CAP.

1 DE HISTOLOGÍA DE ROSS
PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA DE
TEJIDO.
1. FIJACIÓN PARA CONSERVAR LA ESTRUCTURA.
El fijador más importante es la formalina,
que es un sol. Acuosa de formaldehido al
37%, combinada con disoluciones varias y
amortiguadores. El mantiene la estructura
celular reaccionando con los GRUPOS
AMINOS DE LAS PROTEÍNAS. Algo
importante de recalcar es que el
formaldehido no reacciona con lípidos ya
que es un mal fijador de las membranas
celulares.
Funciones de la fijación
Impedir el metabolismo celular.
Impedir la degradación enzimática de las células
Destruir microorganismos patógenos
Endurecer el tejido como resultado de la formación de enlaces
cruzados o desnaturalización de moléculas proteicas.
2. LA MUESTRA SE SUMERGE EN PARAFINA PARA PERMITIR HACER
EL CORTE
El corte que s ele realiza a la muestra es de mas o menos 5 a 15 micras.
Después de que la muestra es fijada se lava y se deshidrata con alcohol
concentrado al 100%, después se utilizan compuestos como el TOLUENO O
XILENO para extraer el alcohol antes de obtener la muestra.
Después que la parafina se haya fundido y endurecido esta se empareja para
formar un bloque de tamaño adecuado y entonces llevar la muestra endurecida
al MICROTOMO. Donde se realizarán los finos cortes para llevarlo bajo el lente
del microscopio utilizando un MEDIO DE MONTAJE como adhesivo.
 3. LA MUESTRA SE TIÑE PARA PERMITIR SU EXAMEN
PARA PODER TEÑIR LA MUESTRA
ESTA NECESITA DISOLVER LA
PARAFINA Y EXTRAERSE, con ayuda
del tolueno o xileno. además de que el
tejido debe rehidratarse, utilizando
alcohol de 100% a menos, de una
manera decadente. después de
realizarlo, el tejido SE TIÑE CON
HEMATOXILINA EN AGUA. La eosina
que es soluble en agua vuelve a
deshidratar la muestra con alcohol
creciente y DESPUÉS SE TIÑE CON
EOSINA.
Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se le coloca un
medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para
obtener un preparado permanente.

COLORACION CON
1. HEMATOXILINA PIGMENTA AZUL
2. EOSINA PIGMENTA ROSA
3. H&E EN MORADO

Para observar muestras celulares, se deben utilizar fijadores especiales para

poder observar estructuras que contengan lípidos.
Para que esto sean observado se es necesario de otros tipos de fijadores para ver
las células adiposas (Lípidos neutros). En estos casos se utilizan cortes por
congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en grasa,
para mantener las estructuras de la membrana se utilizan fijadores especiales con
metales pesados como el permanganato y osmio que se unen fosfolípidos.
A pesar del uso común de la H&E, estos colorantes no son completos para
observar todos los componentes celulares, como elastina, fibras reticulares,
membranas basales y lípidos.
Para poder observar estas estructuras se usan mecanismos de tinción especiales
como la ORCEINA Y FUCSINA-RESORCINA para el material elástico y la
IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA para las fibras reticulares y membranas basales.
HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA
Pueden tener su fundamento en la unión específica de un colorante, en el uso de
anticuerpos marcados con un colorante fluorescente con un componente celular
en particular o en la actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo de
la célula.
Los componentes que perduran después de la fijación son principalmente
moléculas grandes que no se disuelven con facilidad.
En el corte histológico suelen quedar moléculas grandes que no se disuelven con
facilidad, estas moléculas sobrantes reaccionan con otras moléculas semejantes
para formar complejos macromoleculares que son los que suelen conservarse en
un corte histológico. Ejemplo de estas macromoléculas:
Nucleoproteínas
Proteínas intracelulares del citoesqueleto
Proteínas extracelulares
Complejos de fosfolípidos y proteínas en las membranas
Cabe resaltar que, al momento de tomar muestras histológicas, muchas
estructuras pueden perderse como mantenerse siendo teñidos con H&M, esto
quiere decir que los ácidos nucleicos, proteínas y fosfolípidos pueden perderse.
Las proteínas pequeñas y los ácidos nucleicos pequeños, como los ARN de
transferencia, en general se pierden durante la preparación del tejido.
Algunos ejemplos de moléculas que se pierden durante la fijación de rutina en
fijadores acuosos son:
glucógeno (hidrato de carbono intracelular común en el hígado y las células
musculares)
proteoglucanos y glucosaminoglucanos (hidratos de carbono complejos
extracelulares que se encuentran en el tejido conjuntivo).
CABE RESALTAR QUE ESTAS MOLECULAS PUEDEN CONSERVARSE SI SE
UTILIA UN FIJADOR NO ACUOSSO PARA EL GLUCOGENO O AÑADIENDO
LIADORES ESPECIALES A LA SOLUCIO IJADORA QUE PRESERVEN LAS
MOLECULAS EXTRACELULARES QUE CONTIENEN HIDRATOS DE
CARBONO.
Existen otras sustancias como glucosa, iones y moléculas pequeñas que se
pierden en la preparación de muestras de PARAFINA teñidas con H&E.
Cuando pueden conservarse y detectarse mediante técnicas específicas, aportan
información muy valiosa sobre el metabolismo celular, transporte activo y otros
procesos vitales de las células.
FUNDAMENTOS QUIMICOS DE LA TINCION
Colorantes ácidos y básicos
Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte
coloreada y se la describe con la fórmula general [Na+ anilina–].
Un colorante básico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada y se lo
describe con la fórmula general [anilina+ Cl–].
Colorantes básicos
La tinción con colorantes básicos se puede emplear para centrar el estudio en
grupos aniónicos específicos (grupos fosfatos de los ácidos nucleicos, grupos
sulfatos de los glucosaminoglicanos y los grupos carboxilo de las proteínas).
Esto es posible de la siguiente manera:
Si el pH es alto (10) entonces los tres grupos se ionizan y quedan disponibles para
la reacción con el colorante básico.
Si el pH es acido neutro (5 a 7) solo se ioniza el grupo fosfato y sulfato.
Si el pH es bajo (inferior a 4) solo s ionizan lo grupos sulfatos.
Como la Hematoxilina no es un colorante totalmente básico, se utilizan un
intermediario entre el tejido y la anilina, este intermediario es llamado
MORDIENTE. La función de un mordiente es hacer que la tinción se parezca a un
colorante básico.
Colorantes ácidos
La reacción con grupos catiónicos con colorantes ácidos recibe el nombre de
acidófila. Este tipo de reacciones no son tan específicos como las realizadas con
colorantes básicos.
Si bien el enlace electrostático es el factor principal en la unión primaria de un
colorante ácido con el tejido, no es el único; debido a ello, los colorantes ácidos a
veces se utilizan combinados para teñir selectivamente distintos componentes de
los teñidos.
Por ejemplo, en la técnica de teñido de Mallory, se utilizan tres colorantes ácidos:
Anilina azul tiñe colágeno.
 Fucsina acida tiñe el citoplasma y los eritrocitos, además de teñir los núcleos.
Naranja G
En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples, la hematoxilina se utiliza para teñir
primero los núcleos y luego se aplican los colorantes ácidos para teñir
selectivamente el citoplasma y las fibras extracelulares.
Dentro de la célula hay sustancias, además de la matriz extracelular presenta
basófila. Podemos mencionar
Heterocromatina y nucleolos del núcleo
Componentes citoplasmáticos
Materiales extracelulares
La tinción con colorantes ácidos es menos especifica que las tinciones básicas,
pero hay mas sustancias acidas que básicas dentro de la célula. Podemos
mencionar
La mayor parte de los filamentos citoplasmáticos, en especial los de las
células musculares.
Componentes membranosos intracelulares y la mayor parte del citoplasma
no especializado.
La mayor parte de las fibras extracelulares.

Metacromasia
Es el cambio de color normal de azul a rojo o púrpura de ciertos colorantes
básicos al reaccionar con componentes del tejido.
La metacromasia es la presencia de poli aniones en el tejido. Cuando estos tejidos
se tiñen con una solución colorante básica concentrada, como el azul de toluidina,
las moléculas de colorante están lo suficientemente cerca como para formar
aglomerados dimétricos y poliméricos.
Grupos aldehídos y el reactivo de Schiff
La capacidad de la fucsina básica decolorada (reactivo de Schif) para reaccionar
con los grupos aldehído trae como resultado la aparición de un color rojo distintivo
y es la base de las reacciones de ácido peryódico-reactivo de Schif y de Feulgen.
LA REACCIÓN DE ÁCIDO
PERIÓDICO-REACTIVO DE
SCHIFF tiñe hidratos de carbono y
macromoléculas con abundancia de
ellos. Este reactivo se usa en la
reacción de feulgen que se basa en
la hidrolisis débil con acido
clorhídrico para teñir ADN. La
reacción del reactivo de Schif con el ADN es estequiométrica, lo que signifca que
el producto de esta reacción es medible y es proporcional a la cantidad de ADN. El
material intracelular que se tiñe con la reacción de PAS se puede identificar como
glucógeno por el tratamiento previo de los cortes con diastasa o amilasa. La falta
de tinción después de este tratamiento identifica positivamente el material teñido
como glucógeno.
La tinción de acido periódico-reactivo de Schiirf (PAS), es una alternativa a los
métodos de tinción de IMPREGNACION ARGENTICA, que también se basan en
la reacción con las moléculas de sacáridos en los proteoglucanos.
LA REACCIÓN DE FEULGEN se basa en la separación de purinas de la
desoxirribosa del ADN mediante una hidrólisis ácida débil.
Histoquímica enzimática
Para poder preservar enzimas es necesario que en los cortes histológicos se fijen
con mucho cuidado.
Para ello, se utiliza el reactivo de captura, quien detecta el PRODUCTO DE
REACCION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
Este funciona de manera que atrapa o fija el producto de la reacción. Podemos
ejemplificar de manera que en una reacción típica para detectar el producto de la
reacción se coloca una solución que contiene sustrato y un agente de captura.
Inmunohistoquímica
Los anticuerpos, quienes son llamados también inmunoglobulinas, en el lab
pueden purificarse de la sangre y conjugarse con un colorante fluorescente.
Estos colorantes son productos químicos que absorben la luz de longitudes de
onda diferentes y luego emiten luz visible de una longitud de onda especifica.
Su utilidad radica en que se pueden utilizar en cortes de tejidos congelados o
fijados en el porta objetos donde se podrá localizar un antígeno en células y
tejidos.
La técnica de inmunohistoquímica para identificar la distribución de un antígeno
dentro de las células y tejidos se conoce como INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA. Esta técnica utiliza un anticuerpo primario marcado con fluorocromo
que reacciona con el antígeno dentro de la muestra.
Dentro de la inmunohistoquímica se utilizan dos tipos de anticuerpos:
1. Los anticuerpos policlonales, muestran una mezcla de diferentes
anticuerpos producidos por muchos clones, donde cada clon reconoce
diferentes regiones de la molécula de actina.
 2. Anticuerpos monoclonales, son los producidos por una línea celular
productora de anticuerpos que se derivan de un solo clon de linfocito B.
En la inmunohistoquímica, para identificar las células dianas en los tejidos se hace
de manera directa e indirecta.
De manera directa esta la técnica de inmunofluorescencia directa. En donde se
usa el fluorocromo y anticuerpo primario.
La inmunofluorescencia indirecta proporciona una sensibilidad mucho mayor que
los métodos directos y a menudo recibe el nombre de “técnica del emparedado” o
de “la capa doble”. En este caso el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo
secundario.
Técnicas de hibridación
Es un método de localización de ARNm o ADN mediante la hibridación de la
secuencia de interés con una sonda de nucleótidos de secuencia complementaria.
El termino hibridación, describe la capacidad de las moléculas monocatenarias de
ARN o ADN para interactuar con secuencias complementarias.
Microscopía
Como sabemos el microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y
permite ver mas detalles de lo que se es posible a simple vista.
La resolución del ojo humano, quiere decir la distancia de separación que deben
tener dos objetos para que se vean por separado (0,2 mm), esta determinado por
el espacio que hay entre las células fotorreceptoras contiguas de la retina.
La resolución depende no solo del sistema óptico, si no de la longitud de onda de
luz y de otros factores como el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la
intensidad de la tinción.
La resolución teórica es:
1. Longitud de onda de 540 nm
2. Luz proveniente de un filtro verde para la cual el ojo es muy sensible
3. Lentes objetivo
4. Condensador apropiado
5. Máxima resolución posible con un microscópico de campo claro seria de
alrededor de 0,2 micrómetro.
Componentes del microscopio de campo claro son:
1. Fuente luminosa (para la iluminación de la muestra una lampara en la base
del microscopio)
2. Lente condensador (para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra)
3. Platina (sobre la que se coloca el portaobjeto)
 4. Lente objetivo (recoge la luz que ha atravesado la muestra)
5. Lente ocular (a través de la cual se puede examinar directamente la imagen
formada por la lente de objetivo).

EXAMEN DE UN PREPARADO HISTOLOGICO

CON EL MICROSCOPIO OPTICO

En el procedimiento de la preparación de un preparado histológico pueden ocurrir

errores que están vinculados con la metodología, el equipo o los reactivos
utilizados. Estos pueden ser:
Imperfecciones en la ejecución de la metodología
Equipo inadecuado
Poca pureza de las sustancias químicas y de los reactivos utilizados en el
proceso.
Sistemas ópticos varían según su función, ya que algunos de ellos se utilizan para
aumentar el contraste sin teñir, mientras que otros están diseñados para visualizar
estructuras mediante el uso de técnicas especificas como la inmunofluorescencia.
Podemos mencionar
Microscopio de contraste de fases: Aprovecha las pequeñas diferencias en
el índice de refracción que hay en diferentes partes de una muestra de
células o tejidos. L
 Microscopio de interferencia: Permite la cuantificación de la masa
tisular
 Microscopio de interferencia diferencial: Presenta una utilidad
especial para valorar las propiedades de la superficie de las células y
otras muestras biológicas.
Microscopia de campo oscuro: Sólo la luz refractada por las estructuras de
la muestra penetra en el objetivo. El microscopio de campo oscuro está
equipado con un condensador especial que ilumina el preparado con
mucha intensidad y de forma oblicua. Así, el campo de visión aparece como
un fondo oscuro en el que las pequeñas partículas en la muestra que
reflejan parte de la luz en el objetivo aparecen brillantes.
Es útil en el examen de autor radiografías, en la que los gránulos de plata
revelados aparecen blancos en un fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia: Se utiliza para la detección de moléculas con
fluorescencia natural (autofuorescencia) como la vitamina A y algunos
neurotransmisores. La aplicación principal de este microscopio consiste en
examinar la fluorescencia secundaria, como en la detección de antígenos o
anticuerpos en los procedimientos de tinción inmunocitoquímica.
 Microscopio ultravioleta: Depende de la absorción de luz UV por las
moléculas en la muestra. el microscopio UV puede llegar a una resolución
de 0,1ȝm. La microscopía UV es útil en la detección de ácidos nucleicos,
específicamente las bases de purina y pirimidina de los nucleótidos.
También es útil para la detección de proteínas que contienen ciertos
aminoácidos. Utilizando longitudes de onda específicas de iluminación, las
mediciones espectrofotométricas UV se hacen por lo general a través del
microscopio UV para determinar de forma cuantitativa la cantidad de ADN y
ARN en las células individuales.
Microscopio con focal de barrido : Permite la visualización de una muestra
biológica en tres dimensiones.
Microscopio de polarización: Es una simple modificación del microscopio
óptico de campo claro en la cual un filtro de polarización, llamado
polarizador, se coloca entre la fuente de luz y la muestra, y un segundo
filtro, llamado analizador, se instala entre el lente objetivo y el observador.
Microscopia electrónica
Proporcionan datos morfológicos y analíticos en las células y tejidos, estos son:
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
Microscopio electrónico de transmisión (MET), utiliza la interacción de un haz de
electrones con la muestra para producir una imagen. El MET utiliza un haz de
electrones en lugar de un haz de luz.
El principio del microscopio es el siguiente:
• Una fuente de electrones (cátodo, cañón de electrones), como un filamento de
tungsteno calentado, emite electrones.
• Los electrones son atraídos hacia un ánodo.
Una diferencia eléctrica entre el cátodo y el ánodo imparte a los electrones un
voltaje de aceleración de entre 20000 y 200 000 voltios, generando el haz de
electrones.
• El haz pasa a través de una serie de lentes electromagnéticas que cumplen la
misma función que las lentes de cristal de un microscopio óptico
Es importante recalcar que la preparación de muestras para la microscopía
electrónica de transmisión es similar a la de la microscopía óptica excepto por la
necesidad de métodos más refinados.
Realmente los pasos son los mismos, pero en cada paso hay que trabajar con
muestras de tres a cuatro órdenes de magnitud más pequeñas o más finas que las
utilizadas para la microscopia óptica , la calidad de la fijación, es decir, el grado de
conservación de la estructura subcelular, debe ser la mejor que se pueda lograr.
La preparación de rutina de muestras para microscopía electrónica de transmisión
comienza con la fijación en glutaraldehído seguida de un enjuague en una
solución amortiguadora (bufer) y la fijación con tetraóxido de osmio. El
glutaraldehído, un dialdehído, preserva constituyentes de proteínas mediante
enlaces cruzados entre ellas; el tetraóxido de osmio reacciona con lípidos, en
particular fosfolípidos. El osmio también imparte densidad electrónica a las
estructuras celulares y tisulares, ya que es un metal pesado, mejorando así la
formación ulterior de la imagen en el MET. Lo ideal es que los tejidos se perfundan
con glutaraldehído equilibrado con bufer antes de extirparse del animal. Lo común
es que para el MET se fijen piezas de tejido de no más de 1mm3 (muy pequeñas
si se comparan con las piezas para el microscopio óptico, que pueden medirse en
centímetros). El proceso de deshidratación es idéntico al utilizado en la
microscopia óptica y el tejido se infiltra con una resina monomérica, por lo general
una resina epoxi, que después se polimeriza.
La tinción de rutina de los cortes para la microscopía electrónica de transmisión es
necesaria para aumentar el contraste inherente de modo que los detalles de la
estructura celular sean fáciles de ver y fotografar.
En general, los cortes para la microscopía electrónica de transmisión se tiñen
mediante la adición a la muestra de materiales de gran densidad, como iones de
metales pesados. Los iones de metales pesados pueden unirse a los tejidos
durante la fijación o la deshidratación o por la inmersión de los cortes, una vez
realizados, en soluciones de estos iones. El tetraóxido de osmio, que se utiliza de
manera rutinaria en el fijador, se une a los fosfolípidos de las membranas,
impartiéndoles densidad adicional.
La criofractura es una técnica especial de preparación de muestras para
microscopía electrónica de transmisión; de importancia especial en el estudio de
las membranas. El tejido que se ha de examinar puede estar fijado o no; si se ha
fijado, entonces el fijador se elimina de la muestra antes de proceder. Se deja que
un crioprotector como el glicerol infltre el tejido y a continuación éste se congela
rápidamente a unos –160 °C. La formación de cristales de hielo se evita por el uso
de crioprotectores, por la congelación rápida y por lo diminuto de las muestras. El
tejido congelado se coloca en el aparato de criofractura, que posee una cámara de
vacío, y se percute con el borde de una cuchilla o navaja.