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abierto
src en las membranas endosomales
promueve la secreción de exosomas y la
progresión del tumor
Recibido: 18 de julio de 2018
tomoya Hikita1,Atsushi Kuwahara1,2, RisayoWatanabe1, MamikoMiyata1 y
Aceptado: 30 de octubre de 2018 Chitoseoneyama 1,2,3
Publicado: xx xx xxxx
c-src es la tirosina quinasa asociada a una membrana que desempeña un papel clave en la transducción de
señalización que controla el crecimiento, la adhesión y la migración celular. En la etapa inicial de la carcinogénesis, c-
src se activa bajo la membrana plasmática y transduce señales oncogénicas. Aquí mostramos que c-src localizado en la
membrana endosomal tiene funciones únicas en células transformadas con c-src. Nuestros resultados indican que c-
src activado en la membrana endosomal promovió la secreción de exosomas, en los cuales c-src fue
encapsulado. Además, la molécula que interactúa con ESCRT, Alix, fue identificada como una proteína que
interactúa con c-Src en los exosomas. Revelamos que la interacción entre el dominio SH3 de c-Src y la prolina.
La región rica de Alix activa la formación de vesículas intraluminales (ILV) mediada por esCRt, lo que da como resultado la regulación
al alza de la secreción de exosomas en las células transformadas con c-src. También observamos una correlación entre los fenotipos
malignos y la secreción aberrante de exosomas dependiente de Alix insrc-upregulated células cancerosas .
En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan un mecanismo único para la regulación positiva de los exosomas en las células cancerosas, así
como nuevos conocimientos sobre la importancia de la secreción de exosomas en la progresión del cáncer.
c-src es el primer protooncogén identificado y su producto es una tirosina quinasa de tipo no receptor asociada a la membrana1,2.
Los estudios han demostrado que c-Src desempeña un papel fundamental en la transducción de señales relacionadas con la
supervivencia celular, la proliferación y la motilidad.3-5. Además, la expresión y actividad de c-Src se mejora con frecuencia en varios
cánceres humanos, lo que sugiere que desempeña un papel en el desarrollo del cáncer.6-8. Sin embargo, la mutación del c-src El
gen rara vez se observa en el tejido tumoral.9,10. En las células normales, la actividad de c-Src está estrictamente controlada por Csk,
y se ha sugerido que la ruptura del sistema regulador de c-Src puede conducir al desarrollo de cáncer.11,12. Se sabe que c-Src se
asocia con la membrana plasmática a través de miristoilación para transmitir señales desde el exterior al interior de las células.2. La
evidencia de estudios previos, incluido el nuestro, ha sugerido que c-Src se activa debajo de la membrana plasmática en la etapa
temprana de la carcinogénesis y transmite señales oncogénicas.13. Por otro lado, también se ha informado que c-Src se localiza y
funciona no solo en la membrana plasmática, sino también en la membrana interna, incluida la membrana endosomal.14,15. Sin
embargo, aunque algunos informes han investigado la regulación de su localización, no se comprende bien la importancia
funcional de la c-Src endosómica en el cáncer.
Los exosomas son vesículas de la membrana extracelular que se cree que se derivan de los endosomas y que se cree que son
responsables de la comunicación intercelular.5,dieciséis. De hecho, la información se puede transferir entre las células mediante
moléculas como proteínas, lípidos y miARN en los exosomas.17,18. Los exosomas son secretados por varias células, incluidas las
células cancerosas, para regular el entorno microscópico local.19,20. Además, los exosomas pueden transmitirse a sitios distantes a
través del torrente sanguíneo donde pueden contribuir a la formación de nichos premetastásicos.20,21. Estos hallazgos sugieren
fuertemente que los exosomas son importantes para el desarrollo del cáncer. Dado que la cantidad y el contenido de los
exosomas cambia en el cáncer, las biopsias líquidas que utilizan exosomas para el diagnóstico del cáncer han atraído cada vez
más atención.22. Sin embargo, quedan una serie de preguntas sin resolver sobre cómo se forman los exosomas a partir de los
endosomas y dónde se carga y secreta su carga.23. Además, los mecanismos por los que cambian y la importancia biológica de la
regulación positiva de exosomas en el cáncer sigue siendo difícil de alcanzar.24.
En este estudio, primero examinamos la localización de c-Src activado usando Csk- / - células, que se vuelven cancerosas por la
activación de Src13, y encontró que c-Src se localiza no solo en la adhesión focal, sino también en las membranas endosomales.
Tales células mostraron una mayor secreción de exosomas en los que se encapsularon moléculas Src activadas. En
1División de Regulación de células cancerosas, Instituto de Investigación del centro de cáncer de Aichi, Nagoya, Japón. 2
Departamento de Investigación Oncogénica, Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas, Universidad de Osaka,
Suita, Osaka, Japón. 3JSt, PReStO, nagoya, Japón. tomoya Hikita y Atsushi Kuwahara contribuyeron por igual. La correspondencia y
las solicitudes de materiales deben dirigirse a C.O. (Email:coneyama@aichi-cc.jp)
Científico Informes | (2019) 9: 3265 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-39882-z 1

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Para analizar el papel de c-Src en la formación de exosomas, luego buscamos moléculas que se unen al c-Src activado dentro de
los exosomas. Identificamos Alix, que se sabe que interactúa con varias proteínas ESCRT (complejo de clasificación endosomal
requerido para el transporte), incluidas Tsg101 y CHMP4, y se cree que está involucrado en la formación de vesículas
intraluminales (ILV).25,26. Aunque Alix se utiliza como marcador de exosoma canónico, así como como marcador de CD9 o CD63 en
exosomas derivados de diferentes tipos de células, no se conocen bien los mecanismos subyacentes a la regulación de su función
y papel preciso en las células cancerosas. En este estudio, nuestros hallazgos indicaron que la interacción entre el dominio SH3 de
c-Src y la región rica en prolina (PRR) de Alix activa la formación de ILV mediada por ESCRT. También observamos este fenómeno
en células cancerosas humanas reguladas positivamente por Src y encontramos una correlación entre los fenotipos de cáncer y la
secreción aberrante de exosomas dependiente de Alix. Curiosamente, la inhibición de la secreción de exosomas, observada no
solo con el shRNA de Alix sino también con el shRNA de Rab27b y un inhibidor de la esfingomielinasa (GW4869), suprimió los
fenotipos cancerosos de las células secretoras de exosomas, sugiriendo que la secreción apropiada de exosomas contribuye al
mantenimiento de los fenotipos del cáncer. En conjunto, nuestros resultados proporcionan un mecanismo novedoso para la
regulación positiva de los exosomas en las células cancerosas y nuevos conocimientos sobre su importancia en la progresión del
cáncer.
Resultados
El c-src activo se localiza en las membranas del endosoma tardío y promueve la secreción de exosomas. Para
analizar la implicación de la localización espacial y la capacidad transformadora de Src, desarrollamos un sistema experimental
modelo utilizando Csk- / - células que expresan c-Src conjugadas con EGFP. En este sistema, la expresión exógena de c-Src indujo
eficientemente la transformación celular de una manera dependiente de Csk13. A continuación, examinamos la localización
intracelular de c-Src activo. Al centrarse en la superficie de adhesión, el c-Src activo se localizó en las adherencias focales en las
células transformadas con Src, como se informó anteriormente.13,27 (SupFig. 1a, panel superior). Sin embargo, al centrarnos en la
sección intermedia, observamos que la c-Src principalmente activa se localiza en la región perinuclear intracelular (SupFig. 1a,
panel inferior). Luego examinamos la co-localización de c-Src activo con marcadores de orgánulos conocidos, incluidos Rab5
(endosoma temprano), Rab7 (endosoma tardío) y Rab11 (endosoma de reciclaje).28,29 (SupFig. 1b). En las células transformadas con
Src, c-Src se co-localizó con Rab5 y Rab7, pero no con Rab11, lo que resultó en una c-Src activa que se localizó en vesículas de
endosomas tempranas / tardías (Fig.1a y SupFig. 1b). Estas observaciones nos llevaron a examinar más a fondo la co-localización
de c-Src con marcadores de endosomas tardíos como CD9 y CD63, así como marcadores de exosomas canónicos.30. Como era de
esperar, c-Src se co-localizó con CD9 y CD63 en células transformadas con Src (Fig. 1a). Para confirmar la localización del propio c-
Src exógeno, realizamos inmunotinción utilizando anticuerpos anti-Src o anti-CD63. En las células que expresan Src, c-Src y CD63
se localizaron en las membranas de los endosomas, lo que confirma la localización endosómica de c-Src en células transformadas
con Src (SupFig. 1b, c). También observamos que el nivel de expresión de c-Src en Csk- / - (Src- mScarlet # 4 o # 9) fue similar a la
observada en las células Csk + / +, que no se pueden transformar, lo que confirma que la localización de c-Src en la membrana del
endosoma no se debe a la sobreexpresión de Src (SupFig. 1d) . Estos hallazgos sugieren que c-Src está intrínsecamente localizado
en la membrana del endosoma y en la membrana plasmática.
Además, abordamos la relevancia de la localización de la c-Src activa en la membrana del endosoma con capacidad de
transformación. Con este fin, desarrollamos una sustitución de Gly2 a Ala (G2A) que muta un determinado sitio de miristoilación,
lo que hace que Src se difunda en las células (Fig.1b) y la actividad formadora de colonias que se perderá31 (Higo. 1c). Encontramos
que la actividad de la cinasa Src no se vio afectada por la localización, como lo indica la retención de la autofosforilación en pY418
(Fig.1d); sin embargo, la mutación G2A inhibió la activación de los componentes aguas abajo, como lo indican las proteínas
fosforiladas (pY; Fig.1d). Estas observaciones parecen demostrar que c-Src transduce la señalización oncogénica a través de las
membranas. Dado que la mayoría de la población de c-Src activa en Csk- / - Las células se localizaron en el endosoma tardío,
examinamos el efecto de la localización activa de c-Src sobre la secreción de exosomas derivados del endosoma. Preparamos los
exosomas por ultracentrifugación; vesículas extracelulares en Csk transformada con Src- / -
Se confirmó que las células eran exosomas según el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y el análisis de transferencia
Western de marcadores de exosomas canónicos como flotilina-1 y Alix (Fig. 1e, f). De acuerdo con informes recientes32, La secreción
de exosomas aumentó significativamente con la activación de Src (Fig. 1e). Curiosamente, la c-Src activa localizada en algunas
membranas sirvió para aumentar la secreción de exosomas, pero la c-Src difundida intracelularmente no lo hizo, lo que indica que
estas observaciones iban acompañadas de la actividad transformadora de la c-Src activa (Fig.1c, e). Además, observamos que el c-
Src activo estaba encapsulado en exosomas secretados por células transformadas con Src (Fig.1f). Estas observaciones plantean la
posibilidad de que el c-Src activo localizado en las membranas del endosoma induzca la secreción del exosoma.
secreción de exosomas inducida por c-src y v-src. A continuación, abordamos los mecanismos moleculares que subyacen a
la secreción de exosomas mediada por Src endosomal, que se acompaña de transformación mediada por Src. Anteriormente,
desarrollamos un sistema experimental usando Csk- / - Células en las que la expresión exógena de c-Src, a niveles de más del doble
de la c-Src endógena, podría inducir eficazmente la transformación celular de una manera dependiente de Csk.13 (SupFig. 2a).
Usando estas células, comparamos el nivel de secreción de exosomas entre células no transformadas (células Csk + / +, Csk- / -
celdas y Csk- / - células que expresan c-Src y Csk exógenas) y células transformadas con c-Src (Csk- / - células que expresan c-Src)
mediante análisis NTA. El tamaño de la población de exosomas fue ligeramente mayor en las células transformadas con c-Src que
en las células no transformadas (Fig.2a). Además, la secreción de exosomas aumentó sustancialmente con la transformación de c-
Src, según lo juzgado por NTA y análisis de transferencia Western de marcadores de exosomas como Alix, Tsg101 y Flotillin-1 (Fig.
2a, panel derecho y 2b). Curiosamente, encontramos que el c-Src activo (Src pY418) se concentró significativamente en los
exosomas de las células transformadas con c-Src (Fig.2b, compare los paneles de la izquierda y los paneles de la derecha) con
varias proteínas fosforiladas, incluida la AnnexinA2, un marcador del exosoma y sustrato de Src (SupFig. 2b). Estas observaciones
sugieren un papel potencial de c-Src en la promoción de la secreción y transformación de exosomas a través de su actividad
quinasa. Luego examinamos la secreción de exosomas tanto por un oncoviral v-Src como por un mutante de c-Src
constitutivamente activo con una sustitución de Tyr a Phe en Tyr529 (SrcYF) en células Csk + / +, que mostraron una
transformación significativa13. Inesperadamente, encontramos que SrcYF inducía la secreción de exosomas; sin embargo, v-Src no
logró inducir la secreción de exosomas (Fig.2c, d). Acompañado con esta observación, SrcYF pero no v-Src

Figura 1. La Src activa en la membrana del endosoma tardío aumentó la secreción de exosomas en la transformación
inducida por Src. (a) Src conjugado con EGFP (Src-EGFP) y Rab7, CD9 o CD63 conjugado con mCherry, se expresaron en Csk- / -
células, y se analizó la localización de Src. Barra de escala = 10µmetro. (B) El tipo salvaje conjugado con EGFP (SrcWT-EGFP) o
Src deficiente en anclaje de membrana (SrcG2A-EGFP) se expresó en Csk- / -
células, y se analizó la localización de Src. Barra de escala = 10µmetro. (C) Ensayos de formación de colonias en agar blando de
células indicadas en (B) durante 6 días. Platos representativos (paneles superiores) y colonias medias / cm2 (paneles inferiores)
obtenidos de tres experimentos independientes. **p <0.01, por Student t-prueba contra Src (wt). (D) Los lisados de células
enteras de Csk parental- / - celdas (simulacro) y celdas indicadas en (B) se analizaron mediante inmunotransferencia con los
anticuerpos indicados. (mi) Células utilizadas en (D) se sometieron a preparación de exosomas seguida de NTA para la medición
cuantitativa de partículas de exosomas aisladas. **p <0.01, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (F) Los lisados de
exosomas se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados, incluidos los marcadores de exosomas canónicos. Los valores
relativos se obtuvieron de tres ensayos independientes (c, e). Para todos los gráficos, las barras de error indican la media±SD de
tres medidas independientes. Las imágenes de gel sin recortar para los paneles dyf se muestran en la Fig.6 complementaria.
se encontró que estaba concentrado en los exosomas (Fig. 2d). Dado que v-Src tiene varias mutaciones en el dominio SH3 en
comparación con SrcYF, para confirmar la contribución del dominio SH3 en el aumento de la secreción del exosoma,
desarrollamos SrcSH3-mt, un mutante de c-Src con la sustitución de Trp118 por Ala que es deficiente. para SH3 mediado

Figura 2. Src promueve la secreción de exosomas a través de su actividad quinasa y la interacción mediada por SH3. (a) Análisis NTA para la
medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de células Csk + / + y Csk- / - células que expresan simulacro, c-Src o c-Src con Csk
(datos sin procesar; panel izquierdo, el número de partículas; panel derecho). **p <0.01, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (B)
Los lisados de células completas (WCL; paneles de la izquierda) o lisados de exosomas (Exosoma; paneles de la derecha) de las células
indicadas en (a) se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados, incluidos los marcadores de exosomas canónicos. (C) Las células Csk
+ / + se expresaron con c-Src constitutivamente activo simulado (SrcYF) o v-Src, y los lisados de células completas se inmunotransfirieron
con los anticuerpos indicados (paneles de la derecha). Análisis NTA para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de cada
célula (panel izquierdo). **p <0,01, ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (D) Lisados de exosomas de las células indicadas en (C) se
inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados, incluidos los marcadores de exosomas canónicos. (mi) Csk- / - Las células que expresan
simulacro, tipo salvaje (WT), quinasa muerta (KD-mt) o mutante SH3 (SH3-mt) de c-Src se sometieron a inmunotransferencia con los
anticuerpos indicados (paneles de la izquierda) y análisis de NTA para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de cada
célula (panel derecho). **p <0,01, ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. Para todos los gráficos, las barras de error indican la media±SD
de tres medidas independientes. Las imágenes de gel sin recortar para los paneles b, c, dye se muestran en la Fig.6 complementaria.

interacciones proteína-proteína. Esta mutación no alteró la distribución endosómica de Src (SupFig. 2c). Como era de esperar, el
mutante de c-Src, así como el mutante de Src sin quinasa (SrcKD-mt), no logró promover la secreción de exosomas, lo cual es
consistente con la contribución de la actividad de quinasa de c-Src en Csk.- / - células (Fig. 2a, b, e). En estas condiciones, la
capacidad de secreción de exosomas parece estar correlacionada con la transformación de Csk- / - células (SupFig. 2d). En conjunto,
estos hallazgos sugieren que las proteínas mediadas por el dominio SH3 que interactúan con c-Src son necesarias para la
promoción de la secreción del exosoma y están enterradas en el exosoma.
Interacción entre c-src y Alix. Para dilucidar aún más el mecanismo de la secreción de exosomas inducida por c-Src,
buscamos proteínas de unión a c-Src en los exosomas secretados por células transformadas con c-Src utilizando la
proteína c-Src etiquetada con Flag. El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS)
reveló que la fracción co-inmunoprecipitada con c-Src incluía Alix (también conocido como PDCD6IP), que se informa que
está fosforilado por Src y tiene varias repeticiones de prolina-rica- regiones (PRR) en la región C-terminal26
(Higo. 3f). A continuación, realizamos ensayos de inmunoprecipitación y confirmamos que Alix de hecho interactúa con c-Src en
células transformadas con Src, pero no en Csk no transformadas.- / - células (Fig. 3a). También observamos que Alix unido a c-Src en
exosomas estaba fosforilado en tirosina (Fig.3a; WB con Alix (pY)). Además, examinamos si c-Src se co-localizaba con Alix en células
transformadas con Src, y encontramos que una subpoblación de Alix co-localizaba con Src activo en las membranas del endosoma
(Fig.3b). Estas observaciones sugieren que la interacción de c-Src activo y Alix en el endosoma desencadena la formación de
exosomas derivados del endosoma.
Luego realizamos experimentos de derribo para evaluar la importancia de Alix en la regulación positiva del exosoma inducida por c-Src.
Unin vitro El ensayo de proliferación mostró que la eliminación de Alix no suprimió el crecimiento dependiente del anclaje de estas células
(Fig. 3c, d). Sin embargo, la eliminación de Alix suprimió significativamente la secreción de exosomas inducida por c-Src. Además, los
experimentos de rescate que utilizan la expresión de Alix resistente al ARNhc en células de eliminación de Alix mostraron la restauración de
la secreción de exosomas en las células transformadas con c-Src (Fig.3c, e). Para dilucidar los detalles de esta interacción c-Src-Alix,
examinamos a continuación los efectos de dos mutantes de Alix sobre la secreción de exosomas. Un mutante
Δ717, carece de regiones ricas en prolina (PRR) que serían necesarias para la interacción mediada por SH3 y el otro, 4YF,
tiene cuatro fenilalaninas en residuos de Tyr que se encontraron fosforiladas en el exosoma mediante análisis LC-MS /
MS (Fig. 3f). Como se muestra en la Fig.3 g, h, aunque el mutante 4YF en los exosomas interactuó con c-Src activo, el
mutante de deleción que carece de PRR (Δ717) no pudo interactuar con el c-Src activo. Estos resultados demuestran que
la interacción específica entre c-Src (dominio SH3) y Alix (PRR) es fundamental para la secreción de exosomas en las
células transformadas con c-Src. Junto con la interacción c-Src-Alix, la secreción de exosomas suprimida por la caída de
Alix se restauró con la expresión de Alix (WT) o Alix (4YF) pero no de Alix (Δ717) (Fig. 3i). En conjunto, estos hallazgos
sugieren que la c-Src activa interactúa con Alix en las membranas del endosoma y promueve la secreción de exosomas.
la interacción c-src-Alix promueve la formación de ILV en MVB. Habiendo demostrado que la interacción entre Alix y
c-Src activa promueve la secreción de exosomas (en los que se encapsula la c-Src activa) a través de una forma dependiente de
Alix, examinamos a continuación si el aumento de la secreción de exosomas fue causado por la promoción de la formación de ILV
en cuerpo multivesicular (MVB). Para evaluar el papel de c-Src en la formación de ILV dependiente de Alix, primero examinamos la
posible co-localización de c-Src y Alix en endosomas. Csk transformada por src- / - Las células se transfectaron con una forma
constitutivamente activa de Rab5 (Q79L) para aumentar la tasa de fusión de los endosomas.33. La activación de Rab5 indujo
endosomas agrandados en los que la co-localización de c-Src-Alix se distinguía fácilmente mediante microscopía de
inmunofluorescencia confocal (GFP-Rab5: verde). c-Src localizado tanto en las membranas del endosoma como en las vesículas
internas de los endosomas (Src-mScarlet34: rojo). En particular, c-Src se co-localizó fuertemente con Alix (WT) en endosomas
agrandados; sin embargo, hubo poca co-localización de c-Src y Alix (Δ717) (Alix-Halo-tag: azul; Fig. 4a, b). Estos resultados sugieren
que c-Src participa, junto con Alix a través de una interacción mediada por SH3, en la formación de ILV en MVB. Además,
realizamosin vitro ensayos de reconstitución utilizando c-Src conjugado con luciferasa (Src-Nluc) como carga. Como se ilustra en la
Fig.4c, para reproducir un aspecto de la formación de ILV en MVB y la encapsulación de Src en una reacción libre de células,
desarrollamos ensayos bioquímicos simples para in vitro reconstitución de la formación de ILV, como lo describe Shurtleff et al.35.
Fraccionamos Csk- / - células que expresan c-Src-Nluc (SupFig. 3a) en membranas endosomales y citoplasma y cada fracción se
incubó con un sustrato de luciferasa y ATP, seguido de formación de ILV / exosoma. Se detectó c-Src-Nluc en ILV mediante
incubación de las fracciones de membrana y citoplasma en presencia de ATP (SupFig. 3b). En estas condiciones, la formación de
ILV se inhibió mediante neutralización con el anticuerpo anti-CHMP4, lo que sugiere que esta reacción reflejaba la formación de
ILV / MVB ejecutada por maquinaria ESCRT como CHMP4 (SupFig. 3c). Además, encontramos que la inactivación de c-Src por Csk
tiene un efecto supresor sobre la formación de ILV (Fig.4d). Para investigar la función de Alix, a continuación realizamos
experimentos de rescate utilizando la fracción de citoplasma preparada a partir de células de eliminación de Alix que expresan Alix
resistente a shRNA (Fig.4e). Aunque la formación de ILV fue rescatada por el tipo salvaje (WT), el mutante deficiente en PRR (Δ717)
en la fracción de citoplasma no logró rescatar la formación de ILV (Fig. 4e). Juntos, estos resultados sugieren que la interacción de
Alix y c-Src activo a través del dominio PRR-SH3 es crucial para la formación de ILV y da como resultado la promoción de la
secreción de exosomas.
secreción de exosomas en células cancerosas humanas. Para abordar el papel de la c-Src endógena en el cáncer humano,
examinamos la localización de Src en varias células cancerosas humanas en las que c-Src a menudo se regula al alza. Como se
muestra en SupFig. Se descubrió que 4a, c-Src se localiza en la membrana endosomal y se co-localiza con CD63 en células de
cáncer de colon, incluidas las células HCT116 y HT29. Para verificar la secreción activa de exosomas mediada por Src-Alix en células
cancerosas humanas, examinamos la contribución de Alix y c-Src a la secreción de exosomas en células de cáncer de colon
humano en las que c-Src está regulada al alza. En las condiciones de inhibición de Src con dasatinib, un inhibidor de la quinasa
eficaz para la quinasa de la familia Src, que suprimió la actividad formadora de colonias en las células HT29 (Fig.5a), la secreción de
exosomas se redujo significativamente (Fig. 5b). Para dilucidar el papel de c-Src en la secreción de exosoma en cánceres humanos,
usamos shRNA para derribar c-Src en células HT29 y descubrimos que la secreción de exosomas se atenúa por derribo

Figura 3. Se requiere Alix para la regulación positiva del exosoma inducida por Src a través de su interacción con Src. (a) Lisados
celulares de CSK- / - las células que expresan mock, Csk, c-Src o c-Src con Csk se sometieron a inmunoprecipitación (IP) con Alix o
Src, seguido de inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. (B) Localización intracelular de Src (verde) y Alix (rojo) en Csk- /
- Se analizaron las células que expresan Src-EGFP y Alix-mCherry. Barra de escala = 10µmetro. (C) Lisados celulares totales de Csk
transformada con c-Src- / - las células que expresan control (sh-cont) o ARNhc de Alix (sh-Alix) con o sin Alix humano resistente a sh
se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. (D) El crecimiento dependiente del anclaje de las
células indicado en el panel (c) fue examinado por un in vitro ensayo de proliferación con WST-1. (mi) Análisis NTA para la
medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (c). * p <0.05 y ** p <0.01, por ANOVA
con la prueba post hoc de Dunnett. (F) Estructuras esquemáticas de ratón Alix. Se indican las ubicaciones de los aminoácidos
mutados. BRO1: dominio BRO1, PRR: región rica en prolina. (gramo) Construcciones mutantes de Alix indicadas en (F) se
expresaron en Csk transformada con Src- / - células transfectadas con ARNhc de Alix (sh-Alix). Los lisados celulares totales se
analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. (h) Lisados de exosomas de las células indicadas en (
gramo) se inmunoprecipitaron con anti-Alix y se sometieron a inmunotransferencia con Src activo (Src pY418). (I) Análisis NTA
para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (g). * p <0.05 y ** p <0.01, por
ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett.ns, insignificante. Las barras de error indican la media±SD de tres medidas
independientes. Las imágenes de gel sin recortar para los paneles a, c, gyh se muestran en la Fig.6 complementaria.

Figura 4. La interacción de Src con Alix mejora la formación de ILV en la formación de cuerpos múltiples. (a)
Localización de Src y Alix en endosomas agrandados. Csk- / - células que expresan Src-mScarlet y de tipo salvaje (WT) o deficientes
en PRR (Δ717) de la etiqueta Alix-Halo se cotransfectaron con Rab5 (Q79L) -GFP, se añadieron al ligando de etiqueta Cyan-Halo y
se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Los experimentos se realizaron tres veces con resultados similares.
Barra de escala = 10µmetro. (B) Cuantificación de endosomas llenos de Alix y Src. Porcentaje relativo de endosomas Rab5
(Q79L) -GFP que se llenaron con Alix-tag y Src-mScarlet en las celdas indicadas en (a) durante 48h se mostraron. *p <0.05, por
Student t-prueba contra Alix (WT). (C) Esquemas del procedimiento de ensayo de in vitro
Formación MVB. (D) La actividad de c-Src dependía in vitro Formación MVB. Las membranas deCsk- / - /c-Src que expresa
Src-Nluc y fracción de citoplasma de Csk- / - /Se incubaron simulacros de expresión de c-Src o Csk en presencia de ATP y
se midió la actividad luciferasa protegida. *p <0.05, por Student t-prueba contra simulacro. (mi)
Mediada por región de Alix PRR in vitro Formación de ILV en MVB. Las membranas deCsk- / - /c-Src que expresa Src- Nluc y
la fracción de citoplasma de las células utilizadas en la Fig. 3f se incubaron con ATP y se indicó la actividad de luciferasa
protegida. *p <0.05, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. Para todos los gráficos, las barras de error indican
la media±SD de tres medidas independientes.

Figura 5. Alix promueve la secreción de exosomas y el crecimiento de tumores en células de cáncer de colon humano que
albergan una regulación positiva de Src. (a) Las células HT29 se trataron con o sin dasatinib a la concentración indicada
durante 24 horas, y los lisados celulares totales se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. (B) Análisis NTA
para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (a). *p <0.05 y
* *p <0.01, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (C) Los lisados de células totales de células HT29 que expresan control
(sh-cont) o ARNhc Src (sh-Src) se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. (D) Análisis NTA para la medición cuantitativa
de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (c). ***p <0.001, por estudiante t-prueba contra sh-cont. (mi)
Los lisados de células totales de células HT29 que expresan control (sh-cont) o ARNhc de Alix (sh-Alix) con o sin Alix de ratón
resistente a sh se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. (F)
Análisis NTA para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (e).
*p <0.05, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (gramo) Crecimiento dependiente del anclaje de células HT29 indicado en el panel
(e). (h) Ensayos de formación de colonias en agar blando de células HT29 indicadas en (mi). El número medio de colonias / cm2 son
exhibidos. *p <0.05, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. Para todos los gráficos, las barras de error indican la media±SD de tres
medidas independientes. Las imágenes de gel sin recortar para los paneles a, cye se muestran en la Fig.6 complementaria.

de Src (Fig. 5c, d). Examinamos más a fondo el papel de Alix en los cánceres humanos y revelamos que la eliminación de Alix suprimió
significativamente la secreción de exosomas. Los experimentos de rescate con la expresión de Alix resistente al ARNhc en células de
eliminación de Alix mostraron la restauración de la secreción de exosomas en las células HT29 (Fig.5e, f). El ensayo de proliferación celular
mostró que la expresión de Alix no afectó al crecimiento dependiente del anclaje de estas células (Fig.5g). Por el contrario, la eliminación de
Alix suprimió de forma potente el crecimiento independiente del anclaje de las células HT29 (Fig.5h). Por el contrario, el rescate de Alix
aumentó el crecimiento de colonias en células HT29 (Fig.5h). Estos hallazgos sugieren que el eje c-Src-Alix activo está involucrado en la
promoción de la secreción de exosomas en las células cancerosas humanas, que se acompaña del crecimiento tumoral en las células
secretoras de exosomas. En conjunto, estas observaciones plantean la posibilidad de que la secreción de exosomas esté asociada con el
mantenimiento del crecimiento independiente del anclaje en las células cancerosas.
La secreción de exosomas mantiene el crecimiento tumoral en las células cancerosas. Para verificar el papel de la secreción de
exosomas en las células cancerosas, inhibimos la secreción de exosomas en células transformadas con Src con la eliminación de Rab27b
mediada por shRNA, que es un componente esencial de la secreción de exosomas.36 (Higo. 6a). La actividad de Src no fue inhibida por la caída
de Rab27b (Fig.6b). De acuerdo con estudios que utilizan varias células cancerosas humanas37, la regulación a la baja de Rab27b redujo
sustancialmente la secreción de exosomas; sin embargo, la restauración de Rab27b resistente a shRNA aumentó la secreción de exosomas
en las células transformadas con Src (Fig.6c). En nuestras condiciones experimentales, la caída de Rab27b suprimió significativamente la
actividad formadora de colonias, mientras que el rescate de la expresión de Rab27b aumentó la actividad formadora de colonias de las
células transformadas con Src (Fig.6d). Estos resultados confirmaron que la secreción de exosomas es necesaria para el mantenimiento del
fenotipo transformado de las células cancerosas.
El papel de la secreción de exosomas se evaluó adicionalmente utilizando GW4869, un inhibidor de la N-esfingomielinasa
(nSMase) y un conocido inhibidor de la producción de exosomas.38. El tratamiento con GW4869 inhibió la secreción de exosomas en
células cancerosas humanas, incluidas las células HCT116 y HT29 (Fig. 6e). GW4869 no afectó la proliferación de estas células, sin
embargo, GW4869 atenuó la actividad formadora de colonias en estas células de una manera dependiente de la dosis (Fig.6 g, h).
La expresión y localización de Src / Alix no se modificó por la caída de Rab27b (Fig.6b
y SupFig. 4b) o tratamiento de GW4869 (Fig.6f y SupFig. 4c). En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la secreción de
exosomas juega un papel crucial en el mantenimiento del crecimiento tumoral en algunos tipos de células cancerosas.
Discusión
En este estudio, proponemos un mecanismo cuya transformación inducida por Src promueve la secreción de exosomas, como se
muestra en la Fig. 7. En este modelo, la c-Src activada en las membranas del endosoma se asocia con Alix a través de una
interacción SH3-PRR, que es inhibida por la conformación cerrada de c-Src inactivada. Si bien este proceso puede implicar la
fosforilación de Alix por Src39, esta modificación no es importante para la formación de exosomas (Fig. 3). Nuestros hallazgos
indican que la activación de Alix mediada por Src promueve la formación de ILV en MVB, lo que resulta en la promoción de la
secreción de exosomas observada en varias células cancerosas humanas con activación de Src elevada.
Aunque hay muchos informes de la distribución espacial de c-Src, la relación entre la actividad de c-Src y su
localización intracelular no se comprende bien40. Dado que Src tendría afinidad por las membranas lipídicas a través de
una miristoilación, y algunas moléculas de Src se encuentran en las membranas del endosoma, exista o no Csk (SupFig.
4d), es posible que la localización de c-Src no esté estrictamente controlada por su actividad. Sin embargo, en este
estudio, mostramos que el c-Src activado tiende a localizarse en la membrana del endosoma en Csk- / - células. Mientras
que c-Src en las adherencias focales juega un papel fundamental en la activación de la señalización descendente para la
progresión del cáncer41,42, la función de c-Src en la membrana del endosoma no ha sido bien establecida. Encontramos
que Src y Alix están localizados en endosomas en células tumorales (HCT116) y células no tumorales (HaCaT) (SupFig. 4e).
En las células cancerosas humanas que albergan la activación de Src, Alix no modificó la localización de c-Src en la
membrana del endosoma (SupFig. 4f), lo que sugiere que c-Src se localiza intrínsecamente en las membranas del
endosoma y que la c-Src activa interactúa con Alix en ellos. Esta interacción desencadena la formación de ILV mediada
por Alix en MVB, que es necesaria para la regulación positiva de la secreción de exosomas. Además, demostramos que la
c-Src activada en las células cancerosas está involucrada en la secreción mejorada de exosomas. Aunque actualmente se
está investigando la importancia fisiológica de la secreción de exosomas mediada por Src,43. Por lo tanto, la encapsulación
del exceso de Src en MVB / ILV y su evacuación en exosomas pueden contribuir a mantener niveles activos de
señalización de Src. De hecho, a menudo hemos observado que la expresión aberrante de oncogenes, comov-src,
provoca la muerte celular en la etapa temprana de la transformación celular (datos no mostrados).
En este estudio, también encontramos que un mutante constitutivamente activo de c-Src, SrcYF, mostró una actividad superior para la
promoción de la secreción de exosomas en comparación con v-Src, a pesar de que ambos tenían una actividad quinasa comparativamente
alta (Fig. 2). Estos resultados enfatizan la importancia de usar c-Src de tipo salvaje (y su derivado) para estudiar el papel de Src en el
complicado proceso celular regulado por interacciones proteína-proteína. Sin embargo, v-Src (con alta actividad de transformación) se ha
utilizado en muchos estudios de vías oncogénicas mediadas por Src.44.
Se ha sugerido que los exosomas asumen funciones en la comunicación intercelular mediante la transferencia de sus
moléculas de carga, como proteínas y miARN. Sin embargo, las razones y los mecanismos que subyacen a la secreción elevada de
exosomas que a menudo se observa en varias células cancerosas humanas no están claros. Encontramos que c-Src, que se sabe
que está regulado positivamente en varios cánceres humanos, se concentra con sus moléculas de unión y sustratos en exosomas
secretados por células transformadas inducidas por Src. También se ha informado que c-Src y sus sustratos están enriquecidos en
los exosomas secretados por las células del cáncer de próstata.45. Aunque estas moléculas posiblemente contribuyan a los
fenotipos cancerosos de las células receptoras46, Nuestros hallazgos nos llevaron a examinar qué molécula es responsable de la
formación de exosomas. A partir de nuestros experimentos, se identificó a Alix entre los candidatos. Se cree que Alix promueve la
escisión de la membrana alrededor del cuello de las ILV en formación envueltas por proteínas ESCRT.47. Sin embargo, queda por
aclarar si la regulación positiva del eje Src-Alix en las células tumorales es responsable de la secreción elevada de exosomas
observada en los cánceres humanos.

Figura 6. La secreción de exosomas promueve el crecimiento tumoral de las células cancerosas. (a) Los niveles de expresión de ARNm de
Rab27b se evaluaron mediante qRT-PCR en Csk transformada con c-Src- / - células que expresan control (sh-cont) o ARNhc de Rab27b (sh-
Rab27b) con o sin Rab27b humano resistente a sh. *p <0.05 y **p <0.01, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (B) Lisados
celulares totales de células en (a) se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. (C)
Análisis NTA para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas de las células indicadas en el panel (a).
*p <0.05, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (D) Las celdas indicadas en (a) se sometieron al ensayo de formación
de colonias en agar blando. El número medio de colonias / cm2 fueron mostrados. *p <0.05 y **p <0,01, por ANOVA con la prueba
post hoc de Dunnett. (mi) Se trataron células HCT116 o células HT29 con GW4869 (GW) a las concentraciones indicadas y se
muestran los análisis NTA para la medición cuantitativa de partículas exosómicas aisladas.
* *p <0.01, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (F) Lisados de células totales de células HCT116 o células HT29
tratadas con GW4869 (GW) a las concentraciones indicadas durante 2 días. (gramo) Se trataron células HCT116 o células HT29 con
GW4869 (GW) a las concentraciones indicadas durante 3 días y se examinó el crecimiento celular dependiente del anclaje con
WST-1. ns, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. (h) Se trataron células HCT116 o células HT29 con GW4869 a las
concentraciones indicadas y se sometieron al ensayo de formación de colonias en agar blando. El número medio de colonias / cm2
Es indicado. *p <0.05, por ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett. Para todos los gráficos, las barras de error indican la media±
SD de tres medidas independientes. Las imágenes de gel sin recortar para los paneles byf se muestran en la Fig.6 complementaria.

Figura 7. Modelo hipotético de la interacción Src / Alix en la regulación de la biogénesis del exosoma y el crecimiento tumoral.
Cuando el c-Src activo se localiza en la membrana del endosoma, c-Src interactúa con Alix en la membrana del exosoma a través
del dominio SH3 y promueve la producción de ILV dependiente de ESCRT, lo que da como resultado el aumento de partículas
exosómicas de las células. A su vez, las células cancerosas mantienen el fenotipo transformado mediante el aumento de la
circulación y el tráfico de vesículas celulares como exosomas.
Previamente, se ha demostrado que Src fosforila Y319 de Alix39, y Alix fosforilado puede reconocer el dominio SH2 de
Src26. En este estudio, encontramos que c-Src se une directamente a Alix de una manera independiente de la fosforilación
a través de una interacción SH3-PRR, que se demostró que es necesaria para la formación de ILV potenciada por Src.
Cabe señalar que la molécula de Alix tiene varios motivos PRR atípicos y típicos que consisten en muchas prolinas
sucesivas en el sitio C-terminal; sin embargo, la estequiometría y los detalles atómicos de la unión en estas regiones a Src
SH3 siguen siendo esquivos. Además, revelamos que la actividad quinasa también es necesaria para la promoción de la
secreción de exosomas, lo que sugiere que otros sustratos de Src, como Syntenin32,
puede estar involucrado en este proceso.
Para confirmar que la asociación entre Alix y c-Src activada promueve la formación de ILV, intentamos dos enfoques
diferentes. Primero, se realizó un análisis microscópico utilizando agrandamiento del endosoma mediado por mutantes
activos Rab5, seguido de un análisis bioquímico de lain vitro reconstitución de MVB. Enin vitro
Formación ILV, modificamos un sistema MVB reconstruido desarrollado previamente para el análisis de carga incorporada en ILV35.
Demostramos que este método, utilizando una molécula cargada como sonda (p. Ej., C-Src-Nluc48), proporcionaría una herramienta
novedosa para investigar el proceso de encapsulación de moléculas de carga de exosomas.
Como se mencionó anteriormente, nuestros resultados indican que la interacción Src-Alix es importante no solo para elevar la secreción
de exosomas sino también para mantener la tumorigenicidad de Csk transformada con Src- / - fibroblastos y células cancerosas humanas
activadas por c-Src. Curiosamente, el nivel de expresión de Alix en algunos tejidos tumorales (por ejemplo, cáncer de páncreas) muestra una
correlación con el pronóstico (SupFig. 5a). En nuestras condiciones experimentales, en células de cáncer de páncreas como PANC-1 o
MIAPaCa-2, la caída de Alix suprimió el crecimiento tumoral de cada célula (SupFig. 5b). Se ha informado que la alteración maligna del cáncer
de páncreas aumenta la liberación de exosomas.22. Aunque se necesita una investigación más extensa utilizando tejidos y exosomas de
cáncer humano, nuestros resultados apoyan la posibilidad de que Alix sea un biomarcador de diagnóstico de la progresión del cáncer.
Además, también revelamos que la inhibición de la transformación celular por la reducción de la

liberación de exosomas es causada no solo por la supresión de Alix sino también por Rab27b, que
participa en la fusión vesicular, y GW4869, que es un inhibidor de esfingomielinasa neutro
ampliamente utilizado para bloquear el exosoma. Generacion. En particular, estos factores no
afectaron la proliferación celular. Estos hallazgos sugieren que la disfunción de la secreción de
exosomas puede suprimir la transformación celular, independientemente de la causa. Teniendo en
cuenta que los exosomas también son secretados por las células normales, este proceso puede ser
importante para facilitar el tráfico vesicular intracelular sin problemas y para mantener la
homeostasis celular descartando el exceso de sustancias tanto en las células normales como en las
cancerosas. Sin embargo,
Métodos
Productos químicos y anticuerpos. Las sustancias químicas y los anticuerpos utilizados en este estudio incluyeron
Alexa Fluor 488-faloidina, IgG anti-conejo de cabra conjugada con HRP e IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.); dasatinib (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.); anti-fosfotirosina 4G10,
anti-Alix ABC40 y anti-v-Src ab-1 (Merck, Darmstadt, Alemania); anti-Alix 3A9 y anti-fosfo-Src pY418 (Cell

Tecnología de señalización, Danvers, MA, EE. UU.); IgG de ratón normal, anti-Csk C-20, anti-Tsg101 C-2 y anti-GAPDH 6C5
(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.); anti-AnxA2 y anti-flotilina (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.); anti-
CHMP4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido); anti-tubulina (Thermo Fisher Scientific).
Cultivo celular, inmunotransferencia, inmunoprecipitación e inmunocitoquímica. Csk- / - Las células que expresan los
genes Src, HT29 y HCT116 se cultivaron como se describió anteriormente.49. La inmunoprecipitación y la inmunocitoquímica se
realizaron como se describió anteriormente.27,49. En las transferencias Western de exosomas, las muestras preparadas a partir de
células se diluyeron con un volumen igual de tampón de muestra. La intensidad de las bandas es proporcional a la concentración
de cada proteína en una partícula de exosoma y al número de partículas secretadas.
preparación de exosomas. El cultivo productor de exosomas se inició a partir de 1,5 × 106 células con FBS empobrecido en exosomas al
1% que contienen DMEM. Después de 48 horas de cultivo, se recogió el sobrenadante del cultivo y se contaron las cantidades finales de
células para confirmar que no surgieron diferencias de crecimiento entre las diferentes condiciones o células. Los exosomas se prepararon
mediante ultracentrifugación.38 con trehalosa 25 mM para prevenir la agregación de exosomas50.
El tamaño, la distribución y la concentración de los exosomas se determinaron utilizando un instrumento NanoSight LM10
(Malvern Panalytical, Malvern, Reino Unido).
Análisis LC-Ms / Ms. Los exosomas se prepararon a partir de CSK- / - /Las células c-Src-Flag y las proteínas de unión a Src se
inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Flag. Los inmunoprecipitados se analizaron mediante LC-MS / MS como se describió
anteriormente.49.
Expresión de genes y shRNA. Todos los experimentos de transferencia de genes se llevaron a cabo utilizando vectores
retrovirales pCX4.51. v-Src fue proporcionado amablemente por el Dr. Tsuyoshi Akagi (Instituto de Biociencia de Osaka) y el mutante
GFP-humano Rab5 (Q79L) fue proporcionado amablemente por el Dr. Hiroshi Hanafusa (Universidad de Nagoya). El ratón CD9,
CD63, Rab5, Rab7, Rab11, Rab27b humano, Alix de ratón, c-Src de ratón, c-Src conjugado con EGFP, mCherry, mScar- let y
NanoLuc, se amplificaron por PCR y subclonaron en el vector pCX4. La producción y la infección con vectores retrovirales se
realizaron como se describió anteriormente.51. Los vectores lentivirales, tanto vacíos como portadores de Alix de ratón o humano
(ID: NM_011052.1, ID: NM_013374.2) y Rab27b de ratón (ID: NM_030554.2) se adquirieron de Sigma.
PCR cuantitativo en tiempo real. El ARN total se preparó usando Sepasol (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). El
análisis de PCR en tiempo real se realizó como se describe52. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: ratón
Rab27b: 5′ -ACTCAGAGGAACCAGTGATGGAG-3′, 5′ -ATAGATTGGGGTCAGGGGAGA-3′, ratón GAPDH: 5′ -
AAAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′, 5′ -AATGAAGGGGTCGTTGATGG-3′.
ensayo de formación de colonias en agar blando. El ensayo de formación de colonias en agar blando se realizó como se describe13.
Suspensiones unicelulares de 4×104 las células se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos en 1,5 ml de DMEM que contenía
FBS al 10% y agar al 0,36% en una capa de 2,5 ml del mismo medio que contenía agar al 0,7%. Las colonias se tiñeron con bromuro
de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) 6 a 14 días después de la siembra en placa y se utilizaron micrografías para
contar el número de colonias.
In vitro ensayo de formación de cuerpos multivesiculares. Este ensayo se basa en métodos desarrollados por Shurtleff.
et al.35 con la excepción de usar Oplophorus gracilirostris luciferasa, es decir, Nanoluc (Promega, Madison, WI, EE. UU.)53.
Para in vitro reconstitución, la reacción completa consistió en solución de membrana, tampón de incorporación, sustrato
Nanoluc, sistema de regeneración de ATP y solución de citoplasma. Después, la mezcla se incubó a 30ºC durante 20 min
para promover la reacción de formación de MVB. La mezcla se centrifugó a 15.000× g durante 10 min a 4 ° C y se eliminó
el sobrenadante. El sedimento se trató con tripsina durante 1 hora a 4ºC. Se midió la actividad luciferasa protegida
restante como resultado de la formación de MVB.
análisis estadístico. Todos los datos resumidos se informaron como medias±SD calculada para cada grupo y comparada usando la de
Student t-prueba o ANOVA con la prueba post hoc de Dunnett utilizando el software Excel (Microsoft). Los resultados de la prueba se
informaron como de dos colaspag-valores, donde p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Disponibilidad de datos
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.
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Agradecimientos
Agradecemos a los Drs N. Kosaka, Y. Yoshioka y T. Ochiya por el asesoramiento técnico en la preparación de exosomas; Drs T. Akagi,
H. Hanafusa y Y. Okada por proporcionar los generosos obsequios de reactivos. Este trabajo fue apoyado por MEXT
KAKENHI, subvención para investigación científica (B) número de subvención JP855194; y JST, PRESTO Grant número
JP1005457, Japón.
Contribuciones de autor
CO concibió y diseñó los experimentos. TH, AK, RWMM y CO realizaron los experimentos. CO analizó los datos.
CO escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.
información adicional
Información suplementaria acompaña este documento en https://doi.org/10.1038/s41598-019-39882-z.
Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Nota del editor: Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y
afiliaciones institucionales.

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que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o
formato, siempre que otorgue el crédito apropiado a los autores originales y la fuente, proporcione un enlace a la
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crédito del material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está
permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del
titular de derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visitehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
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Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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