PRÁCTICA DETERMINACION DE LA
CAPACIDAD quercitina y Kamferol que actúan como
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ANTIOXIDANTE DE LOS
ALIMENTOS
Dra. Anabel D. Gonzalez Siccha
I. INTRODUCCIÓN
Los radicales libres son moléculas o
fragmentos de moléculas caracgerizadas por
tener uno o más electrones desapareados en
su orbital externo, condición que los torna
altamente reactivos. En el ser humano se
generan radicales libres en la cadena
respiratoria mitocondrial, cuando reacciona el
peróxido de hidrógeno con el ion ferroso, por
acción catalítica de la ciclooxigenasa, la
reacción de vitamina C con el ión ferroso, por
acción de la NADPH reductasa.
En los seres vivientes existen sistemas de
defensa antioxidante que tienen la propiedad
de impedir la acción nociva de los radicales
libres, habiéndose identificado compuestos
con propiedades antioxidantes de naturaleza
enzimática como la catalasa, superóxido
dismutasa, glutatión peroxidasa, etc., así
como, sustancias no enzimáticas: ascorbato,
ferritina, ceruloplasmina, polifenoles,
antocianinas.
Los antioxidantes, moléculas capaces de
captar el electrón desapareado del orbital
externo de los radicales libres y de esta forma
desactivarlos, disminuyen el estrés oxidativo y
actúan sobre el mismo inhibiéndolo, para
evitar la oxidación de las proteínas, los lípidos
y el ADN. Las alteraciones en estas
biomoléculas como consecuencia del estrés
oxidativo producirán el desarrollo de
patologías siendo las más relevantes diabetes,
enfermedades cardiovasculares, neurodege -
nerativas como el Párkinson y Alzhéimer, o
incluso cáncer, (Barbosa, 2008; Sánchez Valle
et al., 2013).
Los antioxidantes presentes en los alimentos
estimulan directamente las defensas o pueden
actuar sobre las especies reactivas de
oxígeno.
Las olivas tienen antioxidantes como:
tocoferoles, escualeno, carotenoides y
compuestos fenólicos (Simples: hidroxitirosol,
tirosol, ácido vanílicos; Flavonoides: apigenina
y luteolina.
En la coliflor se ha encontrado flavonoides
antioxidantes, antiinflamatorios y
anticancerígenos (González-Siccha, A., 2015).
La capacidad antioxidante de un alimento se
debe a la actividad antioxidante de sus
diferentes compuestos bioactivos, entre los
cuales tenemos a los compuestos fenólicos,
carotenos, antocianinas, ácido ascórbico,
Por lo tanto, se puede decir que son los
compuestos fenólicos, carotenos y ácido
ascórbico presentes en el aguaymanto, los
que aportan su potencial antioxidante,
existiendo a su vez un efecto sinérgico entre
los compuestos bioactivos que conforman el
fruto.
El objetivo fundamental de esta práctica es:
• Determinar la capacidad antioxidante de los
alimentos
II.MATERIAL Y MÉTODO
2.1 Material: Reactivos y equipos
- Muestras: aguaymanto, arándanos,
tomate de árbol, limón,
- Reactivos:
- ABTS (2,2'-azino-bis(3-thylbenzthiozoline
-6-sulphonic acid)
- DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil)
- persulfato de potasio de grado analítico
de Harleco 7574®,
- etanol absoluto y hexano
- metanol
- acetona,
- folin-ciocalteu,
- carbonato de sodio anhidro al 1 N,
- 2,6 diclorofenol indofenol
- ácido metafósforico,
- ácido acético glacial
- ácido cítrico anhidro
- alcohol de 96°GL
- Spectronic 20
- Refrigeradora,
- Centrífuga,
- Equipo de radiación ultravioleta.
- Métodos de análisis
- Capacidad antioxidante
- Compuestos fenólicos totales.
- Carotenos expresados como mg -
caroteno /100 g de muestra
- Betalaínas, expresados como mg de
 betalaínas/1000 ml
- Ácido ascórbico
2.2 Método
Preparación de las muestras:
Se selecciona frutas sanas y firmes que son
lavadas con agua destilada, luego licuado
durante 30-60 segundos para obtener
extractos.
Obtención del extracto: pesar 2,5 gramos de
muestra y añadir 12,5 mL de metanol;
homogenizar la muestra con un agitador
magnético durante 15 minutos y almacenar el
extracto durante 24 horas a 4°C en oscuridad;
luego, se procedió a centrifugar el
homogenizado durante 20 minutos a 5000
rpm; el sobrenadante se utiliza para análisis
posteriores y el precipitado es eliminado.
1. Capacidad antioxidante medida por el
método del DPPH
Se conoce así a la técnica que emplea el 2,2-
difenil-1-picrilhidrazilo como radical. El DPPH
es un radical libre que se puede obtener
directamente disolviendo el reactivo en un
medio orgánico.
La reducción del DPPH se monitorea por la
disminución en la absorbancia a una longitud
de onda característica. En su forma de radical
libre, el DPPH absorbe a 515 nm y cuando
sufre reducción por un antioxidante, esta
absorción desaparece.
En consecuencia, la desaparición del DPPH
proporciona un índice para estimar la
capacidad del compuesto de prueba para
atrapar radicales.
La reacción entre el DPPH y un compuesto
depende de la conformación estructural del
mismo, por lo que las comparaciones
cuantitativas no siempre son apropiadas.
El empleo del radical DPPH en el método
espectrofotométrico posee ventajas en
simplicidad, reproducibilidad y rapidez.
Procedimiento:
se basa en la reducción de la absorbancia
medida a 515 nm del radical DPPH•, por
antioxidantes. Con modificaciones el método
descrito por KIM et al.[23], se basa en la
medida de la absorbancia del radical DPPH•
100 µM (3,9 mL) disuelto en metanol al 80%, a
la longitud de onda de 517 nm. Se añade 0,1
mL de la muestra o patrón, la mezcla se
2
homogeniza cuidadosamente, y se mantiene
en la oscuridad durante 30 minutos. Las
medidas de absorbancia a 517 nm se realizan
antes de añadir la muestra (A0) y pasados los
30 y 60 minutos (Af).
La concentración de DPPH• en el medio de
reacción se calcula a partir de una curva de
calibrado obtenida por regresión lineal. Los
resultados se expresan en TEAC, o sea,
actividad equivalente a Trolox (µM/g de
muestra peso fresco). El antioxidante sintético
de referencia Trolox, a una concentración de
0,08-1,28 mM en disolución de metanol al
80%, se ensaya en las mismas condiciones,
expresándose los resultados en TEAC y
VCEAC
2. Capacidad antioxidante medida por el
método del ABTS
El radical ABTS se genera a partir de su
precursor el Ácido 2,2’-azinobis (3-
etilbenzotiazolín) -6-sulfónico (ABTS).
El radical catiónico obtenido es un compuesto
de color verde-azulado, estable y con un
espectro de absorción en el UV-visible.
Es un radical artificial que no mimetiza bien la
situación in vivo, termodinámicamente puede
ser reducido por compuestos que tengan un
potencial redox menor que el del ABTS
(0.68V), pudiendo reaccionar con el radical,
muchos compuestos fenólicos con un potencial
más bajo.
La absorbancia medida por el método ABTS se
determinada a los 1 y 7 minutos
La ventaja de este ensayo es que puede
realizarse tanto en muestras hidrosolubles
como liposolubles, eligiendo el disolvente
apropiado en cada caso
Entre las ventajas de este método podemos
mencionar, la reproducibilidad, su uso flexible
en diferentes medios tales cómo acuosos o
lipofílicos de extractos de alimentos y fluidos
fisilógicos, ya que el reactivo es soluble tanto
en medios solventes acuosos como orgánicos
Procedimiento:
el radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción de
ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM,
concentración final) incubados a temperatura
ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h.
Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con
etanol hasta obtener un valor de absorbancia
comprendido entre 0,70 (±0,1) a 754 nm (longitud
de onda de máxima absorción). Las muestras
filtradas (antocianos) se diluyen con etanol hasta
que se produce una inhibición del 20 al 80%, en
comparación con la absorbancia del blanco, tras
añadir 20 µL de la muestra. A 980 µL de dilución
del radical ABTS•+ así generado se le determina
la A754 a 30ºC, se añade 20 µL de la muestra
(dilución de antocianos) y se mide de nuevo la
A754 pasado 1 minuto.
La absorbancia se mide de forma continua
transcurridos 7 minutos. El antioxidante sintético
de referencia, Trolox, se ensaya a una
concentración de 0-15 µM (concentración final)
en etanol, en las mismas condiciones, lo que se
hace también con ácido ascórbico (0-20 mg/100
mL).
Los resultados se expresan en TEAC (actividad
antioxidante equivalente a Trolox) y en VCEAC
(actividad antioxidante equivalente a vitamina C),
en este último caso por tratarse de alimentos.
3. Capacidad antioxidante medida por el
Método DMPD
Procedimiento:
Este se basa en añadir 1 mL de la disolución de
DMPD 100 mM a 100 mL de disolución
tamponada con ácido acético/ acetato de sodio
0,1 M (pH 5,25). Tras la adición de 0,2 mL de una
disolución de cloruro férrico 0,05 M de TBA, como se indicó anteriormente, y la
(concentración final de 0,1 mM) se forman
radicales cationes coloreados (DMPD•).
Un mililitro de esta disolución se traslada a una
cubeta midiéndose su absorbancia, comprendida
entre 0,90 (±0,1), a 506 nm. Se añade 50 µL de
una disolución patrón de antioxidante o de
muestras diluidas y transcurridos diez minutos (a
25ºC) se hace otra medida de absorbancia a 506
nm.
La disolución tamponada de acetato se utiliza
como blanco de referencia. Los resultados se
expresan en TEAC, o sea, actividad equivalente a
Trolox (en mM o µM) o bien en VCEAC, actividad
equivalente a vitamina C (mg/L o mg/100 g).
4. Capacidad antioxidante medida por el
método del TBARS
Es un método para detectar peroxidación lipídica.
Este procedimiento mide el malondialdehído
(MDA) formado como producto principal dela
degradación de hidroperóxidos generados por la
oxidación de lípidos. El producto de color rosa que
puede ser medido espectrofotométricamente a
532–535 nm.
3
Como producto final de la peroxidación lipídica
predomina el malondialdehído (MDA), principal
sustrato de esta reacción. El MDA reacciona con
el ácido tiobarbitúrico (TBA)
Procedimiento:
En un frasco de vidrio ámbar se colocan 5 ml del
reactivo de TBA recién preparado (ácido 2-
tiobarbitúrico 0.02 M en ácido acético glacial al 90
%), y 0.5 g de mantequilla clarificada El tubo se
sumerge en un baño de agua a 90° C durante 45
minutos.
También se prepara un blanco con el mismo
procedimiento anterior. Luego los tubos son
enfriados en agua durante 10 minutos.
Una porción de la muestra se llevó a una cubeta
y la absorbancia de la muestra fue leída a 532 nm
en un espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/ Vis).
Las lecturas fueron convertidas a mg de
malonaldehído por kilogramo de muestra usando
una curva estándar.
La curva estándar fue construida realizando
diluciones apropiadas de una solución acuosa de
1,1,3,3 tetraetoxipropano 1.0x10-3 M, para
obtener concentraciones de 1*10-8 a 7*10-
8 moles de malonaldehído en 1 ml de solución.
Estas soluciones fueron tratadas con el reactivo
absorbancia fue medida a 532 nm.
III. RESULTADOS
IV. DISCUSIÓN
V. CONCLUSIONES
VI. BIBLIOGRAFÍA
Repo de Carrasco, Ritva et al (2008). Determinación
de la capacidad antioxidante y compuestos bioactivos
de frutas nativas peruanas. Revista de la Sociedad
Química del Perú, 74(2), 108-124. Recuperado en 29
de septiembre de 2020, de
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&
pid=S1810-634X2008000200004&lng=es&tlng=es.
Fernández-Pachón et al (2006). Revisión de los métodos de
evaluación de la actividad antioxidante in vitro del vino y
valoración de sus efectos in vivo.Archivos latinoamericanos
de Nutrición, 56(2), 110-122. Recuperado en 30 de
septiembre de 2020, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-
06222006000200002&lng=es&tlng=es.
 ▪ ACTIVIDADES EXTRA-AULA: EXPLICAR LOS MÉTODOS PARA DETERMINAR
LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS.
▪ Explicar la capacidad antioxidante directa
e indirecta.
▪

REALIZAR LAS REACCIONES QUIMICAS ENTRE

LOS RADICALES CON LA ESPECIE
ANTIOXIDANTE

▪ La mayoría de los métodos de medida de la

actividad antioxidante no emplean especies
radicales de significado biológico. Son radicales
ajenos al organismo el DPPH● o el ABTS●+.
▪ En el caso del ensayo FRAP el Fe2+ producido en
la reacción redox del ensayo FRAP puede
reaccionar con H2O2 para producir OH, que se
considera el radical libre más dañino encontrado in
vivo. Por otra parte, hay antioxidantes que pueden
inhibir la oxidación lipídica a través de la quelación
de metales de transición que intervienen en la
producción de radicales libres.
▪ BIBLIOGRAFÍA DE LA ACTIVIDAD
▪ El empleo de radicales peroxilo o hidroxilo en
ensayos como ORAC, TRAP, TOSC, DCFH-DA les
añade un mayor significado biológico, ya que estas
ROS son las más importantes a nivel fisiológico
▪
▪
▪ Realizar el modelo que explica la actividad de
un compuesto como antirradical en el DPPH,
mediante una ecuación