1.1 Práctica No.

002 – Microscopia, tinciones e introducción a la

bacteriología – No. Sesiones 02

1.1.1 Tema a desarrollar

El microscopio es un instrumento de gran utilidad en el estudio y observación de microorganismos

que no son visibles a simple vista, como las bacterias, hongos, y ciertos parásitos que de otro modo
serían invisibles a los ojos del ser humano (Garcia & Isenberg, 2010). Está compuesto por una serie
de lentes y varios componentes mecánicos y ópticos, entre ellos una fuente de luz que magnifica e
ilumina objetos diminutos (Morello, Mizer, & Wilson, 2003). Debe realizar tres funciones: producir una
imagen ampliada de la muestra, separar los detalles de la imagen y hacer que estos se vean visibles
al ojo humano o a la cámara(Cherry, 2002).

El laboratorio, los microscopios representan una considerable inversión y requieren un cuidado

especial para evitar daños (Hayes & Gammon, 2010) , debido a que pueden ser utilizados por varias
personas durante el día y trasladado desde el área de almacenamiento al lugar de trabajo lo que
aumenta la posibilidad de daño al equipo (Sastry & Bhat, 2018). La introducción a la microscopía es
importante tanto para el estudiante como para el docente, porque en cada sesión de laboratorio se
perfeccionarán las técnicas y usos del microscopio (Brown & Smith, 2015).

Sistema óptico

La lámpara incorporada a la base es la fuente de luz que se dirige hacia arriba a través del
condensador (Sastry & Bhat, 2018). El condensador contiene lentes que recogen y concentran la luz,
dirigiéndola hacia cualquier objeto enfocado (Pawley, 2006). También se tiene un obturador o
diafragma iris, que ajusta la cantidad de luz emitida por la lámpara (contraste), de acuerdo con los
aumentos de los objetivos 4X (enfoque o escaneo), 10X (búsqueda o baja potencia), 40X
(diagnóstico o alta potencia) y 100X (aceite de inmersión), establecidos según sea la ampliación
requerida por el operador desde los oculares (binoculares) (Benson, 2002; Brown & Smith, 2015). En
los microscopios binoculares se puede regular la distancia entre oculares para ajuste de dioptrías
simplemente separando o juntando los oculares (Cappuccino & Welsh, 2018). Es importante recordar
que a medida que aumenta la ampliación, la resolución también debe aumentar (Brown & Smith,
2015).

Sistema mecánico

La base sirve de sostén para todas las estructuras, la platina, por ejemplo, donde se colocan los
portaobjetos mediante un sistema de abrazaderas y un vernier que permite ubicar un campo
determinado, con movimientos verticales y horizontales (Morello et al., 2003). El brazo sostiene al
cabezal giratorio que contiene los binoculares y el revólver con los objetivos (Cappuccino & Welsh,
2018). También a los laterales de la estructura principal del microscopio binocular se encuentran los
tornillos macro y micrométricos, que permiten subir o bajar la platina con el portaobjetos (Benson,
2002).

Tinciones

El estudio microscópico se complementa con preparaciones fijadas que se pueden observar durante
un tiempo prolongado, mientras que las preparaciones en fresco se analizan rápidamente, en
algunas ocasiones es necesario sellarlas, aunque presentan limitaciones como el movimiento
browniano (Morello et al., 2003). La tinción es necesaria para producir contraste de color y aumentar
la visibilidad del objeto, existen varias tinciones o modificaciones de técnicas, que dependen del
microorganismo en estudio bacterias, hongos y virus (Wanger et al., 2017) . Antes de la tinción, se
realiza la fijación del frotis bacteriano al portaobjetos, calentando suavemente una película de
bacterias secadas al mechero (Sastry & Bhat, 2018). Según Benson (2001), el frotis bacteriano es
muy importante debido a que preparado adecuadamente no debe ser demasiado espeso, el concepto
más importante, es entender que solo se necesita una pequeña colonia aislada a partir de medios
sólidos para hacer una placa con un buen frotis.
Para bacteriología, la tinción ácido-ácido (Ziehl-Neelsen) y de Gram (diferencial), que divide a las
bacterias en Gram-positivas (azul a púrpura) y Gram-negativas (rosadas) (Mahon & Lehman, 2019).
Suelen ser las más empleadas. Para hongos o parásitos pueden requerirse tinciones especiales o
técnicas de concentración (Greenwood, Barer, Slack, & Irving, 2012). Estos colorantes reaccionan
de manera ácida, básica o neutra (Morello et al., 2003).
Las tinciones de Wright, Giemsa o Diff-Quik frecuentemente se usan en frotis de sangre y médula
ósea para visualizar estructuras fúngicas como hifas, conidias y levaduras intracelulares, por ejemplo
Histoplasma capsulatum (Mahon & Lehman, 2019; Morello et al., 2003). Los frotis sanguíneos se
pueden fijar de forma química con etanol, ácido acético, cloruro mercúrico, formaldehído, metanol y
glutaraldehído (Sastry & Bhat, 2018). Sin embargo, este método no es recomendado para observar
ciertas bacterias como Helicobacter pylori (An & Friedman, 2000).

Introducción a la bacteriologia

Las bacterias son pequeñas células procariotas, cuya longitud es de 0.2 a 10 µm (Tang, Sussman,
Liu, Poxton, & Schwartzman, 2015). La clasificación preliminar de bacterias se basa en la forma
(cocos, bacilo y espirilos), disposición (pares, cadenas o grupos), propiedades específicas de
crecimiento (aerobias o anaerobias, anaerobios facultativos) (Murray, 2018).

Poseen membrana plasmática, pared celular y algunas especies también producen cápsulas (Mahon
& Lehman, 2019). La malla de peptidoglucano de la pared celular bacteriana rodea la membrana
citoplasmática y protege las estructuras celulares internas de las fuerzas osmóticas y físicas
(Struthers, 2017). Los diferentes tipos de paredes celulares en las bacterias han categorizado a las
bacterias Gram positivas y negativas (Mahon & Lehman, 2019), en el caso de las micobacterias
tienen una pared celular modificada llamada pared celular resistente al ácido, mientras que los
micoplasmas son bacterias que no tienen pared celular y, por lo tanto, no se tiñen con Gram (Murray,
Rosenthal, & Pfaller, 2016).

El cultivo de bacterias a partir de muestras tomadas de infecciones se logra generalmente con la

inoculación directa en medios de cultivo, inicialmente se realiza un inóculo primario y mediante
estrías secuenciales se obtienen colonias bacterianas individuales (Tille, 2017). El transporte de
microorganismos se realiza con un asa de inoculación que debe ser esterilizada al rojo vivo directo
en llama azul de mechero del Bunsen (Hottes, Rusek, & Sharples, 2012).

En la identificación bacteriana la morfología colonial incluye lo siguiente: Tamaño de la colonia

(generalmente medido en milímetros o descrito en términos relativos como puntual, pequeño,
mediano, grande), coloración, forma de la colonia (incluye, elevación y borde de la colonia, aspecto
de la superficie de la colonia (brillante, opaco, seco y transparente) (Gurgui, 2002). Además, cada
bacteria tiene un metabolismo diferente lo que ocasiona diferentes cambios en los medios de agar
como resultado del metabolismo (hemólisis, cambios de pH, orificios, etc.), cabe mencionar que
ciertas bacterias producen olores distintos que pueden ayudar en la identificación preliminar (Chun,
Yang & Choi, 2006).
Objetivos de la práctica
1. Identificar los componentes básicos de un microscopio óptico y comprender el
funcionamiento de cada uno de ellos.
2. Conocer el uso, cuidado y almacenamiento apropiado de un microscopio óptico.
3. Observar preparaciones en fresco y con tinción.
4. Conocer la utilidad de las tinciones simples, diferenciales y especiales.
5. Diferenciar tamaño, morfología, agrupación y reacción Gram de los microorganismos.
6. Distinguir la importancia para inferir en la selección de los medios de cultivo adecuados, las
técnicas y condiciones específicas para el crecimiento e identificación microbiana

1.1.2 Alcance

Esta práctica cubre desde el manejo adecuado del microscopio hasta la realización de diferentes
técnicas de tinción. Así como el conocimiento de la composición de un medio de cultivo, consistencia
hasta las diferentes técnicas para aislar y las condiciones de crecimiento de los microorganismos.

1.1.3 Requisitos previos a la realización de la práctica

 Previamente a la realizar la práctica el estudiante debe:

 Leer de manera comprensiva la guía de la práctica.
 Conocer las partes del microscopio y su función. Se recomienda revisar el material en el aula
virtual
 Conocer sobre el fundamento, metodología y aplicación de las tinciones. Se recomienda revisar
el material en el aula virtual y el siguiente link:

https://learn.chm.msu.edu/vibl/vibl/GramStain/gram_stain_HTML5Canvas.html

 Revisar los recursos disponibles en el aula virtual.

 Leer la sección introducción de este manual donde se describen los medios de cultivo y
requerimientos de crecimiento de microorganismos.
 Conocer el fundamento y metodología de las técnicas de estriación disponibles en el
siguiente link:
https://www.asmscience.org/docserver/fulltext/education/protocol/protocol.3160.pdf?
expires=1566317133&id=id&accname=guest&checksum=821EF022CE3E386E989BAA5525
8DF9FD

1.1.4 Aparatos, equipos e instrumentos

Aparatos, equipos e instrumentos Cantidad Requisitos técnicos

Microscopio binocular 30 NA
Microscopio trinocular 1 NA
Mechero bunsen 18 NA

1.1.5 Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados

No es aplicable.

1.1.6 Materiales y reactivos

Materiales Reactivos
30 Placas portaobjetos 10 mL Aceite de inmersión

30 Palillos 30 mL Cristal Violeta

9 Cajas de fósforos 30 mL Lugol

60 guantes S 30 mL Alcohol – cetona

60 guantes M 30 mL Safranina

30 guantes L 30 mL Solución GIEMSA

60 Papel limpia lentes 30 mL Metanol

9 Pinzas tinción 10 mL Fucsina básica fenificada

9 asas microbiológicas 10 mL Solución Azul de metileno

9 cronómetros 10 mL Suero fisiológico

9 Contenedores para material corto 10 mL Alcohol ácido

punzante

2 Basurero para desechos biológicos 300 mL Etanol 70% (Antiséptico)

y comunes

30 Pipetas pasteur plástico 1mL

9 Agujas de inoculación

9 Lápices dermográfico

2 paquetes Papel limpia lentes

30 hisopos

Medios de cultivo

30 Caldo nutriente

30SIM

30 TSI

30 Agar nutritivo

1.1.7 Recursos adicionales

Microorganismos y medios de cultivo

 30 cajas bipetri con bacterias Gram (+) y Gram (-)
30 placas fijadas de bacterias con tinciones Gram positivas (+) y Gram negativas (-)
9 placas BAAR +/-
9 placas con tinción de Giemsa
30 tubos con medio de cultivo líquido mixto bacteria Gram (+) y Gram (-)
30 Cajas bipetri Agar sangre (tipo de hemólisis: S. viridans, S. aureus,)
30 Cajas bipetri Agar EMB (Salmonella sp., Escherichia coli)

1.1.8 Descripción del procedimiento

Las normas del adecuado manejo del microscopio son indispensables en todas las prácticas donde
se utilice un microscopio.
Durante la observación microscópica de microorganismos siempre es necesario recorrer varias áreas
del portaobjetos.

Cuidados en el manejo del microscopio

1. Retire todos los materiales innecesarios (incluidos libros, papeles, etc.) del mesón del
laboratorio.
2. Verifique que el equipo esté completo y limpio. Nunca coloque los dedos sobre oculares y
objetivos.
3. Asegúrese que la platina esté limpia, seca y se encuentre en el tope inferior. Verifique que el
revólver se encuentre en posición del objetivo de 4X.
4. Asegúrese que el portaobjetos esté seco al momento de colocarlo sobre la platina.
5. Asegure el portaobjetos en la platina del microscopio con las abrazaderas y el vernier. Eleve
la platina del microscopio hasta la posición de enfoque.
6. Siempre iniciar las observaciones enfocando con el objetivo de 4X y ajustando con el tornillo
macrométrico girándolo hacia atrás y adelante ligeramente para enfocar el espécimen. Con
los objetivos superiores (10X, 40X, 100X) utilice únicamente el tornillo micrométrico.

De acuerdo con el tipo de muestras que se requieran observar, proceda de la siguiente manera:
1. En observaciones en fresco, el condensador debe estar en posición inferior o alejado de la
platina.
2. En las muestras con tinción, el condensador debe posición superior o cerca de la platina.
3. Una vez enfocado con el objetivo de 40X coloque una pequeña gota de aceite de inmersión
en la placa portaobjetos sin moverla y gire desde el revólver al objetivo de 100X.
4. En los dos casos anteriores tome en cuenta la apertura del diafragma (iris), de acuerdo con
el lente que utilice. A mayor aumento, mayor poder de resolución y mayor apertura por lo
tanto se debe ampliar la apertura del diafragma (iris) hasta ajustar el paso de luz.

Al finalizar la sesión de laboratorio cerciórese de cumplir las siguientes instrucciones:

1. Mueva el revolver en posición del objetivo de 4X.
2. Bajar la platina hasta el tope inferior.
3. Retire el portaobjetos de la platina.
4. Si ha usado aceite de inmersión, limpie el lente y séquelo con papel para lentes. Además,
asegúrese de que el aceite de inmersión no haya manchado el objetivo de 40X. Este lente a
menudo se contamina con aceite de inmersión por errores de operación.
 5. Para guardar el microscopio desconecte el cable de poder del tomacorriente sujetándolo de
la cabeza (no halando el cable) y envuélvalo.
6. Ubique el microscopio a su lugar correcto en el gabinete.
7. El microscopio debe estar guardado en un sitio libre de humedad y polvo.

SESIÓN 1

Cada estudiante debe realizar un frotis bacteriano y tinción GRAM por cada bacteria asignada de
acuerdo al siguiente procedimiento:

Frotis bacteriano

1. Limpiar un portaobjeto con etanol al 70%, para eliminar la suciedad y grasa.

2. Rotular el portaobjetos con la información del microorganismo.
3. Para proporcionar un objetivo sobre el cual ubicar el frotis, realizar un círculo al reverso del
portaobjetos en la parte central.
4. Colocar una gota de solución salina sobre el anverso de la placa cubreobjetos, dentro del
circulo que se marcó.
5. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en el mechero con llama azul (combustión completa),
luego tomar una colonia aislada, se recomienda tomar la más pequeños, basta un contacto
mínimo para obtener muestra en el asa.
6. Llevar la muestra contenida en el asa redonda a la gota de solución salina ubicada en el
centro del círculo al anverso de la placa portaobjetos y homogenizar la suspensión.
7. Acercar la placa al mechero para fijar la muestra sobre el portaobjetos, solo es necesario
pasar la placa ligeramente por cuatro repeticiones y observar que la placa quede totalmente
seca.

Tinción GRAM
Sobre el portaobjetos con el frotis bacteriano seco aplicar:

1. Inundar el portaobjetos con cristal violeta durante 1 minuto, aquí todas las células se tiñen de
púrpura.
2. Lavar con agua destilada.
3. Inundar el portaobjetos con solución de yodo (Lugol) por 1 minuto.
4. Lavar con agua destilada.
5. Inundar el portaobjetos con alcohol cetona (decolorante) por 10 segundos. En este paso, las
bacterias Gram positivas serán de color púrpura, mientras que las bacterias Gram negativas
serán incoloras.
6. Lavar con agua destilada
7. Inundar con safranina (colorante de contraste) por 1 minuto. La safranina tiñe con una
coloración rosada o rojiza en las bacterias Gram negativas.
8. Lavar con agua destilada
9. Dejar secar el portaobjetos
10. Observar en el microscopio con el objetivo 100X utilizando aceite de inmersión y analizar la
morfología y coloración de las diferentes bacterias.

De manera individual inocular en medio sólido en caja Petri a partir del caldo de cultivo.

a. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen. Todas las
transferencias y siembras se deben ejecutar a partir de este proceso y permanecer
cerca de la zona de esterilidad del mechero.
 b. Antes y después de abrir un tubo se debe flamear el borde o la boca rosca. Para
disminuir contaminaciones, se recomienda sujetar la tapa con el dedo meñique, no
dejarla sobre el mesón de trabajo.

c. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo previo a tomar la muestra líquida.
Tener precaución de no producir aerosoles.

d. Tomar una muestra homogénea, observar que se forme una película de líquido en la
cabeza del asa redonda.

e. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.

f. Realizar el inóculo primario sobre el borde del agar contenido en la caja Petri y
proceder con la siembra por la técnica de agotamiento.

g. Finalmente esterilizar el asa redonda, tapar la caja Petri y rotular sobre la base de la
caja.

De manera individual inocular en medios en tubo a partir de un medio sólido en caja Petri

a. Colocar la caja Petri cerca del mechero Bunsen con la tapa hacia abajo.

b. Esterilizar el asa recta al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.

c. Destapar la caja Petri y enfriar el asa recta en una zona del agar libre de crecimiento.
Tener precaución de no producir aerosoles.

d. Tomar una muestra a partir de una colonia claramente aislada y definida. Tapar la
caja en seguida.

e. Destapar el tubo donde se inoculará. Sujetar la tapa con el dedo meñique.

f. Flamear la boca del tubo de vidrio no inoculado.

g. En el tubo con medio inclinado o en bisel “slant” (TSI), insertar el asa recta hasta 3
mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente y estriar en la superficie de lado a
lado.

h. Mientras que en el tubo con medio semisólido (SIM) insertar el asa recta de manera
vertical y precisa hasta 3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente

i. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.

j. Finalmente esterilizar el asa recta, y rotular el tubo.

De manera individual inocular en medio líquido a partir del caldo de cultivo (realizar 1 de las 3
técnicas):

Inoculación con asa redonda:

a. Destapar y flamear el tubo de donde se tomará la muestra.

b. Tomar la muestra con el asa redonda previamente esterilizada, flamear y tapar

enseguida el tubo.

c. Abrir el tubo no inoculado y flamear la boca, inclinarlo y depositar suavemente el

líquido contenido en la cabeza del asa redonda contra la superficie del medio.
 d. Flamear y tapar enseguida el tubo inoculado, rotular.

Inocular con hisopo:

a. Introducir el hisopo en el medio con muestra bacteriana y agitar, llevar el hisopo al

tubo no inoculado y rotar.

b. Para desechar el hisopo en cortopunzantes previamente flamear la parte

contaminada del hisopo.

Inocular con pipeta:

a. Aspirar con la pipeta Pasteur un pequeño volumen de la muestra bacteriana

previamente homogenizada y transferir inmediatamente al tubo no inoculado,
mezclar nuevamente.

b. Desechar la pipeta en el recipiente con hipoclorito de sodio al 0.5%. Flamear y tapar

enseguida el tubo inoculado, rotular.

SESIÓN 2
A cada estudiante se le entregan 3 placas:
a. Placa con tinción Gram: en la que deben identificar la morfología y la reacción Gram de las
bacterias (preparadas en la sesión anterior).
b. Placa con tinción Ziehl Neelsen: para cada mesa de trabajo.
c. Placa con tinción Giemsa para cada mesa de trabajo (preparadas en la sesión anterior).

Se enfocan con el lente objetivo de menor aumento (4x), luego se coloca una pequeña gota de aceite
de inmersión en la placa portaobjetos y se cambia directamente a la lente de 100x. En estas
observaciones el condensador debe subirse o estar cerca de la platina. Dibuje e identifique lo que
observe.

Además, tomar la caja petri sembrada por agotamiento el día anterior y anotar las características
morfológicas de las colonias bacterianas aisladas, además realizar un dibujo de la técnica de
agotamiento.
Dibujar el crecimiento en el agar en tubo inclinado TSI, en el agar semisólido SIM y en el caldo.

1.1.9 Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de

resultados.

El estudiante debe dibujar en su cuaderno de trabajo los microorganismos observados durante la

práctica, además realizar un dibujo de las partes del microscopio.

1.1.10 Referencias cruzadas

No aplicables
1.1.11 Referencias normativas
No aplicables