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Fin - Producción de proteína libre - Tecnología ClearColi ™

Uwe Mamat 1, Testamento
Antiguo Ronald W. IoWoodard
txilnortemi 2Por Kathleen Wilke1, Chad Souvignier3, David Mead4, Eric Steinmetz4, Kristin Terry4, Chelsea Kovacich4, Andrew

Zegers4, Curtis Knox4

earchth
1: ResA o tur s
r Borstel, Borstel, Alemania; 2: Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI; 3: Research Corporation Technologies, Tucson, AZ;
Ce Nuevo Testamento mi

4: LucLigoecnaCtiornporation, Middleton, WI

Abstracto Tecnología ClearColi ™

La bacteria Gram-negativa E. coli es el caballo de batalla de la biología Las células competentes de ClearColi tienen un LPS modificado
molecular, que se utiliza habitualmente como hospedador de primera genéticamente que no causa una respuesta endotóxica en las
elección para la clonación de ADN, la expresión de proteínas a células humanas. Esto se ha logrado modificando radicalmente
pequeña escala y la producción de proteínas a gran escala para los la producción de LPS mediante la incorporación de siete
productos biológicos aprobados por la FDA. Una de las principales deleciones genéticas (ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxPΔ
limitaciones en el usoE. coli se refiere al componente lipopolisacárido eptA). Una mutación compensadora adicional (msbA148)
(LPS) de la membrana externa. El LPS es una endotoxina que es un permite la viabilidad en presencia de lípidos IVA.
potente activador de muchas células inmunes a través del receptor
En las células ClearColi, las cadenas de polisacáridos se eliminan y
tipo Toll-4 (TLR4) y puede desencadenar directamente un choque
se han eliminado dos cadenas de acilo secundarias del LPS
endotóxico (choque séptico), lo que resulta en problemas médicos
normalmente hexaacilado, que es un determinante clave de la
graves y la muerte. Tal componente tóxico requiere una eliminación
endotoxicidad en las células eucariotas. Las seis cadenas de acilo
extensa y costosa durante la purificación de proteínas. Además de las
del LPS son el desencadenante que es reconocido por TLR4 en
aplicaciones médicas, el LPS no es deseado en la investigación básica
complejo con el factor de diferenciación mieloide 2 (MD-2),
que involucra células y tejidos humanos, ya que los experimentos de Fig 4. Comparación de la respuesta endotóxica de la
provocando la activación de NF-κB y la producción de citocinas
toxicidad se ven comprometidos debido a la presencia de proteína derivada de células competentes ClearColi BL21
proinflamatorias. La deleción de las dos cadenas de acilo
endotoxinas. Los métodos actuales para la eliminación de (DE3) y BL21 tradicional (DE3).
secundarias da como resultado el lípido IVA, que no induce la
endotoxinas son variados, incluyendo ultrafiltración, carbón activado,
formación del complejo hTLR4 / MD-2 heterotetramérico activado .
tensioactivos, cromatografía de intercambio aniónico y sefarosa
y, por tanto, no desencadena la respuesta endotóxica. Además, se
No especificidad del ensayo LAL
inmovilizada. Cada una de estas estrategias implica efectos negativos: Limulus La prueba del ensayo de amebocitos (LAL) es un método
elimina la cadena de oligosacáridos, lo que facilita la eliminación
pérdida significativa de rendimiento, alto costo, pérdida de aprobado por la FDA para la detección de endotoxinas y el ensayo más
del lípido IV resultante.A de cualquier producto aguas abajo (ver Fig
bioactividad de la proteína, utilizado; sin embargo, el ensayo LAL es activado únicamente por la
2).
cadena principal 4´-monofosforildiglucosamina de LPS. La actividad de
Eliminando LPS del E. coli La membrana externa es una vía técnicamente
LAL está mínimamente influenciada por el patrón de acilación de LPS, el
más deseable para limpiar proteínas recombinantes, lo que puede
determinante clave de la endotoxicidad en las células eucariotas. El
conducir a nuevas E. coli cepas que son útiles como herramientas de
ensayo LAL también reconoce un espectro más amplio de variantes de
investigación y potencialmente como plataforma de producción de
LPS / lípido A que el sistema sensor de endotoxina celular central del
proteínas para proteínas terapéuticas. Lucigen, en combinación con
sistema de células inmunitarias humanas. Como tal, los resultados falsos
Research Corporation Technologies, ha desarrollado una nueva línea de
positivos pueden y resultarán debido a la falta de especificidad del
E. coli células competentes llamadas ClearColi ™. Estas células han sido
ensayo.
modificadas genéticamente para eliminar los desencadenantes de la
respuesta inmunitaria asociados con LPS y, al mismo tiempo, conservar Un simple paso de purificación en columna de Ni para proteínas
la viabilidad y la capacidad de expresión de proteínas. Al eliminar el LPS producidas a partir de células ClearColi reducirá los niveles de respuesta
ofensivo, la purificación de proteínas recombinantes para ensayos de LAL en un 95% o más (ver Fig. 5). Sin embargo, las mediciones de la
basados en células posteriores se reduce a un simple proceso en unidad de endotoxina residual (UE) se deben a la naturaleza no
columna de níquel. Se presentarán datos de respuesta inmune de específica del ensayo, a menos que exista una contaminación externa
múltiples métodos para la detección de endotoxinas, demostrando que por LPS de otras fuentes. Los ensayos de toxicidad alternativos, como los
las proteínas expresadas a partir de esta nueva línea celular no causan que utilizan células HEK-Blue ™ -4 (ver Fig. 4), sugieren que incluso en
prácticamente ninguna producción de citocinas inflamatorias, presencia de niveles de EU por encima de los umbrales que
eliminando la necesidad de tratamientos de eliminación de endotoxinas. normalmente apuntan los investigadores, los efectos inmunogénicos
Fig 2. Comparación de la estructura del LPS normal de K-12 E. coli reales de las proteínas derivadas de ClearColi son inexistentes.

Introducción a las endotoxinas / LPS frente a lípidos IV deficientes en polisacáridosA de las células Debido a la no especificidad del ensayo LAL cuando se combina
ClearColi. con lípido IVA de ClearColi, se sugiere que los investigadores
En E. coli, hay ~ 2 x 106 Moléculas de LPS por célula, que representan el
30% del peso bruto total de la membrana externa (ver Figura 1). En el consideren métodos alternativos de medición de endotoxinas.
Comparación de expresión de proteínas
cultivo de células de mamíferos, la contaminación con LPS desencadena
Cuando se cultivan a densidades suficientes, las células ClearColi BL21 (DE3)
la secreción de citocinas proinflamatorias, crecimiento celular deficiente,
producen niveles de proteína similares a los de las células BL21 (DE3) Fig 5. Comparación de
eficiencia de transfección de ADN reducida, diferenciación problemática,
normales cuando se comparan números iguales de células (ver Fig. 3). la respuesta LAL en
muerte celular y resultados experimentales comprometidos. En los seres
humanos, el LPS activa el sistema inmunológico, provocando un choque proteínas derivadas de
endotóxico o incluso la muerte. normal BL21 (DE3)
células y ClearColi
Células BL21 (DE3) después
Purificación de columna de Ni. Sin
eliminación de endotoxinas
se realizaron los pasos,
sin embargo, la respuesta LAL
se reduce significativamente
en> 95%.

Fig 1. Diagrama de E. coli membrana con LPS que se extiende Conclusiones

fuera de la célula. Modificando genéticamente el LPS de E. coli Células BL21 (DE3), hemos
creado células competentes capaces de expresar proteínas adecuadas
Desafíos de eliminación de endotoxinas para ensayos de toxicidad posteriores en células humanas sin la
Fig 3. Comparación de la expresión de proteínas en ClearColi BL21 (DE3) y Lucigen E. necesidad de métodos de eliminación de endotoxinas. En la mayoría de
Existen varios métodos diferentes para la eliminación de endotoxinas,
Cloni® Células competentes EXPRESS BL21 (DE3). Se cultivaron células que contenían los casos es suficiente una simple purificación en columna IMAC.
todos los cuales tienen desventajas. un plásmido de expresión de T7 que albergaba un gen que codifica la
apolipoproteína A1 humana (ApoA1) en medio LB Miller a 37ºC. Cuando las culturas
• Los rendimientos de la purificación de proteínas son similares a los de las cepas estándar
alcanzaron la DO600 de 0,6 a 0,8, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG
Método Desventajas 0,4 mM y se continuó la incubación durante 3 horas. Se lisaron números equivalentes • Se necesita una purificación mínima para eliminar los lípidos por vía intravenosaA
Ultrafiltración • Solo útil para proteínas pequeñas de células no inducidas (-) e inducidas (+) calentando en tampón Laemmli y las
• Los monómeros de endotoxina pueden penetrar la membrana debido a la • Las proteínas purificadas ClearColi ™ no activan los ensayos
muestras se analizaron mediante SDS-PAGE en un gel en gradiente de poliacrilamida
interacción endotoxina / proteína
del 4% al 20%. relevantes: no hay estimulación de la cascada de hTLR4
• Ineficaz para proteínas que pueden ser dañadas por fuerzas
físicas • Importantes ahorros de tiempo y costos: menores requisitos de
Carbón activado • Actividad adsorbente de endotoxinas y proteínas Endotoxicidad de las proteínas finales purificación antes del cribado basado en células
Tensioactivos • Costoso
La proteína ApoA1 se expresó a partir de un plásmido basado en el • Elimina el arrastre de LPS y los efectos secundarios asociados
• Puede afectar la bioactividad de las proteínas

• Difícil de eliminar por completo promotor T7 en células BL21 (DE3) y CleatColi BL21 (DE3) normales, • Reduzca los falsos positivos en los ensayos de citocinas, mejore la
• La eliminación puede provocar la pérdida del producto. seguido de una simple etapa de purificación en columna IMAC sin confianza en sus resultados
Intercambio de aniones • Alta adsorción de endotoxinas y proteínas ácidas ninguna etapa posterior de eliminación de endotoxinas. A
cromatografia • Sin selectividad para adsorber endotoxinas
continuación, las proteínas purificadas se ensayaron para determinar También se están desarrollando cepas de ClearColi adicionales para la
Sefarosa inmovilizada con
histamina e histidina
• Capacidad de eliminación dependiente de la fuerza iónica
la estimulación de TLR evaluando la activación de NF-κB en células producción de plásmidos y aplicaciones de presentación de fagos.
• Actividad biológica de la histamina
HEK-Blue ™ -4 que expresan TLR4 humano. La proteína derivada de
Sefarosa inmovilizada con • Pérdidas de proteínas debido a la interacción iónica entre la polimixina B y
polimixina B las células ClearColi BL21 (DE3) no demostró activación a
la proteína. Lucigen Corp.
• La polimixina B es fisiológicamente activa concentraciones 4 órdenes de magnitud mayores que la proteína de 2905 Calle Parmenter
las células BL21 (DE3) tradicionales (ver Fig. 4). Middleton, WI EE. UU.
608-831-9011
888-575-9695
Las células ClearColi ™ Competent Cells están sujetas a la patente de EE. UU. 8,303,964 y otras patentes pendientes de EE. UU. Y extranjeras. Para obtener información sobre las licencias de ClearColi
lucigen@lucigen.com
programa, visite www.clearcoli.com www.lucigen.com