Manual de Prácticas de Inmunología William Cornejo y Pilar Alva

PREPARACION DE ANTÍGENOS DE PARÁSITOS

OBJETIVO
• Describir la metodología de preparación de antígenos de parásitos y examinar
sus usos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Preparar antígenos de excreción-secreción de quiste hidatídico para ser
usados en la prueba de inmunodifusión doble.

• Preparar antígeno somático de Fasciola hepatica para ser usado en la prueba

de doble inmunodifusión.

• Estandarizar los antígenos de quiste hidatídico y de F. hepatica, adaptando la

metodología empleada en la normalización del antígeno de quiste hidatídico.

L os parásitos producen numerosos y potentes antígenos que evocan una

respuesta inmune por parte del hospedero. Los antígenos parasitarios son
proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, y en pocos casos lipoproteínas o
lipopolisacáridos. En la mayoría de los casos el antígeno es un inmunógeno, pero
también puede ser un hapteno.
Algunos de estos antígenos forman parte de las estructuras morfológicas del
parásito y han sido denominados antígenos somáticos, estructurales o
endoantígenos. Otros antígenos son productos de la actividad fisiológica del
parásito y se les denomina antígenos metabólicos, exoantígenos o productos de
excreción y secreción.
Por razones de conveniencia, las preparaciones antigénicas utilizadas en
parasitología han sido extractos completos del parásito, con predominio de los
antígenos somáticos sobre los antígenos metabólicos. Sin embargo, muchos de
los antígenos somáticos dan lugar a reacciones cruzadas, un serio inconveniente
en la obtención de antígenos específicos de utilidad en vacunación,
inmunodiagnóstico o en estudios de inmunopatología. El empleo de métodos
bioquímicos y de biología molecular ha permitido aislar y caracterizar fracciones
antigénicas específicas de los diferentes parásitos.

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 Los métodos más comunes para la obtención de antígenos parasitarios a
partir de tejidos, células enteras o antígenos solubles son: congelación-
descongelación, sonicación, homogenización, presión (prensas y bombas),
precipitación con sales, filtración, centrifugación y solubilización. La purificación de
los antígenos se logra mediante ultracentrifugación, electroforesis, cromatografía,
isoelectroenfoque o electroelusión.

ANTÍGENOS DEL QUISTE HIDATÍDICO

Los antígenos parasitarios que estimulan al portador del quiste están
contenidos en el líquido hidatídico, en el cual han podido detectarse hasta 12
poblaciones moleculares diferentes de origen parasitario, mediante la
inmunoelectroforesis.
En lo que se refiere al inmunodiagnóstico, la condición ideal es poder contar
con un antígeno que se encuentre en alta concentración en el líquido hidatídico,
que sea altamente inmunogénico y que sea específico del parásito.
El líquido del quiste hidatídico es una mezcla compleja de antígenos del
parásito y proteínas séricas del hospedero, lo cual ha limitado su utilización para
el diagnóstico específico de la hidatidosis. Dos de estos antígenos inicialmente
denominados antígeno 5 (Ag 5, Capron y colaboradores, 1967) y antígeno B o 4
(Ag B, Chordi y Kagan) son inmunodominantes en preparaciones antigénicas del
parásito, tienen una relación de 1:10 en el líquido hidatídico y tienen
inmunorreactividad alta con sueros de pacientes con hidatidosis.
El Ag 5 es un complejo de lipoproteína de alto peso molecular compuesto por
subunidades de 57 y 67 kDa, los cuales bajo condiciones de reducción se
disocian en subunidades de 22-24 y 38 kDa. Este antígeno es compartido por
varios parásitos, incluso personas sanas tienen anticuerpos que reconocen
epitiopos del Ag 5.
El Ag B, el cual constituye el 10% del contenido total del líquido hidatídico, es
una lipoproteína termoestable de 160 kDa, la cual produce tres subunidades de 8
o 12, 16 y 20-24 kDa en condiciones reductoras. Esta proteína está localizada en
el tegumento del protoescólex y membrana germinativa del metacestodo, de
donde es secretada al líquido hidatídico. Esta proteína es un componente de
mucha especificidad para la equinococosis; sin embargo, es compartida entre las
diferentes especies de Echinococcus.
En la práctica se preparará el Ag 5 de quiste hidatídico usado en las pruebas

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de precipitación.
El líquido hidatídico se obtiene de quistes fértiles o estériles de cualquier
especie de hospedero: ovino, bovino, porcino, equino, etc. La fuente más
accesible para la obtención de estos quistes la constituyen las vísceras infectadas
(especialmente hígados y pulmones) de animales sacrificados en camales. Las
fuentes más comúnmente utilizadas en nuestro país son quisted de ovinos y
vacunos.

MATERIALES
1. Vísceras infectadas con quistes 6. Frascos de penicilina para
hidatídicos liofilización
2. Agua destilada 7. Agujas Nº18
3. Jeringas de 20 ó 50 mL 8. Bolsas de diálisis
4. Probeta de 100-250 mL 9. Centrífuga
5. Tubos de centrífuga de 13 x 100 mm 10. Bocal con lejía

PROCEDIMIENTO
1. Extraer el líquido hidatídico de los quistes localizados en las vísceras, por
punción y aspiración, con aguja y jeringa.
2. Depositar el líquido extraído, el cual deberá tener una apariencia clara, en una
probeta graduada.
3. Dejar descansar el líquido, por 30-60 minutos, para permitir la sedimentación
de la arenilla hidatídica.
4. Transferir el líquido hidatídico a tubos de centrífuga y centrifugar a 2 500 rpm
por 5-10 minutos.
5. Transferir el sobrenadante a una bolsa de diálisis, y dializar contra un volumen
5 veces mayor de agua destilada. Realizar la diálisis a 4 ºC. Realizar 5
cambios de agua destilada en un lapso de 36 horas.
6. Después de la diálisis, trasvasar el líquido a frascos de penicilina para su
liofilización.

ESTANDARIZACIÓN DEL ANTÍGENO DE QUISTE HIDATÍDICO

El antígeno preparado es comparado con un antígeno de quiste hidatídico de
referencia (CEPANZO-Buenos Aires-Argentina), utilizando un suero de referencia
anti-líquido hidatídico. La técnica recomendada para evaluar la calidad del

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 antígeno preparado es la inmunoelectroforesis. El antígeno es considerado
adecuado para ser usado en las pruebas de inmunodiagnóstico de la hidatidosis
si la banda de precipitación arco 5 puede ser observada con su morfología y
localización característica.

MATERIALES
1. Antígeno de líquido de quiste 8. Lámina portaobjetos de
hidatídico, preparado en clase 76x26mm
2. Antígeno de líquido de quiste 9. Pipeta de 5 mL
hidatídico, estándar 10. Pipetas Pasteur
3. Suero de referencia anti-líquido de 11. Patrón para cortar el gel
quiste hidatídico 12. Cortadores de gel
4. Agarosa al 1% en buffer barbital, 13. Papel Whatman Nº1
pH 8,2 14. Cámara húmeda para incubación
5. Buffer barbital, pH 8,2 15. Cámara de electroforesis
6. Solución salina fisiológica 16. Fuente de poder, de alto voltaje
7. Colorante amido Schwarz (amido 17. Bocal con lejía
black)

PROCEDIMIENTO
1. Colocar 3,5 mL de agarosa licuada en una lámina portaobjetos, dejar gelificar
a temperatura ambiente. Poner la lámina en una placa petri y dejar enfriar
durante 15 minutos a 4 ºC.
2. Poner la lámina sobre el diagrama (Figura 1). Cortar en el gel excavaciones
para los antígenos y el antisuero control.

76 mm

1 mm

21 mm 4 mm 12 mm

1 mm
10 mm 10 mm 26mm

1 mm

21 mm 4 mm 12 mm

- +
Figura 1

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3. Extraer la agarosa de los orificios correspondientes al antígeno y llenarlos con

los dos antígenos, el estándar y el preparado en clase. Inmediatamente, con
un tubo capilar colocar una pequeña gota de azul de bromofenol en el borde
de la lámina, a la misma altura del orificio del antígeno.
4. Depositar la lámina sobre la cámara de electroforesis y, mediante una tira de
papel filtro, establecer contacto entre los extremos de la lámina y el buffer de
la cámara. Observar la orientación de la lámina respecto al ánodo (polo +) y al
cátodo (polo -) en la figura 1.
5. Prender la fuente de poder a 100 - 120 voltios y dejar correr los antígenos
durante 90 minutos, o cuando el borde distal de la mancha de azul de
bromofenol haya migrado 35 mm.
6. Al terminar la corrida electroforética del antígeno, retirar el gel de la canaleta
central y colocar en ella el suero de referencia.
7. Depositar la lámina en cámara húmeda y dejar difundir los reactivos a
temperatura ambiente durante 48 horas.
8. Lavar en suero fisiológico, sumergiendo la lámina en la solución durante 36
horas, realizando cinco cambios del suero fisiológico a intervalos regulares.
9. Cuando el lavado ha terminado, sumergir la lámina en agua destilada por 10
minutos, luego envolverla en papel de filtro (Whatman), previamente
humedecido en agua destilada, y poner a secarla en estufa a 37 ºC o a
temperatura ambiente.
10. Cuando la lámina haya secado, retirar el papel filtro con cuidado y proceder a
colorear la lámina con amido black, un colorante para proteínas.
11. Después de la coloración, enjuagar la lámina con agua destilada, escurrirla y
sumergirla en la solución decolorante hasta que las áreas libres de
precipitación estén claras.

RESULTADOS
• El antígeno preparado, para ser considerado adecuado para su uso, debe
producir una línea de precipitación, arco 5, que sea una imagen especular de
la línea de precipitación producida entre el antisuero de referencia y el
antígeno de referencia (Figura 2).

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 Figura 2. Control de antígeno
AGR: Antígeno de referencia
ASR: Antisuero de referencia
A: Antígeno bajo control
Las flechas señalan el arco 5.

ANTÍGENOS DE Fasciola hepatica

Para el inmunodiagnóstico de la distomatosis, fundamentalmente en el período
agudo de la enfermedad, es posible detectar mediante la técnica de
inmunoelectroforesis la presencia de una línea de precipitación específica para
esta parasitosis, denominada arco 2. La falta de sensibilidad de la prueba motivó
la búsqueda de nuevos antígenos, entre los cuales los antígenos de excreción-
secreción y los antígenos purificados (cistein proteasas o cathepsinas) han sido
los más útiles.
En la práctica se preparará el antígeno somático empleado en la prueba de
inmunoelectroforesis. La obtención de los distomas adultos se hace a partir de
hígados infectados, generalmente de ganado ovino o bovino sacrificados en
camales.

MATERIALES
1. Hígados infectados con F. hepatica 7. Pipetas Pasteur con tetina
2. Suero fisiológico 8. Tubos de centrífuga de
3. Agua destilada polietileno
4. Placas Petri 9. Bolsas de diálisis
5. Homogenizador teflón-vidrio 10. Bisturí, pinzas y tijeras
6. Mortero 11. Centrífuga refrigerada

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PROCEDIMIENTO
1. Con ayuda del bisturí, cortar los canalículos biliares y con las pinzas extraer
cuidadosamente los distomas, depositándolos en las placas Petri conteniendo
suero fisiológico.
2. Lavar 3-4 veces los distomas en suero fisiológico.
3. Con la ayuda de las tijeras, cortar los parásitos en pequeños trozos.
4. Trasvasar los parásitos seccionados al tubo de homogenización. Colocar el
émbolo y homogenizar los parásitos.
5. Vaciar el homogenizado en un mortero y colocarlo en congelación a –20ºC.
6. Descongelar mediante golpes continuos con el mango del mortero y volver a
congelar.
7. Repetir 3-6 veces más esta congelación y descongelación.
8. Transferir a tubos de centrífuga y centrifugar a 10 000 rpm por 30 minutos.
9. Colocar el líquido sobrenadante en una bolsa de diálisis y dializar contra un
volumen 10 veces mayor de agua destilada. Realizar 4 cambios de agua
destilada.
10. Después de la diálisis, trasvasar el líquido a frascos de penicilina para su
liofilización.

ESTANDARIZACIÓN DEL ANTÍGENO DE F. hepatica

El antígeno obtenido en clase se controla mediante la técnica de
inmunoelectroforesis, utilizando un suero de referencia para detectar la presencia
del arco 2.

Arco 2

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 BIBLIOGRAFÍA
1. Centro Panamericano de Zoonosis. Prueba de doble difusión arco 5 para el
diagnóstico de la hidatidosis humana. Of Sanit Panam, Nota técnica Nº22,
1979.
2. Gómez J C. Valor diagnóstico de inmunoblot con líquido hidatídico humano,
frente a antígeno ovino y bovino. Rev Mex Patol Clin 51: 75-89, 2004.
3. Hillyer G V. Serological diagnosis of Fasciola hepatica. Parasitol al Día 17:130-
136, 1993.
4. Sánchez EL, Cáceres O A, Náquira C G. Aislamiento y purificación de una
fracción antigénica de 21 a 31 kDa de líquido de quiste hidatídico de
Echinococcus granulosus. Serie de Informes técnicos Nº 22. INS, 2004.
5. Schantz P M, Kagan I G. Echinococcosis (Hydatidosis). En: Immunological
investigation of tropical parasitic diseases, Houba V (ed.), Churchill
Livingstone, Edinburgh, Cap. 8, 1980.

“Quien no se deja comprender, no sabe

expresarse: el arte de la elocuencia depende
mucho de saber colocarse al nivel intelectual de su
auditorio”

Manuel Gonzáles P.