión separados, puede registrar simultáneamente la fluorescencia
relativa de las células para la clorofila (designada en la hoja de cálculo visual como Canal 1) y la
emisión verde de células vivas teñidas con FDA (Canal 2). El canal 1 detecta emisiones superiores a
650 nm y el canal 2 detecta emisiones de 510 nm a 540 nm.

ANÁLISIS

La Figura 1 muestra los resultados del experimento Staurastrum vivo vs. muerto. El gráfico
muestra la frecuencia de las células de Staurastrum que emitieron suficiente fluorescencia verde
para ser detectadas por el Canal 2 (CH2).

Figura 1. Comparación de células de Staurastrum vivas y muertas teñidas con FDA

Las barras azules en el gráfico de la Figura 1 representan células del cultivo vivo y las barras rojas
indican células del cultivo muerto. La mayor frecuencia de emisión de fluorescencia en las células
vivas indica que esas células absorbieron la tinción de la FDA. Lo contrario es cierto para las células
muertas, que no absorbieron la FDA con tanta frecuencia.

La Figura 1 también incluye imágenes de ejemplo de las muestras vivas y muertas. La similitud de
los dos collages ilustra que no se puede evaluar la viabilidad celular con solo mirar las imágenes.
Por lo tanto, se requiere fluorescencia para diferenciar entre vivos y células muertas.

La Figura 2 muestra resultados similares para la muestra natural obtenida del estanque. Como
vimos con la muestra cultivada de Staurastrum, las células vivas teñidas con FDA exhiben una
mayor detección general del Canal 2 (fluorescencia verde) en comparación con las células muertas
teñidas con FDA.
Figura 2. Comparación de muestras de estanques vivos y muertos teñidos con FDA

En algunas aplicaciones, la FDA produce un precipitado que también es fluorescente. Esto ocurrió
con la muestra del estanque (Figura 3). Incluir los recuentos de datos de precipitados sesgaría los
resultados al contar células vivas. Afortunadamente, con FlowCam, el usuario puede utilizar las
capacidades de reconocimiento de imágenes del software VisualSpreadsheet® de FlowCam para
identificar imágenes precipitadas y eliminarlas de los recuentos de células vivas.

Figura 3. Imágenes de ejemplo del precipitado FDA encontrado en la muestra del estanque que también
presenta una fluorescencia verde. Estas partículas se pueden seleccionar automáticamente mediante el
algoritmo de reconocimiento de imágenes de VisualSpreadsheet para producir concentraciones precisas de
células vivas.

RESUMEN

Esta nota de aplicación muestra cómo se puede utilizar la FDA para evaluar células vivas frente a
células muertas en poblaciones mixtas. Se utilizaron cultivos y muestras naturales para demostrar
el uso de la tinción FDA cuando se analizaron con una FlowCam 8400 equipada con un láser de 488
nm.

Hay varias otras tinciones fluorescentes y tinciones colorimétricas simples que se pueden usar
para evaluar tanto las células vivas como las muertas cuando se usa una FlowCam, que incluyen:

• ThermoFisher LIVE DEAD®

Kit de tinción de células muertas verdes reparables (excitación de 488 nm)

• ThermoFisher LIVE DEAD®

Kit de tinción de células muertas rojas reparables (excitación de 633 nm)

• Tinte Sytox Green DEAD CELL (excitación de 488 nm)

• Rojo Neutro - Tinte Colormétrico Vital

• Azul de metileno - Mancha muerta colormétrica (para análisis de viabilidad de levadura)