Métodos Cromatograficos

Se utilizan para separar, identificar y determinar los componentes químicos de mezclas complejas.

Se hace uso de una FM y una FE. Los componentes de la mezclase hacen pasar a través de la FE
mediante la corriente de una FM (gaseosa o liquida), basándose las separaciones en las diferentes
velocidades de migración de los componentes de la muestra.

Cromatografía de líquidos en Columna o superficie plana. Cromatografía de gases o fluidos

supercrítico en columna.

Clasificación de los métodos.

Cromatografía de columna: FE esta retenida en un tubo estrecho, y la FM se hace pasar a través

del tubo por presión o gravedad.

Cromatografía plana: FE esta inmóvil sobre alguna placa plana o en los poros de un papel. La FM se
mueve a través de la FE por acción capilar o gravedad.

5 tipos de métodos de cromatografía de líquidos con distinta FE.

3 tipos de cromatografía de gases con distinta FE.

Cromatografía de Elución

Consiste en el desplazamiento de los solutos a través de la columna por la adición sucesiva de

disolvente (eluyente o FM). Puesto que el soluto solo se puede mover con la FM la velocidad a la
que migra depende de la fracción de tiempo que pasa en esta fase. Dicha fracción es pequeña para
solutos fuertemente retenidos por la FM.

Las diferencias de velocidad resultantes determinan que los componentes se separen en bandas o
zonas, a lo largo de la columna. Para aislar las especies se hace pasar una cantidad suficiente de
FM hasta que las bandas individuales salen de ella pudiendo así detectarse.

Cromatograma

Representa la concentración de sustrato que sale de la columna en función del volumen del
volumen que se ha hecho pasar o el tiempo. La posición de los picos en el eje del tiempo permite
identificar a los componentes, el área proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de cada
componente.

Tiempo de inyección: momento en que se agrega la muestra (antes de que circule FM)

Tiempo de retención tr: tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el
pico de concentración del analito alcanza el detector.

Tiempo muerto tm: tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector. Tiempo
necesario para que la fase móvil recorra la columna.

Constante de distribución: representa el equilibrio de la distribución del analito entre la FE y FM.

 cs
Amovil ↔ Aestacionaria k =
cm
Factor de retención: se utiliza para describir las velocidades de migración de los solutos en las
columnas. Es la relación de reparto.

(t r−t m )
k ' a=
tm

Si k’a menor a 1 la elución es tan rápida que es difícil determinar con exactitud los tiempos de
retención. Si k’a es de orden 20, 30 o mayor los tiempos de elución son muy largos, esto
favorecerá una buena separación pero incrementa el tiempo de elución y ancho de banda. Los
valores ideales entre 2 y 10.

Factor de selectividad: el factor para dos especies Ay B en una columna proporciona una medida
de que tan bien la columna separa dos picos.

k B ' t r deB −t m
α= =
k A ' t r de A −t m
Lo vario cambiando la composición de la FM, la Temperatura de la columna y de la Fe, usando
efectos químicos especiales.

Debido al tiempo de variabilidad en el tiempo de residencia, la velocidad promedio con la que las
partículas se mueven en relación a la fase móvil varía considerablemente, en consecuencia, es una
dispersión simétrica (de velocidades) alrededor del valor medio.

La anchura de la zona está relacionada directamente con el tiempo promedio de permanencia en

la columna e inversamente con la velocidad a la que fluye la FM.

Efecto de las velocidades de migración y del ensanchamiento de banda

La especie B es retenida fuertemente y por ello se retrasa durante la migración. El movimiento de

avance por la columna aumenta la distancia entre las bandas, sin embargo tiene lugar un
ensanchamiento de ambas zonas, lo que disminuye la eficacia de la columna.

Aunque el ensanchamiento es inevitable se pueden mejorar las condiciones para que la separación
de las bandas ocurra más lentamente. Se busca aumentar la separación de las bandas y disminuir
la anchura de las mismas.

Métodos para describir la eficacia de una columna.

Los dos términos que se utilizan como medidas cuantitativas de la eficacia de una columna
cromatograficas son:

1) Altura de plato H
2) Numero de platos N

Se relacionan por N=L/H. Longitud de la columna

La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos y menor es la altura del
plato. En base al cromatograma y a que la eficacia de la columna se refleja en la anchura de los
picos, se utiliza como medida de eficacia a la varianza por unidad de longitud.

σ2
H=
L
La altura del plato puede considerarse como la longitud de la columna que contiene una fracción
de analito que queda entre L y L-σ .
2
tr
N=16 ( )
w
Variables cinéticas que influyen en el ensanchamiento de las bandas

Difusión longitudinal: migración del soluto desde el centro concentrado de la banda a las regiones
más diluidas. Causa por la que se ensanchan las banas y como consecuencia directa disminuye H.

Coeficientes de transferencia de masa C s y C m: Cuanto más rápida se mueva la FM menos tiempo

habrá para que se aproxime al equilibrio. El efecto de la transferencia de masa en la altura del
plato es proporcional a la velocidad u de la FM.

El ensanchamiento se minimiza disminuyendo el diámetro de las partículas de empaquetado y el

diámetro de la columna.

Resolución

El poder de resolución constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos
analitos que depende de la separación de los picos y la definición de las bandas.

∆ tr 2∗∆ z
R S= =
w pr w A −W B
w pr=ancho promedio de ambos picos.

La resolución para una FE dada se puede mejorar alargando la columna, incrementando así el
número de platos. Si aumenta el número de platos, alargamos el tiempo de retención y
disminuimos la altura de los platos. Otras formas más eficaces de aumentar la resolución son:

1) Disminuir la velocidad de flujo (será eficaz cuando el transporte de masa sea el que
determina la altura del plato)
2) Empleando una FE constituida por partículas de menor tamaño, ya que estas oponen
mayor resistencia.
3) Aumentar la temperatura, esto disminuye la viscosidad de los líquidos y los fenómenos de
difusión ocurren más rápidamente.
4) Un aumento de k’b aumenta la resolución pero a expensas del tiempo de elución. Valor
ideal entre 1 y 5.
Aplicaciones

Análisis cualitativo: se usa para reconocer la presencia o ausencia de un componente en una

mezcla (ausencia de un pico que corresponde a una sustancia-> la sustancia no está)

Análisis cuantitativo: basado en el área de los picos que es independiente de los efectos de
ensanchamiento y en la altura de los picos pero aquí solo si las variaciones de las condiciones de la
columna y de los patrones no alteran la anchura de los picos.

Cromatografía Gas-Liquido

Fase móvil: gas inerte que no interacciona con las moléculas de analita, su única función es
transportar el analito a través de la columna.

Fase estacionaria: líquido inmovilizado sobre la superficie de un sólido inerte.

Principios de Cromatografía Gas-Liquido

Se usan los mismo principios solo que debería tenerse en cuenta que la velocidad de difusión es
104 veces mayor que la de los liquidos.
Instrumentos usados en cromatografía Gas-Liquido

Gas portador: se usa helio, nitrógeno e hidrogeno gaseoso. Con el suministro de gas se encuentran
asociados reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. Suele contener un tamiz
molecular para filtrar agua e impurezas.

Sistema de inyección de la muestra: las muestras deben ser de tamaño adecuado e introducirse
como un tapón de vapor, la inyección lenta provoca ensanchamiento de los picos. Se utiliza una
micro jeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma en una cámara
de vaporización instantánea. Las muestras solidas se introducen como disoluciones.

Configuración de la columna y horno: las columnas cromatograficas van de 2 hasta 50, o más
metros de largo. Están construidas de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Al fin de
colocarse en un horno termostatizado. La temperatura debe controlarse (decimas de grado). La
temperatura óptima depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación
esperado. Con una temperatura igual o ligeramente superior al pto de ebullición promedio de la
mezcla se obtienen tiempos de elución razonables. Para muestras con un amplio rango de
ebullición conviene emplear una programación de temperatura.

Detectores: deben responder rápidamente a pequeñas concentraciones de soluto a medida que

salen de la columna (breves periodos de tiempo). Un detector ideal debe tener una adecuada
sensibilidad, estabilidad y reproducibilidad, respuesta lineal, intervalo de temperaturas desde la
temperatura ambiente hasta 400 grados centígrados, fiabilidad y manejo sencillo, no destructivo
para la muestra y respuesta semejante para todos los solutos o una respuesta selectiva predecible.

Fases estacionarias

Baja volatilidad (punto de ebullición 100 grados superiores a la temperatura máxima de trabajo)

Estabilidad térmica
Inercia química

Características de disolvente tales que los valores de k’ y α de los solutos a resolver estén dentro
de un intervalo conveniente.

Para que una especie permanezca en la columna un tiempo razonable debe mostrar un cierto
grado de compatibilidad (solubilidad) con la FE.

FE polares: poliéster contiene grupos –CN, -CO y –OH.

FE no polares: hidrocarburos y dialquilsiloxanos.

Solutos polares: alcohol, ácidos, aminas. Solutos de polaridad media: éteres, cetona y aldehídos.
Solutos no polares: hidrocarburos saturados.

La polaridad de la FE debe adaptarse a la del componente de la muestra.

Aplicaciones

Técnica de Separación: para sistemas complejos orgánicos, organometalicos y bioquímicos.

Técnica de análisis: se usan tiempos o volúmenes de retención para identificación cualitativa (muy
limitada más que la mayoría de los métodos espectroscópicos) y la altura o área de los picos para
determinación cuantitativa. Por esto se suelen combinar estas cualidades de fraccionamiento con
las mejores propiedades de identificación de otros instrumentos como escptometros de más, IR y
RMN.

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)

Se trabaja con presiones de varios centenares de atm para conseguir caudales razonables con los
empaquetados Cromatograficos (FE solida) que constan de partículas de diámetro igual o inferior a
10 μm. Como consecuencia de estas presiones el equipo es sofisticado y caro.

Depósitos de FM y sistema de tratamiento de disolventes.

Un aparato de HPLC posee uno o más recipiente de vidrio u acero inoxidable, cada uno con 200 a
1000 ml de disolvente. Poseen un sistema para eliminar gases disueltos .Estas burbujas provocan
ensanchamientos de bandas e interfieren con el detector (puede ser un sistema de bomba de
vacío, un sistema de destilación, etc.). También contienen un dispositivo para la filtración de polvo
y partículas solidas en suspensión.

Una separación que usa un solo disolvente de composición constante se denomina elución
isocratica. La eficacia de separación se aumenta por una elución con gradiente. En este caso se
utilizan 2 o 3 sistemas de disolventes con distinta polaridad. Una vez comenzada la elución se varía
la relación de los disolventes. A menudo están equipados con válvulas de mezcla que introducen
líquidos de 2 o más recipientes a velocidades variables de forma continúan.

Sistemas de Bombeo.

Posibilidad de presiones hasta 480 atm

Salida libre de pulsaciones

Caudales entre 0,1 y 10 ml/min

Reproducibilidad de caudales mejor de 0,5%

Se usan dos tipos de bombas mecánicas: 1) tipo jeringa impulsada por un tornillo presenta flujo
libre de pulsaciones, se mide fácil el caudal pero tiene baja capacidad y no es adecuada cuando
hay que cambiar de disolvente. 2) bomba aspirante: volumen interno pequeño, presión de salida
alta (mayo a 800 atm) fácil adaptabilidad a elución con gradiente. Son en gran medida
independiente de la contrapresión de la columna y viscosidad del disolvente.

Sistema de inyección de muestra.

El método más antiguo implicaba la inyección de la muestra con una jeringa a través de un
diafragma, no es muy reproducible y se usa presiones inferiores a 120 atm. El más usado es
mediante dispositivos con un bucle de muestreo. Pueden ser intercambiados permitiendo elegir el
tamaño de la muestra.

Detectores

Debe tener las características antes mencionadas pero no se le pide que sea tan sensible a un
intervalo tan grande te temperatura como en cromatografía Gas-Liquido.

Tipos de detectores

Se basan en una propiedad de la disolución, responden a una propiedad el efluente, tal como el
índice de refracción, constante dieléctrica, etc.

Se basan en una medida de la propiedad del soluto como absorbancia en el UV, fluorescencia.

 Detector UV
 Detector de índice de refracción
 Detector electroquímico
 Detector de fluorescencia
 Detector por espectrometría de masas.

Cromatografía de Reparto

Se separa en cromatografía liquido-líquido y cromatografía de fase unida químicamente. La

diferencia radica en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas soporte del
relleno. En L-L la FE liquida se retiene sobre la superficie del soporte por adsorción física. En la
segunda la FE se une por enlaces covalentes a la superficie del soporte. Desventajas: perdida de FE
por disolución necesario recubrimiento periódico de las partículas de soporte. El problema de la
solubilidad de la FE impide el uso de los rellenos en fase liquida en la elución con gradiente

Selección de la FE y FM: se ajusta la polaridad del analito con la FE y usamos la FM con una
polaridad considerablemente distinta.

Cromatografía de Adsorción de alta resolución

Se usa una fase estacionaria sólida y una fase móvil liquida o gaseosa. El soluto puede adsorberse
en la superficie de las partículas sólidas. El equilibrio entre el estado adsorbido y la solución es la
causa de separación de las moléculas de soluto. FE: Sílice y Alúmina son muy polares y las
eluciones se realizan con algunas de las FM menos polares. Son útiles para muestras que son
solubles en disolventes no polares y por lo tanto tienen solubilidad limitada en disolventes
acuosos. Se usa en la separación de isómeros. Tiende a complementarse con la cromatografía de
reparto. Es la más adecuada para compuestos no polares de PM<5000.

Cromatografía iónica Los iones y cationes se unen covalentemente a la FE sólida, una resina. Los
iones del soluto, de carga opuesta a los de la FE, son atraídos por esta última mediante una fuerza
electroestática. La FM es líquida.

La resina de intercambio sintético se utiliza para disminuir la dureza del agua, la desionizacion del
agua y para purificación de disoluciones. Para resinas de intercambio catiónico, los sitios activos
son los grupos de ácidos sulfúricos, los intercambiadores anicónicos tiene grupos aminos terciarios
o primarios.

La FM son disoluciones acuosas que pueden contener cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente miscibles con el agua.

Se aplica a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus
metabolismos, conservantes de alimento, etc.

Cromatografía de exclusión molecular o por tamaño

No existen interacciones por atracción entre la FE y el soluto. La FM liquida o gaseosa pasa a través
del gel poroso y se genera una separación molecular por tamaño. Los solutos más grandes pasan
rápidamente, en cambio las más pequeñas entran en el gel y requieren más tiempo para
atravesarlo. Los rellenos están constituidos por partículas poliméricas o de sílice que contienen
una red de poros uniforme en los que pueden difundir las moléculas del soluto y del solvente.

Se dividen en cromatografía de filtración sobre gel y penetrabilidad sobre gel. El primer tipo utiliza
disolventes acuosos y rellenos hidrófilos; el ultimo emplea disolvente orgánicos no polares y
rellenos hidrofóbicos. Se aplica muestras hidrosolubles y sustancias solubles en disolventes
orgánicos menos polares. Las ventajas son el tiempo de separación cortos y definidos, bandas
estrechas y no hay perdidas de muestra por que los solutos no interaccionan con la FE.

Las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de los poros son excluidas y de esta
forma esencialmente no se retienen, son las primeras en eluir.

Cromatografía Plana

Cromatografía en capa fina

La FE no se dispone en forma de columna si no está constituida por una capa de absorbente

finamente dividida extendida sobre una placa de vidrio o plástico.

El sustrato a analizar se coloca cerca de la superficie absorbente en forma de una pequeña mancha
circular. Luego se sumerge este borde de la placa en el disolvente que constituye la FM. El
disolvente asciende por la placa por capilaridad y arrastra consigo el sustrato.
Antes de que alcance el extremo superior de la placa se detiene el flujo del disolvente retirando la
placa y se marca con un lápiz la posición alcanzada por el frente del disolvente.

El sustrato no se ha desplazado a la misma velocidad que el disolvente si no que ha quedado

retrasado.

Detección: se busca determinar la posición de la mancha del sustrato. Si este es coloreado se

puede ver a simple vista. Si las sustancias con invisibles a la luz ordinaria existen dos métodos para
localizar los componentes. Por nebulización de la placa: una vez seca la mancha, se nebuliza la
placa con un reactivo que forma productos coloreados con las sustancias presentes en las
manchas como por ejemplo una disolución de yodo o ácido sulfúrico que identifica azucares.

Aplicaciones: ventaja es la rapidez y el bajo costo de los ensayos. Presenta aplicaciones en la

industria farmacéutica (controles de pureza), laboratorios clínicos e industriales. Los datos de un
solo cromatograma no son suficientes para poder identificar las distintas especies presentes en la
mezcla debido a la variabilidad de los valores del factor de retención con el tamaño de la muestra,
la placa de capa fina y las condiciones existentes de desarrollo. Siempre existe la posibilidad de
que dos solutos bastante diferentes tengan valores de factor de retención casi idénticos.