Fermin Amor Parrilla

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos
Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber)

(Hemiptera: Anthocoridae) y
Nesidiocoris tenuis (Reuter)
(Hemiptera: Miridae), depredadores
importantes en cultivos hortícolas protegidos,
con nuevas barreras físicas selectivas
y modernos plaguicidas
TESIS DOCTORAL
Fermín Amor Parrilla

Ingeniero Agrónomo
2013
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos
Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber)

(Hemiptera: Anthocoridae) y
Nesidiocoris tenuis (Reuter)
(Hemiptera: Miridae), depredadores
importantes en cultivos hortícolas protegidos,
con nuevas barreras físicas selectivas
y modernos plaguicidas
TESIS DOCTORAL
Fermín Amor Parrilla

Ingeniero Agrónomo
Directores: Elisa Viñuela Sandoval

Catedrática y Dra. Ingeniera Agrónoma
(Universidad Politécnica de Madrid)
Guy Smagghe
Professor Dr. ir. (Ghent University), Belgium
Madrid, 2013
Tribunal nombrado por el Magfco. Y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica
de Madrid, el día de de 2013.
Presidente D./Da
Vocal D./D.a
Vocal D./D.a
Vocal D./D.a
Secretario D./D.a
Suplente D./D.a
Suplente D./D.a
Realizada la lectura y defensa de la tesis el día de de 2013 en Madrid,

en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos.
Calificación:
El Presidente Los Vocales
El Secretario
“Sine agricultura nihil”
A mis padres,
y a Sara
AGRADECIMIENTOS.
Esta Tesis Doctoral se ha llevado acabo en la Unidades de Protección de Cultivos de la

E.T.S.I. Agrónomos de Madrid (España) y de la Facultad de Bioingeniería de Gante
(Bélgica), como parte de los proyectos del Plan Nacional de I+D+I AGL2007-66399-
C03-01 y AGL2010-22196-C02-02, y gracias a una beca FPI (BES-2009-014631)
otorgada por el Ministerio de Economía y Competitividad (antiguo Ministerio de
Ciencia e Innovación).
Es bonito poder dar las gracias a todas las personas que de un modo u otro, me han
ayudado a que esta tesis sea posible, incluso cuando yo ni siquiera sabía que la iba a
escribir allá por 2006. A todos ellos, a los que nombro y a los que no, mi más sincera
gratitud.
A mis padres Miguel y Remedios, porque todo lo que he conseguido ha sido gracias a
ellos, por su apoyo e inculcarme su capacidad de sacrificio, trabajo y valores.
A Sara, por estar siempre a mi lado, y hacer que cada día cuando llego a casa me sienta
el hombre más feliz del mundo.
A Elisa, mi tutora, por darme la oportunidad de trabajar en investigación, transmitirme

toda su experiencia, confiar en mi trabajo, y su apoyo personal.
To Guy, my promoter in Belgium, because he invited me to be part of his work team

two times, and also for his personal motivation and patience.
A Flor, porque fue la primera persona que confió en mi trabajo, y me contagió el interés
por la entomología, por su vitalidad y alegría.
A Pilar, porque siempre ha estado ahí cuando la he necesitado, y sus consejos me han
ayudado a no perder el rumbo.
A Ángeles, por su apoyo e interés ante los problemas diarios, y las continuas
“discusiones” de metodología.
A Pedro, por contagiar su entrega al trabajo, no hay día en el que no te enseñe algo, su
constancia y humor.
A Yara, Nacho y Luis, que siempre me habéis ayudado en mi trabajo diario, Torre de
Potter, semillado de plantas, construcción de jaulas, muestreos en “La Poveda”,
“diseño” de bichos para las presentaciones, limpieza de material… pero me quedo con
vuestra amistad.
A Antonio López, por confiar en mi trabajo y su apoyo personal.
A Ignacio Colomer, por enseñarme los entresijos de la horticultura Almeriense.
A mis compañeros de laboratorio, Gladis, Gloria, Javi, Cherre, Edu, Pedro, Rabeh,
Dani, Sotero, Geraldo, Jader, Sara, Guille, Edu, Juan, Raquel, Valentín, Essen, Gabriela,
Rosa Mari, Antonio, Celeste… y en especial a los que más me han sufrido… Paloma,
mi inseparable compañera y sobretodo mi amiga, sin ella el día a día hubiese sido más
complicado, y seguro más aburrido. A Agustín, el amigo con el que me reencontré en el
laboratorio, gracias por esas risas sin control, “trazos”, y estar ahí en todo momento. A
Rosa, por estar siempre dispuesta a ayudarme y su amistad. A Mar, por compartir esas
grandes anécdotas en viajes y apoyo. A Andrea “la ninfa”, porque a pesar de que me da
mucha guerra… lo que nos reímos… y aprendo de ella. A Luis Hiernaux, por poner la
nota forestal en este grupo, eres uno más amigo.
Al “equipo Gante”, Paloma, Marta y Olivier, por ser mi familia en Bélgica, todo fue
posible gracias a vosotros. (To the “Ghent team”, Paloma, Marta and Olivier, because
they were my family in Belgium, everything was possible because of you guys).
To Olivier, thanks for all the trips, Belgian beers and your friendship.
To mates in Agrozoology lab in Ghent, Patrick, Luc, Rik, Didier, Leen, Bjorn, Ivan,
Hanneke, Ruben, Jisheng, Moises, Maarten, Sara, Jochem, Astrid, Silvia, Thijs, Na,
Dorien, Peter… Dankjewel!!!.
Al “club del café”, aquí seguro que me dejo a alguien, Paloma, Agustín, Rosa, Pilar,
Yara, Nacho, Luis, ocasionalmente Flor, Mar, Celeste… porque todos los días es bueno
empezar la mañana riéndose, haciendo quinielas y llegando al laboratorio un poco más
tarde de lo previsto… qué tertulianos se ha perdido el mundo.
A todo el personal de la universidad, escuela y del departamento que siempre me ha

ayudado cuando lo he necesitado, Carolina Palomo, Silvia Muñoz, Carmen González,
Carmen Dieguez, Román Zurita, Anabel Torres, Esther Plaza, Julio Sebastián, Pedro
Aguado, Juan Pablo del Monte, Mª Dolores Curt… y especialmente al servicio de envío
de bibliografía de la biblioteca de la E.T.S.I. Agrónomos, que sin su ayuda no hubiese
podido escribir un solo párrafo de esta tesis.
Al personal de la finca experimental “La Poveda” (Pedro, Tasio, Paulino…) y del CSIC
(Alberto Fereres, Arantxa Moreno, Beatriz Dader…) por su ayuda en los ensayos de
campo.
A Carmen Calleja por resolver mis dudas moleculares.
A Beatriz Díaz por sus enseñanzas de Sadie y Surfer.
A todos mis amigos por los buenos momentos que me dan… a los birratoureros (Edu,
Fer, Mario, Fede, Carlos, José David, Javi, David, Miguel), a los getafenses (David,
Alfredo, Esther…) a la manada, (Tere, Álvaro, Noe, Paty, Luis, Carlos, Willy…), a los
sin fronteras (José Luis, Sergio…).
Índice
ÍNDICE. i
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS. vii
RESUMEN. ix
SUMMARY. xii
1. INTRODUCCIÓN GENERAL. 1
1.1. La agricultura sostenible y el control de plagas. 1
1.2. Gestión Integrada de plagas (GIP) en cultivos
hortícolas protegidos. 3
1.3. Enemigos naturales. 8
1.3.1. Orius laevigatus. 8
1.3.1.1. Sistemática. 8
1.3.1.2. Distribución geográfica y hábitat. 9
1.3.1.3. Descripción y biología del insecto. 10
1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos
1.3.2. Nesidiocoris tenuis. 16
1.3.2.1. Sistemática. 16
1.3.2.2. Distribución geográfica y hábitat. 16
1.3.2.3. Descripción y biología del insecto. 17
1.3.2.4. Importancia en la GIP de cultivos
2. OBJETIVOS. 24
i
Índice
3. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES. 25
3.1. Lugar de estudio y condiciones ambientales. 25
3.1.1. Laboratorio. 25
3.1.2. Invernadero. 26
3.1.3. Campo (túneles semi-comerciales). 27
3.2. Material biológico y su manejo. 28
3.2.1. Cría de Orius laevigatus. 28
3.2.2. Cría de Nesidiocoris tenuis. 28
3.2.3. Material vegetal. 31
3.3. Análisis estadístico. 33
4. COMPATIBILIDAD DE LOS ENEMIGOS NATURALES
ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS CON EL
USO DE MALLAS TRATADAS CON BIFENTRIN COMO
MÉTODO FÍSICO DE CONTROL. 35
4.1. Introducción. 35
4.2. Materiales y métodos. 37
4.2.1. Características y manejo de la malla tratada
con bifentrin y malla control. 37
4.2.2.1. Evaluación de la preferencia entre
malla control y tratada con bifentrin. 39
ii
Índice
4.2.2.2. Evaluación de la toxicidad de la
malla tratada con bifentrin por contacto. 42
4.2.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada
con bifentrin en invernadero. 43
con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 45
4.3. Resultados y discusión. 56
4.3.1.1. Evaluación de la preferencia entre
malla control y tratada con bifentrin. 56
4.3.1.2. Evaluación de la toxicidad de la malla
tratada con bifentrin por contacto. 58
con bifentrin en invernadero. 59
con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 63
4.3.3.1. Otoño 2011. 63
4.3.3.2. Primavera-verano 2012. 69
4.3.3.3. Otoño 2012. 75
iii
Índice
5. TOXICIDAD DE MODERNOS INSECTICIDAS SOBRE
LOS ENEMIGOS NATURALES ORIUS LAEVIGATUS Y
NESIDIOCORIS TENUIS. 81
5.1. Introducción. 81
5.1.1. Insecticidas evaluados. 84
5.1.1.1. Abamectina. 84
5.1.1.2. Deltametrina. 85
5.1.1.3. Emamectina. 86
5.1.1.4. Flubendiamida. 87
5.1.1.5. Spinosad. 88
5.1.1.6. Spiromesifen. 89
5.2. Materiales y métodos. 90
5.2.1. Insecticidas evaluados. 90
5.2.2. Clasificación de los insecticidas. 91
5.2.3. Resumen de los ensayos realizados con insecticidas. 92
5.2.4. Contacto residual sobre placas de cristal
en laboratorio. 92
5.2.5. Persistencia. 98
5.3. Resultados. 100
en laboratorio. 100
5.3.1.1. Orius laevigatus. 100
5.3.1.2. Nesidiocoris tenuis. 107
iv
Índice
5.3.2.1. Orius laevigatus. 114
5.3.2.2. Nesidiocoris tenuis. 119
5.4. Discusión. 124
en laboratorio. 124
6. ECDYSONE AGONISTS: ECOTOXICOLOGY ON
ORIUS LAEVIGATUS. INSECT TOXICITY BIOASSAYS
AND MOLECULAR DOCKING APPROACHES. 132
6.1. Introduction. 132
6.1.1. The ecdysone receptor. 132
6.2. Objectives. 134
6.3. Material and methods. 135
6.3.1. Chemicals. 135
6.3.2. Insects bioassays. 137
6.3.3. EcR-LBD sequence. 137
6.3.4. Confirmation of expression of EcR in nymphs
of Orius laevigatus. 141
6.3.5. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies. 141
6.4. Results. 142
6.4.1. Efficacy and toxicological effects of
methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849. 142
6.4.2. OlEcR-LBD sequence, phylogenetic tree
v
Índice
and expression in nymphs. 144
6.4.3. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies. 149
6.5. Discussion. 152
7. CONCLUSIONS. 155
8. BIBLIOGRAFÍA. 157
APÉNDICE. 179
Índice de figuras. 179
Índice de tablas. 185
vi
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS.
-3D. Three dimensional.

-16L: 8O. Fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad.
-20E. 20-hydroxyecdysone.
-a.i. Active ingredient.
-ANOVA. Análisis de varianza.
-BOE. Boletín Oficial del Estado.
-CABYV. Cucurbit aphid-borne yellows virus.
-CINEMA. Colour Interactive Editor for Multiple Alignments.
-CEE. Comunidad Económica Europea.
-CMV. Cucumber mosaic virus.
-CSIC. Centro Superior de Investigaciones Científicas.
-DAH. Diacylhydrazine.
-DBD. DNA-binding domain.
-DDT. Días después del tratamiento.
-DNA. Deoxyribonucleic acid.
-EC. Concentrado emulsionable.
-EEC. European Economic Community.
-EcR. Ecdysone receptor.
-EcR-LBD. Ecdysone receptor ligand-binding domain.
-E.T.S.I.A. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos.
-F. F de Fisher.
-GABA. Ácido gamma-aminobutírico.
-GIP. Gestión Integrada de Plagas.
-g.l. Grados de libertad.
-HR. Humedad Relativa.
-HRE. Hormone response elements.
-i.a. Ingrediente activo.
-IIC, Intelligent Insect Control.
-IPM. Integrated Pest Management.
-IRAC. Insecticide Resistance Action Committee.
-K. K de Krushall-Wallis.
vii
-LAA. Laboratorio Arbitral Agroalimentario.
-LBD. Ligand-binding domain.
-LBP. Ligand-binding pocket.
-LLINs. Long lasting insecticidal nets.
-LSD. Least significant difference (Mínimas diferencias significativas).
-MAGRAMA. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente.
-MFRC. Maximum field recommended concentrations.
-MACs. Molting-accelerating compounds.
-NtEcR-LBD. LBD of the EcR of N. tenuis.
-OILB. Organización Internacional para la Lucha Biológica e Integrada.
-OJEU. Oficial Journal of the European Union.
-OlEcR-LBD. LBD of the EcR of O. laevigatus.
-OMS. Organización Mundial de la Salud.
-P. Valor p de probabilidad.
-PAR. Radiación fotosintéticamente activa.
-PCR. Polimerase Chain Reaction.
-PI. Producción Integrada.
-PIEC. Predicted Inicial Environmental Concentration.
-P1A. Ponasterone A.
-RACE. Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR.
-RNA. Ribonucleic acid.
-RXR-USP. Retinoid X receptor- Ultraspiracle.
-SC. Suspensión concentrada.
-SG. Gránulos solubles en agua.
-sp. Especie.
-spp. Especies.
-t. t de Student.
-TSWV. Tomato spotted wilt virus.
-UE. Unión Europea.
-USP. Ultraspiracle.
-UV. Ultravioleta.
-W. W de Wilcoxon.
-WG. Granulado dispersable en agua.
-WHO. World Health Organisation.
viii
RESUMEN.
La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de

Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y
sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico, el
físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos es a
veces necesario para el adecuado manejo de plagas en cultivos hortícolas. Por ello, el
objetivo general de este estudio es aportar conocimientos para mejorar el control de
plagas en cultivos hortícolas, mediante la integración de tres estrategias de lucha:
biológica, física y química.
Una parte de este trabajo ha consistido en el estudio de los posibles efectos que mallas
tratadas con insecticida (bifentrin) pudieran provocar mediante diferentes ensayos de
laboratorio, invernadero y campo, en los enemigos naturales Orius laevigatus (Fieber)
(Hemiptera: Anthocoridae) (depredador de trips), Nesidiocoris tenuis (Reuter)
(Hemiptera: Miridae) (depredador de mosca blanca y Tuta absoluta (Meirick)
(Lepidoptera: Gelechiidae)), y otros agentes de biocontrol comúnmente usados en
cultivos hortícolas protegidos. Este tipo de mallas se han empleado con éxito en
entomología médica para controlar mosquitos vectores de la malaria, y actualmente se
está trabajando en su desarrollo para uso agrícola como método de exclusión, y método
directo de control de plagas.
En los ensayos realizados en laboratorio, O. laevigatus y N. tenuis no fueron capaces de

detectar la presencia de bifentrin en el ensayo de preferencia. Además, no se produjo
mortalidad a corto plazo (72 horas) en ambos chinches depredadores. Por el contrario,
se registró una elevada mortalidad cuando se expusieron por contacto a la malla tratada
durante 72 horas en cajas de dimensiones reducidas (10 cm de diámetro X 3 cm de
altura). En ensayos llevados a cabo bajo condiciones más reales de exposición, en un
invernadero experimental con jaulas de 25 X 25 X 60 cm de altura, no se produjo
ningún efecto en la mortalidad a corto plazo (72 horas) o en los parámetros
reproductivos de O. laevigatus y N. tenuis. Finalmente, en ensayos de campo realizados
en túneles semi-comerciales (8 m de largo X 6,5 m de ancho X 2,6 m de altura), ni las
condiciones ambientales [temperatura, humedad relativa, radiación ultravioleta (UV) y
ix
fotosintéticamente activa (PAR)], ni los enemigos naturales, se vieron afectados por la
presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo. Sin embargo, los resultados no
fueron concluyentes, debido al bajo establecimiento de los agentes de biocontrol
liberados. Por lo tanto, más estudios son necesarios en invernaderos comerciales para
confirmar los resultados preliminares de compatibilidad.
Además, en este trabajo se han evaluado los efectos letales (mortalidad) y subletales
(parámetros reproductivos) de seis modernos insecticidas sobre los chinches
depredadores O. laevigatus y N. tenuis, mediante ensayos de laboratorio y persistencia.
Los ensayos se realizaron por contacto residual, aplicando los insecticidas a la dosis
máxima de campo sobre placas de cristal (laboratorio) o plantas (persistencia). Los
productos fitosanitarios se seleccionaron por representar a un grupo de modernos
plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos para los enemigos
naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados, oroganofosforados o
carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde O. laevigatus y N.
tenuis están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso de inclusión en la lista
comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, Anexo I de la Directiva
91/414/CEE: abamectina y emamectina (avermectinas neurotóxicas, activadoras del
canal del cloro), deltametrina (piretroide neurotóxico, modulador del canal del sodio,
control positivo), flubendiamida (neurotóxico, modulador del receptor de rianodina),
spinosad (naturalito neurotóxico, agonistas/antagonistas del receptor de nicotínico
acetilcolina) y spiromesifen (inhibidor de la acetil CoA carboxilasa).
El estudio mostró que O. laevigatus fue más susceptible a los insecticidas que N. tenuis.
Además, los resultados revelaron que flubendiamida y spiromesifen fueron compatibles
con los dos enemigos naturales estudiados, y por tanto se podrían usar en programas de
GIP. Por el contrario, los insecticidas abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad
no fueron selectivos para ninguno de los chinches depredadores. Sin embargo, los
estudios de persistencia demostraron que a pesar de que estos insecticidas no
proporcionaron selectividad fisiológica, pueden proporcionar selectividad ecológica en
algunos casos. Abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían ser
compatibles con N. tenuis si el enemigo natural es introducido en el cultivo 4 días
después de su aplicación. En el caso de O. laevigatus, abamectina, deltametrina y
spinosad se clasificaron como persistentes, por lo tanto es necesario completar el
x
estudio con experimentos de semi-campo y campo que determinen si es posible su uso
conjunto en programas de GIP. Por otro lado, emamectina podría ser compatible con O.
laevigatus si el enemigo natural es introducido en el cultivo 7 días después de su
aplicación.
Por último, se ha comprobado la selectividad de tres insecticidas aceleradores de la

muda (MACs) (metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849) sobre O. laevigatus y N.
tenuis. Además de realizar estudios para evaluar la toxicidad en laboratorio de los
insecticidas por contacto residual e ingestión (principal modo de acción de los MAC´s),
se extrajo RNA de los insectos y con el cDNA obtenido se secuenció y clonó el dominio
de unión al ligando (LBD) del receptor de ecdisona correspondiente a O. laevigatus
(OlEcR-LBD) y N. tenuis (NtEcR-LBD). Posteriormente, se obtuvo la configuración en
tres dimensiones del LBD y se estudió el acoplamiento de las moléculas de los tres
insecticidas en la cavidad que forman las 12 α-hélices que constituyen el EcR-LBD. En
el caso de N. tenuis se debe mencionar que no fue posible la obtención de la secuencia
completa del LBD. Sin embargo, se obtuvo una secuencia parcial (hélice 6-hélice 11),
que mostró una alta conservación de aminoácidos con respecto a la obtenida en O.
laevigatus. Los ensayos de toxicidad mostraron que metoxifenocida, tebufenocida y
RH-5849 no produjeron ningún efecto nocivo en ambos depredadores. Además, los
estudios de modelado por homología y acoplamiento molecular llevados a cabo con O.
laevigatus, también indicaron que los MACs no produjeron ningún efecto deletéreo en
este enemigo natural. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser aplicados de manera
segura en programas de GIP en los cuales O. laevigatus y N. tenuis estén presentes.
xi
SUMMARY.
The new pesticide legislation on pest control is aimed at integrated pest management
(IPM). These programs are based on the most environmentally sustainable approaches,
where biological, physical control and other non-chemical methods are the cornerstone.
However, selective pesticides are often required for pest management on horticultural
crops. Therefore, the main goal of this study is to provide knowledge to improve pest
control on horticultural crops through the integration of three strategies: biological,
physical and chemical.
Firstly, the effects of insecticide treated nets (bifenthrin) were evaluated in different
laboratory, greenhouse and field experiments on the natural enemies Orius laevigatus
(Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (predator of thrips), Nesidiocoris tenuis (Reuter)
(Hemiptera: Miridae) (predator of whiteflies and Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera:
Gelechiidae)), and other biocontrol agents commonly used on protected horticultural
crops. These types of nets have been successfully used in medical entomology to
control mosquito malaria vectors, and work is currently being done on their use as
exclusion barriers and as a direct method of pest control in agriculture.
In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not
able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no short-
term mortality (72 hours) was recorded on both predatory bugs. In contrast, a high
mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated
net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out
under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages
of 25 X 25 X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive parameters
were not affected. Lastly, in field experiments carried out in semi-commercial tunnels (8
m long X 6.5 m width X 2.6 m high), neither environmental conditions [temperature,
relative humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] nor
natural enemies were affected by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop.
However, results were not conclusive, mainly due to a low settlement of the released
biocontrol agents, and further studies are needed in commercial greenhouses to confirm
our preliminary results of compatibility.
xii
Secondly, the lethal (mortality) and sublethal effects (reproductive parameters) of
six modern pesticides on the predatory bugs O. laevigatus and N. tenuis has been
evaluated through laboratory and persistence experiments. Trials were carried out by
residual contact, applying the insecticides to the maximum field recommended
concentration on glass plates (laboratory) or plants (persistence). Insecticides were
chosen as representatives of modern pesticides with a more selective mode of action on
natural enemies than organochlorine, organophosphorus and carbamate insecticides.
Moreover, they were also chosen because of their frequent use on horticultural crops
where O. laevigatus and N. tenuis are present. All of them have been included or have
been requested for inclusion in the community list of active substances on the
agricultural market, Annex I of the European Directive 91/414/EEC: abamectin and
emamectin (neurotoxic avermectins, chloride channel activators), deltamethrin
(neutotoxic pyrethroid, sodium channel modulator, positive commercial standard),
flubendiamide (neurotoxic, rianodine receptor modulator), spinosad (neurotoxic
naturalyte, nicotinic acetylcholine receptor allosteric activator) and spiromesifen
(inhibitors of acetyl CoA carboxylase).
The study showed that O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides
than N. tenuis. In addition, the research results indicated no impact of flubendiamide
and spiromesifen on the two natural enemies studied under laboratory conditions.
Consequently, both pesticides are candidates to be included in IPM programmes where
these biocontrol agents are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin,
emamectin and spinosad were not selective for both predatory bugs in laboratory
experiments. However, persistence test demonstrated that in spite of the lack of
physiological selectivity, these pesticides can provide ecological selectivity in some
cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad could be compatible with N.
tenuis if the mirid bug is released 4 days after the insecticide treatment on the crop.
With regard to O. laevigatus, abamectin, deltamethrin and spinosad were classified as
persistent in our assays, thus the study should be completed with semi-field and field
experiments in order to ascertain their possible joint use in IPM programs. In contrast,
emamectin could be compatible with O. laevigatus if the pirate bug is released 7 days
after the insecticide treatment on the crop.
xiii
Finally, the selectivity of three moulting accelerating compounds (MACs)
(methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849) has also been evaluated on O. laevigatus
and N. tenuis. In addition to laboratory experiments to evaluate the toxicity of the
insecticides by residual contact and ingestion, molecular approaches were used as well.
RNA of both insects was isolated, cDNA was subsequently synthesized and the
complete sequence of the ligand binding domain (LBD) of the ecdysone receptor of O.
laevigatus (OlEcR-LBD) and N. tenuis (NtEcR-LBD) were determined. Afterwards, the
three dimensional structure of LBD was constructed. Finally, the docking of the
insecticide molecules in the cavity delineated by the 12 α-helix that composed the EcR-
LBD was performed. In the case of N. tenuis, it should be noted that in spite of intensive
efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD.However, a partial
sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and a strong conservation
between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. Results showed
no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849, on both
predatory bugs. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking experiments also
suggested that MACs were devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. Therefore,
our results indicate that these compounds could be safely applied in IPM programs in
which O. laevigatus and N. tenuis are present.
xiv
Capítulo 1
Capítulo 1. Introducción general
1. INTRODUCCIÓN GENERAL.
1.1. La agricultura sostenible y el control de plagas.
En los últimos 50 años la población mundial ha visto duplicado su número, sin

embargo, la superficie destinada a cultivos agrícolas únicamente ha aumentado en un 10
%, por lo que el desarrollo de los productos fitosanitarios de síntesis ha sido clave para
intensificar y asegurar las producciones agrícolas. No obstante, durante la segunda
mitad del siglo pasado la facilidad con la que se podían adquirir y utilizar, favoreció su
uso indiscriminado. Con el tiempo, comenzaron a observarse los primeros problemas de
resistencias, aparición de nuevas plagas, y a lo largo de las últimas décadas del siglo XX
empezaron a descubrirse algunos efectos nocivos de los insecticidas en el
medioambiente, operarios agrícolas, y residuos en alimentos (Delgado, 2010; Zalom,
2010; Chandler et al., 2011; Köhler & Triebskorn, 2013). Por ello, en la actualidad las
modernas tendencias productivas agrícolas de los países desarrollados tratan de
encuadrar los sistemas productivos dentro de una agricultura sostenible, siendo un
objetivo prioritario la obtención de productos agrícolas de calidad y saludables para el
consumidor mediante el empleo de prácticas de cultivo que respeten el medio ambiente.
Dentro de este contexto, se han puesto en marcha numerosos sistemas productivos entre
los que cobra cada vez más importancia en el mundo la Producción Integrada (PI). Sus
principios han sido establecidos por la Organización Internacional para la Lucha
Biológica e Integrada (OILB), y se define como “un sistema de explotación agraria que
produce alimentos y otros productos de alta calidad, mediante el uso de recursos
naturales y de mecanismos reguladores, para reemplazar los insumos contaminantes y
asegurar una producción sostenible” (Boller et al., 2004). En España, la PI cuenta con
una normativa regulada por el Real Decreto 1201/2002, de 20 de noviembre (BOE,
2002).
1
Dentro de la PI uno de los elementos esenciales es la protección de cultivos, donde el

control de plagas se hace siempre desde la perspectiva de la Gestión Integrada de Plagas
(GIP) (Viñuela, 2005). Este concepto se puede definir como “una racionalización en el
manejo de las fitopatologías que puedan afectar a los cultivos, en la que se integran
distintas herramientas, priorizando las medidas de prevención y anteponiendo los
métodos físicos, biológicos y tecnológicos a los químicos” (Delgado, 2010).
Por ello a partir del 1 de enero del 2014 la aplicación de los principios generales de la
GIP será obligatoria para todos los usuarios profesionales de la Unión Europea (UE), en
base a lo dispuesto en la Directiva 2009/128/CE del Parlamento Europeo y del Consejo,
de 21 de Octubre de 2009 sobre “uso sostenible de los plaguicidas” (OJEU, 2009). Esta
directiva ha sido transpuesta recientemente en España a través del Real Decreto
1311/2012, de 14 de septiembre, adaptándola al marco español (BOE, 2012). Los
principios de la GIP contenidos en el Anexo III de la referida Directiva ponen especial
énfasis en (OJEU, 2009):
-La prevención o eliminación de organismos nocivos mediante la rotación de cultivos,

utilización de técnicas de cultivos adecuadas, variedades resistentes, equilibrio en el
manejo del riego, abonado y adecuada limpieza de la maquinaria agrícola.
-La vigilancia de organismos nocivos mediante métodos e instrumentos adecuados.
-La aplicación de umbrales económicos antes de la realización de tratamientos
fitosanitarios.
-El uso de métodos sostenibles biológicos, físicos y otros no químicos se anteponen a
los químicos siempre que permitan un control satisfactorio de las plagas.
-La selectividad de plaguicidas, los cuales deben tener menores efectos secundarios
tanto para la salud humana, como para aquellos organismos no diana y medio ambiente.
-Los usuarios profesionales deberán limitar la utilización de plaguicidas.
-El diseño de estrategias para evitar la aparición de resistencias.
-La comprobación del éxito de las medidas fitosanitarias aplicadas.
2
1.2. Gestión Integrada de plagas (GIP) en cultivos hortícolas

protegidos.
La aplicación de programas de GIP están cobrando cada vez más importancia a nivel
Mundial. La GIP en invernaderos se originó en el norte de Europa básicamente como
respuesta a los problemas derivados de resistencia a insecticidas de algunas plagas
(como Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Hemiptera: Aleyrodidae) y
Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae), y la dificultad consiguiente para su
control (Gabarra et al., 2008). Fruto de su éxito, actualmente en los Países Bajos más
del 90 % de los cultivos de tomate, pepino, pimiento y berenjena se producen mediante
este sistema (Van Lenteren, 2009). En España, un primer paso para la introducción de
programas de GIP en cultivos hortícolas protegidos del sureste español, se produjo con
la incorporación a principio de los años 90 de Bombus terrestris (L.) (Hymenoptera:
Apidae) en la polinización del cultivo del tomate, ya que muchos de los insecticidas
utilizados no eran compatibles con los abejorros (Gabarra et al., 2008). No obstante,
todavía habría que esperar varios años para el paso decisivo hacia métodos de control de
plagas más respetuosos, que fue la detección de sustancias no autorizadas en pimiento
(Beltrán et al., 2010). En la actualidad en la provincia de Almería, la principal zona de
producción de cultivos hortícolas protegidos de España, y una de las más importantes a
nivel mundial con una superficie cultivada de 37.695 ha (Junta de Andalucía, 2010), la
GIP se ha desarrollado especialmente en cultivos como el pimiento, tomate, berenjena y
cucurbitáceas, con el control biológico como pilar básico (Robledo et al., 2009; Van der
Blom, 2007, 2008, 2010). Además de esta herramienta fundamental para el cambio de
los sistemas productivos, se dispone de otras que integran el concepto de GIP en
invernaderos hortícolas, como el monitoreo de plagas, la aplicación racional de
insecticidas selectivos y diversos métodos de control, como el físico o cultural que se
desarrollarán a continuación.
El monitoreo es la base sobre la cual se decide cualquier tipo de intervención en el

cultivo, ya que proporciona información de la presencia, estadio de desarrollo y
abundancia de la plaga en el mismo (Grant, 1997). Para ello se utilizan trampas
cromotrópicas pegajosas que utilizan el color como atrayente de ciertas plagas, además
de trampas de luz, alimenticias y feromonas (Medina et al., 2008). La inspección
3
periódica del cultivo es también una herramienta importante en este apartado, ya que
proporciona información puntual sobre su estado sanitario (Lapchin & Shtienberg,
1999). En cultivos hortícolas la fijación de muestreos no se puede generalizar, ni
simplificar a un muestreo aleatorio de un determinado número de plantas, variando su
forma de realización en función de la época del año y cultivo, siendo fundamental la
colaboración del personal de la explotación (Delgado, 2010).
En cuanto al manejo de productos fitosanitarios, como se ha descrito anteriormente y

en base a la Directiva Europea 2009/128/CE que promulga el uso sostenible de
plaguicidas, su utilización no es preferente (OJEU, 2009). Sin embargo, entre las
herramientas más utilizadas actualmente se encuentra el uso conjunto del control
químico y biológico (Medina et al., 2008; Gentz, et al., 2010). Por ello en el marco de la
GIP es esencial el estudio del efecto que los plaguicidas producen en los enemigos
naturales, aspecto que se desarrollará en el capítulo 5 de esta tesis.
La piedra angular de cualquier programa de GIP es el control biológico (Zalom et al.,

2010). Aunque existen numerosas y variadas definiciones del término, éste se puede
definir como el uso de un ser vivo con el fin de reducir la densidad de otro, idealmente
por debajo de un umbral económico de daños (Jacas & Urbaneja, 2008). Para llevar a
cabo una aplicación eficiente es necesario un conocimiento de las plagas primarias y
secundarias que aparecen en el cultivo, así como conocer los enemigos naturales y
entomopatógenos asociados a las distintas plagas con el fin de conservar la fauna útil
que de manera espontánea lo coloniza (Gabarra, 2005). En el control biológico
principalmente se usan enemigos naturales (insectos depredadores y parasitoides),
aunque también se pueden utilizar microorganismos entomopatógenos (virus, bacterias,
hongos, nematodos) (Grant, 1997; Viñuela, 2005; Urbaneja & Jacas, 2008). En cultivos
protegidos el control biológico es principalmente inoculativo estacional o aumentativo,
es decir, los agentes de biocontrol se introducen periódicamente una o más veces al año
con la finalidad de que se multipliquen en los cultivos pero sin establecerse de forma
permanente (Urbaneja & Jacas, 2008). Las principales plagas encontradas en cultivos
hortícolas protegidos, así como los enemigos naturales empleados para su control en
España se detallan en la tabla 1 a,b:
4
Tabla 1a. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados para su control en España.
Cultivos Especies plaga Enemigos naturales utilizados

Parasitoides Depredadores Otros
Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum Eretmocerus mundus Amblyseius swirskii
Orius laevigatus
Frankliniella occidentalis Amblyseius swirskii
Orius laevigatus
Pimiento Spodoptera exigua, Helicoverpa armigera Bacillus thuringiensis
Virus de la poliedrosis nuclear
Aphis gossypii, Myzus persicae Aphidius colemani
Macrosiphum euphorbiae, Aulacorthum solani Aphidius ervi Cocinélidos y Crisopas
Tetranychus urticae, Poliphagotarsonemus latus Phytoseiulus persimilis
Amblyseius swirskii
Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum Eretmocerus mundus Nesidiocoris tenuis
Encarsia formosa Macrolophus pygmaeus
Frankliniella occidentalis Nesidiocoris tenuis
Macrolophus pygmaeus
Tomate Tuta absoluta Trichogramma achaeae Nesidiocoris tenuis Bacillus thuringiensis
Liriomyza spp. Diglyphus isaea
Macrosiphum euphorbiae Aphidius ervi Cocinélidos y Crisopas
Tetranychus urticae, Aculops lycopersici Phytoseiulus persimilis
Nesidiocoris tenuis
Orius laevigatus
Tuta absoluta Nesidiocoris tenuis Bacillus thuringiensis
Berenjena Aphis gossypii Aphidius colemani
Tetranychus urticae, Poliphagotarsonemus latus Phytoseiulus persimilis
Amblyseius swirskii
5
Tabla 1b. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados para su control en España.
Cultivos Especies plaga Enemigos naturales utilizados

Parasitoides Depredadores Otros
Orius laevigatus
Pepino Orius laevigatus
Lepidópteros Bacillus thuringiensis
Tetranychus urticae Phytoseiulus persimilis
Aphis gossypii Aphidius colemani
Melón, Sandía, Lepidópteros Bacillus thuringiensis
Calabacín y
Judía Tetranychus urticae Phytoseiulus persimilis
Aphis gossypii Aphidius colemani
(Fuente, Robledo et al., 2009)
6
Con respecto a los métodos físicos de control, el más común es el uso de barreras
físicas habiendo numerosos tipos (Weintraub, 2009), un primer tipo de barreras son las
mallas anti-insectos que actúan como un simple método de exclusión (Díaz et al.,
2004), siendo su uso imprescindible en los cultivos hortícolas protegidos de Almería.
Además de este tipo de mallas, también existen modernos plásticos y mallas
fotoselectivas que bloquean la transmisión de luz ultravioleta (UV) alterando la visión y
orientación del insecto (Antignus et al., 1996). Varios estudios muestran la efectividad
de estas barreras controlando tanto las poblaciones de la plaga (moscas blancas,
pulgones y trips), como los virus que éstas transmiten debido a la imposibilidad de volar
y dispersarse en un ambiente pobre en luz UV (Costa & Robb, 1999; Antignus et al.,
2001; Chyzik et al., 2003; Fereres et al., 2003; Summers et al., 2004; Doukas & Payne,
2007a; Legarrea et al., 2010). Sin embargo, a pesar de que existen estudios que afirman
que el uso de barreras físicas es compatible con el control biológico (Chyzik et al.,
2003; Doukas & Payne, 2007b; Sal et al., 2009) éstas pueden tener un efecto negativo,
ya que pueden también interferir en la orientación de algunas especies de enemigos
naturales disminuyendo su capacidad de depredación y parasitación (Chiel et al., 2006).
Más recientemente, se viene trabajando en la utilización de mallas tratadas con
insecticidas, que se han empleado con éxito en entomología médica (Hougard et al.,
2002), y cuyo aplicación en el ámbito agrícola será abordada en el capítulo 4 de esta
tesis.
Finalmente, para el control de plagas en cultivos de invernadero es necesario aplicar

todos los métodos culturales disponibles que nos permitan evitar la proliferación de
insectos plaga y los virus que éstos son capaces de transmitir. Además de ser necesaria
una profunda revisión de todo el sistema de cultivo, incluyendo la estructura del
invernadero, y el manejo del cultivo para facilitar la actuación y la reproducción de la
fauna auxiliar. Entre las medidas más importantes destacan: la realización de una buena
gestión del clima y la ventilación, limpieza de los invernaderos de plantas y restos
vegetales antes del inicio del cultivo, la eliminación de malas hierbas que puedan
hospedar insectos plagas o ser reservorio de virus, hacer una buena gestión del abonado,
destruir brotes, hojas viejas y frutos dañados, el empleo de plantas refugio como
sistemas de cría de enemigos naturales dentro del propio cultivo, y mantener una
floración en la medida de lo posible constante en el cultivo a través de prácticas
7
agronómicas o mediante la adición de fuentes florales que sirvan como método de

control biológico por conservación (Van der Blom, 2002; Gabarra, 2005; Pineda &
Marcos-García, 2008; Frank, 2010).
1.3. Enemigos naturales.
1.3.1. Orius laevigatus.
1.3.1.1. Sistemática.
La sistemática de Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) que se cita a

continuación está basada en la clasificación de Fauna Europaea (2013a).
REINO: Animalia.
SUBREINO: Eumetazoa.
PHYLLUM: Arthropoda.
SUBPHYLLUM: Hexapoda.
CLASE: Insecta.
ORDEN: Hemiptera.
SUBORDEN: Heteroptera.
INFRAORDEN: Cimicomorpha.
SUPERFAMILIA: Cimicoidea.
FAMILIA: Anthocoridae.
SUBFAMILIA: Anthocorinae.
TRIBU: Orinii.
GÉNERO: Orius Wolff, 1811.
SUBGÉNERO: Orius Wolff, 1811.
ESPECIE: laevigatus (Fieber, 1860).
8
1.3.1.2. Distribución geográfica y hábitat.
En Europa el área de distribución de O. laevigatus abarca toda la cuenca mediterránea,

extendiéndose a las islas de la Macaronesia, la fachada atlántica de Francia y las islas
Británicas (Figura 1) (Ferragut & González, 1994). En España está ampliamente
repartido, siendo una de las especies más frecuentes y abundantes. Se asocia a gran
cantidad de especies botánicas donde puede localizar sus presas y realizar su puesta o
alimentarse de polen (Lacasa & Llorens, 1998b). En el estudio de distribución de las
especies de Orius peninsulares llevado a cabo por Ferragut y González (1994) en las
Comunidades Autónomas de Valencia, Murcia, Andalucía y Extremadura, el 47 % de
los ejemplares encontrados fueron O. laevigatus, siendo una especie muy frecuente en
zonas cultivadas o limítrofes a éstas, encontrándose tanto en cultivos protegidos, como
al aire libre y en vegetación espontánea.
Figura 1. Distribución geográfica de O. laevigatus en Europa.
Presente
Ausente
Fuente, Fauna Europaea (2013b).
9
1.3.1.3. Descripción y biología del insecto.
Los antocóridos son insectos hemimetábolos. Su ciclo biológico comprende tres

estados, huevo, ninfa y adulto (Figura 2).
Figura 2. Ciclo biológico de O. laevigatus [Fuente, Bonte, (2010)].
Los huevos poseen 0,4 mm de longitud y 0,13 mm de ancho, al principio son incoloros
y previamente a la eclosión de la ninfa se tornan de un color blanco lechoso. Los huevos
son introducidos en el tejido de la hoja, a menudo en la zona del peciolo o sobre la vena
principal del envés de ésta, y algunas veces en partes de la flor o inflorescencias (Figura
3) (Malais & Ravensberg, 2006).
Figura 3. Huevos y ninfa a punto de eclosionar de O. laevigatus.
Las ninfas pasan por cinco estadios ninfales, cuando emergen de sus huevos son
brillantes y casi sin color, pero en pocas horas se vuelven amarillentas, su longitud varía
entre 0,7 mm recién emergidas, y 2,1 mm las ninfas más desarrolladas (Lacasa &
Llorens, 1998b). Los ojos son rojos, conspicuos y fácilmente visibles en todos los
estadios. En el segundo estadio empiezan a desarrollarse los esbozos alares, pero sólo se
hacen claramente visibles en el quinto estadio ninfal (Malais & Ravensberg, 2006).
10
El adulto de O. laevigatus (Figura 4) se encuentra frecuentemente en las flores, tiene un

tamaño entre 1,4 y 2,4 mm, su coloración es variable, siendo más común encontrarlos
de color marrón oscuro, aunque también pueden mostrar tonos más claros e incluso
negros. El color de las antenas también es variable, presentando una coloración más
oscura en el primer segmento y rojiza en la extremidad del último. La cabeza es
prominente entre los ojos y posee largas sedas con el extremo romo, al igual que las dos
largas sedas en los ángulos del protórax. Las patas de este depredador son amarillas,
pudiendo presentar el tercer par más oscuro que los anteriores. En la parte membranosa
de los hemiélitros es donde presenta la característica principal de esta especie, siendo la
mitad basal de la membrana transparente y la mitad apical oscura, con una separación
rectilínea entre ambas (Figura 5) (Ferragut & González, 1994; Lacasa & Llorens, 1998b).
Figura 4. Adulto de O. laevigatus. Figura 5. Hemiélitros de O. laevigatus

[Fuente, Dongbu Farm Ceres, (2013)]. con la base de la membrana incolora y el
extremo oscuro [Fuente, Ferragut &
González, (1994)].
El abdomen está formado por 9 segmentos y presenta un notable dimorfismo sexual que
permite distinguir machos de hembras sin dificultad bajo lupa binocular (Figuras 6-7). En
las hembras es simétrico y termina en un ovipositor ligeramente curvado y de bordes
aserrados, que se emplea para cortar los tejidos vegetales e insertar en ellos los huevos.
En los machos es asimétrico, estando desplazado hacia el lado izquierdo debido a una
torsión que hace que la parte ventral de los segmentos pase a ser dorsal, y quedando en
posición dorsal las piezas que constituyen la genitalia masculina (Ferragut & González,
1994).
11
Figura 6. Macho (izquierda) y hembra (derecha) Figura 7. Esquema del abdomen del macho
de O. laevigatus. (izquierda) y de la hembra (derecha) de
Orius sp. [Fuente, Bonte, (2010)].
El ciclo biológico de O. laevigatus se ve afectado por diversos factores bióticos y

abióticos, tales como la temperatura, tipo de alimentación y en menor medida por la
planta huésped, humedad relativa o fotoperiodo (Tomassini & Nicoli, 1995; Malais &
Ravensberg, 2006). El efecto de la temperatura y tipo de dieta en los parámetros de
desarrollo de O. laevigatus son resumidos en la siguiente tabla:
Tabla 2. Tiempo de desarrollo y supervivencia de O. laevigatus bajo diferentes temperaturas y tipos de

alimentación.
Tiempo de
Temperatura desarrollo Supervivencia
(ºC) Tipo de alimentación ninfas N1-N5 ninfas N1-N5
(días) (%)
151 Ephestia kuehniella 43 ------
1
20 Ephestia kuehniella 20,4 ------
1
262 Ephestia kuehniella 16,3 78,1
2
26 Frankliniella occidentalis 15,1 46,4
3
25 Ephestia kuehniella 14,5 85
Ephestia kuehniella y polen de
3
25 pimiento 14,6 90
3
25 Polen de pimiento 17,7 65
Fuente, 1Alauzet et al., (1994); 2Tomassini & Nicoli (1994); 3Vacante et al., (1997).
12
Según Alauzet y colaboradores (1994) el tiempo medio de incubación del huevo se ve

incrementado hasta casi 4 veces en función de la temperatura. A 15 ºC el tiempo medio
se sitúa en 11,7 días, mientras que a 30 ºC es de 3,3 días, valores muy similares a los
descritos por Cocuzza y colaboradores (1997a). Sin embargo, el porcentaje de huevos
eclosados no se ve tan influenciado, situándose por encima del 73 % en un rango de
temperaturas comprendido entre 15-30 ºC (Alauzet et al., 1994). Por otro lado, el
tiempo de desarrollo ninfal (N1-N5) también es dependiente de la temperatura,
reduciéndose de 43 a 10 días cuando la temperatura se incrementa de 15 ºC a 30 ºC
(Cocuzza et al., 1997a).
El tipo de dieta también afecta al desarrollo idóneo de O. laevigatus. En el estudio

llevado a cabo por Tomassini y Nicoli (1994) la supervivencia de ninfas alimentadas
con Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) fue aproximadamente un 30 %
mayor que cuando se alimentan de Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera:
Thripidae), sin embargo, el tiempo de desarrollo no se vio afectado. Por otro lado
Vacante y colaboradores (1997) describieron que la adición de polen a huevos de E.
kuehniella no afectó ni a la supervivencia de las ninfas, ni a su desarrollo. No obstante,
el uso únicamente de polen de pimiento redujo la supervivencia de las ninfas e
incrementó su tiempo de desarrollo.
Respecto a los hábitos alimenticios, tanto las ninfas como los adultos de O. laevigatus
son conocidos por ser depredadores polífagos que pueden alimentarse de un amplio
rango de presas: trips, moscas blancas, pulgones, huevos y pequeñas larvas de
lepidópteros, ácaros o incluso miembros de su propia especie. Además, pueden
alimentarse también de polen lo cual es una gran ventaja para su mantenimiento en el
cultivo en periodos de ausencia de presa (Alvarado et al., 1997; Lacasa & Llorens,
1998b; Urbaneja et al., 2005a; Arnó et al., 2008). En cuanto a su comportamiento de
búsqueda y dispersión en el cultivo, el género Orius detecta a la presa principalmente
mediante el sentido del olfato o del tacto y no con la vista, siendo su área de búsqueda
las antenas. Son buenos voladores y se desplazan con rapidez (Malais & Ravensberg,
2006).
13
En cuanto a su comportamiento reproductivo, los adultos de O. laevigatus se aparean

desde el primer día de emergencia (Tawfik & Ata, 1973). Las hembras tras su primera
cópula evitan sucesivas, ya que almacenan el esperma y lo usan a lo largo de su periodo
de oviposición. Por otro lado, los machos son polígamos, pudiendo inseminar con éxito
hasta tres hembras por día (Leon-Beck et al., 2009). El parámero izquierdo de los
machos está modificado en un órgano que sirve para penetrar la pared del cuerpo de la
hembra durante la cópula. El macho penetra a la hembra entre el séptimo y el octavo
segmento abdominal, e inyecta el esperma dentro del tubo de copulación. El esperma es
recogido en el saco espermático, que es un compartimento anterior a la pared vaginal al
final del tubo de copulación (Schuh & Slater, 1995).
La temperatura también posee una significativa influencia en la capacidad reproductiva

de O. laevigatus. Según el estudio llevado a cabo por Alauzet y colaboradores (1994),
alrededor del 80 % de las hembras empiezan a ovipositar a temperaturas comprendidas
entre 20-30 ºC, mientras que a 15 ºC el 50 % mueren sin hacerlo. Además, a 30 ºC el
número total de huevos ovipositados es dos veces mayor, y el periodo de preoviposición
9 veces menor que a 15 ºC. Sin embargo, la longevidad de las hembras se reduce de 70
a 20 días.
Por otro lado el tipo de alimentación también puede influenciar en la fecundidad de O.

laevigatus. Tomassini y Nicoli (1995) describieron una menor fecundidad en hembras
alimentadas con F. occidentalis (56 huevos/hembra) que en aquellas que fueron
alimentadas con E. kuehniella (119 huevos/hembra). Además de la temperatura y dieta,
el tipo de planta en el que realicen la puesta también puede afectar al potencial
reproductivo de Orius spp. (Richards & Schmidt, 1996; Lundgren & Fergen, 2006).
1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos hortícolas protegidos.
La especie O. laevigatus se utiliza con éxito en el control biológico de trips en diversos

cultivos hortícolas y ornamentales protegidos (Urbaneja, et al., 2005a). Destacando su
utilización en pimiento al ser el principal depredador de F. occidentalis y Thrips tabaci
Lindeman (Thysanoptera: Thripidae), los cuales ocasionan en el cultivo daños directos a
hojas y frutos que deprecian su valor comercial, y transmiten el tospovirus Tomato
spotted wilt virus (TSWV) (Arnó et al., 2006; Bosco et al., 2008; Van der Blom, 2010).
14
En España, los primeros éxitos a gran escala se produjeron en el Campo de Cartagena,

donde se aplicó satisfactoriamente en el cultivo de pimiento desde el año 2000. En
Almería no se produjo una introducción masiva hasta el final de la campaña del 2006-
2007, debido principalmente a los distintos ciclos de cultivo, la masiva concentración de
invernaderos y al solape de diferentes cultivos con distintos ciclos (Van der Blom, 2007,
2008, 2010).
Para la aplicación de O. laevigatus en programas de GIP se debe tener en cuenta:
-Las condiciones ambientales del invernadero: al menos durante los primeros meses tras
su introducción la humedad relativa debe ser superior al 60 % para favorecer el
desarrollo de las ninfas (Robledo et al., 2009).
-El cultivo: O. laevigatus se introduce en una amplia gama de cultivos, pero siempre
teniendo en cuenta que éstos sean buenos productores de polen (pimiento, gerbera,
fresa, berenjena). En el caso particular del tomate no se establece de manera adecuada
debido a sus pelos glandulares (Malais & Ravensger, 2006; Robledo et al., 2009;
Biobest, 2013a).
-Los enemigos naturales: el uso de O. laevigatus es compatible con la utilización de

otros agentes de biocontrol, como Amblyseius swirskii Athias-Henriot (Acari:
Phytoseiidae) en pimiento (Van der Blom, 2008, 2010).
-La aplicación: se hace en pequeños montones en la superficie de la hoja del cultivo o

mediante el uso de cajas de aplicación, siendo el material extendido en capas finas de 1-
2 cm. Los insectos se reparten de manera homogénea por todo el cultivo, reforzando
aquellas zonas propensas a la entrada de trips. Además la suelta se realizará a la sombra
y en plantas con flores. Las introducciones de O. laevigatus en pimiento se realizan
unas 4 semanas después del trasplante, repartiéndose su aplicación en 2 o 3 semanas
(Robledo et al., 2009). En cuanto a dosis de suelta, si se desea realizar un tratamiento
preventivo será de 1-2 individuos/m2. Si es curativo, se introduciría en las áreas
afectadas a una dosis de 5-10 individuos/m2 (Biobest, 2013a).
15
1.3.2. Nesidiocoris tenuis.
1.3.2.1. Sistemática.
La sistemática de Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) que se cita a

continuación está basada en la clasificación de Fauna Europaea (2013c)
REINO: Animalia.
SUBREINO: Eumetazoa.
PHYLLUM: Arthropoda.
SUBPHYLLUM: Hexapoda.
CLASE: Insecta.
ORDEN: Hemiptera.
SUBORDEN: Heteroptera.
INFRAORDEN: Cimicomorpha.
SUPERFAMILIA: Miroidea.
FAMILIA: Miridae.
SUBFAMILIA: Bryocorinae.
TRIBU: Dicyphini.
GÉNERO: Nesidiocoris Kirkaldy, 1902.
ESPECIE: tenuis (Reuter, 1895).
1.3.2.2. Distribución geográfica y hábitat.
En Europa N. tenuis se encuentra principalmente en la cuenca Mediterránea y franja

atlántica de Francia (Figura 8). En España aparece con mayor frecuencia y abundancia en
cultivos hortícolas protegidos de la zona del litoral Mediterráneo e Islas Canarias,
encontrándose principalmente sobre solanáceas (Goula & Alomar, 1994; Calvo &
Urbaneja, 2004; Téllez & Tapia, 2006; Sánchez et al., 2009a; Castañé et al., 2011).
16
Figura 8. Distribución geográfica de N. tenuis en Europa.
Presente
Ausente
Fuente, Fauna Europaea (2013d).
1.3.2.3. Descripción y biología del insecto.
Los míridos son insectos hemimetábolos. Su ciclo biológico comprende tres estados,
huevo, ninfa y adulto (Figura 9).
Figura 9. Ciclo biológico de N. tenuis [Fuente, Calvo & Urbaneja, (2003)].
17
Los huevos son depositados por las hembras en el interior de la epidermis del tejido
vegetal, de forma que sólo es visible la lígula (apéndice respiratorio) (Franco, 2010).
Las ninfas pasan por cinco estadios ninfales (Figura 9), diferenciándose unos de otros
por su tamaño, el cual se incrementa con el desarrollo y por la aparición de esbozos
alares en los dos últimos estadios (Figura 10) (Calvo & Urbaneja, 2004).
Figura 10. Ninfas de N. tenuis, estadio N1 (izquierda) y N5 (derecha).
En el último estadio ninfal ya se puede diferenciar el sexo del individuo, presentando la

genitalia de la hembra una T invertida y la del macho un punto negro (Figura 11) (Téllez
& Tapia, 2006).
♀ ♂
Figura 11. Detalle de la hembra y macho de N. tenuis, [Fuente, Téllez & Tapia, (2006)].
Dentro de las especies ibéricas del género, el adulto de N. tenuis se distingue por las
manchas o bandas negras que destacan sobre la coloración verde claro de fondo, siendo
el tamaño de esta especie inferior a 4 mm (Figura 12). En la cabeza son negros el tilo, los
ojos y una banda en el borde posterior típica de la especie. En las antenas existen bandas
negras en los distintos artejos, lo que les confiere un aspecto anillado. Los hemiélitros
son grisáceos, translúcidos y con una pilosidad fina y oscura. La base y la punta de las
tibias, así como los tarsos, están oscurecidos (Goula & Alomar, 1994).
18
Figura 12. Adulto de N. tenuis.
La duración del ciclo biológico y supervivencia de N. tenuis está muy influenciada por
el tipo de presa (Tabla 3a), planta huésped (Tabla 3b) y condiciones ambientales (Tabla 4).
Tabla 3. Parámetros biológicos de N. tenuis (25 ºC, 75 % HR) en función del a. Efecto del tipo de presa
en tomate y b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella.
a. Efecto del tipo de presa en tomate.
Duración Supervivencia Longevidad adultos

Presa desarrollo ninfal (%) (Días) Huevos/día/hembra
(Días)
Bemisia tabaci 13,2 60,5 24,1 2,5
Trips 20,6 59 ------------- -------------
Araña roja 23,4 45 ------------- -------------
Huevos
Ephestia kuehniella 12,9 73,7 22,6 4,6
Sin presa 0 0 14,9 1
b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella.
Duración Supervivencia Longevidad adultos

Cultivo desarrollo ninfal (%) (Días) Huevos/día/hembra
(Días)
Pimiento 14 64,3 23 1,7

Tomate 12,8 72,7 22,6 4,6
Berenjena 12,6 73,7 16,3 2,3
(Fuente, Urbaneja et al. 2003, 2005b).
19
Cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella o Bemisia tabaci (Gennadius)

(Hemiptera: Aleyrodidae), la duración del ciclo es inferior y la supervivencia mayor que
cuando la presa es trips o araña roja. Cuando se desarrolla sobre tomate o berenjena
también su ciclo es más rápido que cuando lo hace sobre pimiento. Estos resultados
ponen de manifiesto la versatilidad de N. tenuis como enemigo natural, sin embargo,
muestra una cierta preferencia por B. tabaci y huevos de E. kuehniella, así como por
plantas con pilosidad como el tomate y la berenjena (Calvo & Urbaneja, 2004). Otro
factor importante en la biología de N. tenuis es su incapacidad de alcanzar el estado
adulto en ausencia de presa (Urbaneja et al., 2005b).
Tabla 4. Parámetros biológicos de N. tenuis a diferentes rangos de temperatura cuando es alimentado con
huevos de E. kuehniella sobre planta de tomate.
Tiempo eclosión Duración Mortalidad Número de

Temperatura huevos desarrollo ninfal ninfas Proporción de ninfas/hembra
(ºC) (Días) (Días) (%) hembras durante 21 días
15 30,8 ± 0,2 a 55,9 ± 0,3 a 37,2 46,3 0,80 ± 0,2 c

20 17 ± 0,2 b 21,2 ± 0,4 b 18,3 39,6 79,5 ± 5,5 a
25 8,9 ± 0,1 c 12,9 ± 0,3 c 6,5 52,6 60,0 ± 5,0 b
30 7,5 ± 0,05 d 9,7 ± 0,3 d 13,3 60,8 68,0 ± 5,0 ab
35 6,3 ± 0,02 e 8,6 ± 0,5 e 48,3 64,5 62,4 ± 10,4 ab
(Fuente, Sánchez et al., 2009a).
Los resultados descritos por Sánchez y colaboradores (2009a) explican el patrón de

distribución geográfica de N. tenuis, ya que el rango óptimo de temperatura para su
desarrollo se sitúa entre los 20-30 ºC.
Respecto a los hábitos alimenticios, tanto las ninfas como los adultos son conocidos
por ser depredadores polífagos, pudiendo alimentarse de moscas blancas, trips,
pulgones, minadores, ácaros y lepidópteros (Urbaneja et al., 2005b). Ambos estados se
desplazan con rapidez sobre la superficie de la hoja, lo cual les confiere una gran
capacidad de búsqueda de presas. Tras su detección, clavan su estilete para
posteriormente succionar sus jugos internos (Calvo & Urbaneja, 2004). Además N.
tenuis posee alimentación mixta, fitófaga y zoófaga (Arnó et al., 2006; Sánchez et al.,
20
2006), la cual hace que en ausencia de presa pueda ocasionar daños en el cultivo. En
tomate puede producir punteaduras en frutos, abortos florales y formación de anillos
necróticos sobre tallos y hojas (Sánchez et al., 2008; Calvo et al., 2009; Castañé et al.,
2011). Sin embargo, según Sánchez (2009b) no es esperable una reducción en el
rendimiento del cultivo de tomate para valores inferiores a 0,65 N. tenuis por hoja
independientemente de la población de mosca blanca, o hasta 5 N. tenuis por hoja
cuando el número de moscas blancas sea superior a 26 por hoja.
En cuanto a su comportamiento reproductivo, no ha sido ampliamente estudiado.

Según El-Desouki y colaboradores (1976), el periodo de apareamiento suele ser tanto
diurno como nocturno, la hembra acepta fácilmente al macho para la cópula, la cual es
larga (superior a dos horas), y una vez finalizada, tanto machos como hembras son
capaces de acoplarse varias veces. El cortejo en míridos puede ser relativamente
elaborado según especies, sin embargo, la posición de la cópula es similar debido a la
configuración asimétrica de los machos. Éstos tienen el parámero izquierdo más largo,
por lo que la cópula se realiza por el lado derecho de la hembra y una vez la pareja está
acoplada el macho gira 180 º (Franco, 2010) (Figura 13).
Figura 13. Posición de cópula en N. tenuis, [Fuente, Téllez & Tapia, (2006)].
1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos hortícolas protegidos.
N. tenuis es un depredador principalmente usado en cultivo de tomate y berenjena para

el control de B. tabaci, y en menor medida de T. vaporariorum, pudiendo depredar otras
plagas como F. occidentalis, T. urticae, y huevos de lepidóptero (Gabarra et al., 2008;
Robledo et al., 2009). Actualmente su valor como agente de biocontrol viene dado por
los buenos resultados obtenidos en el control de Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera:
Gelechiidae) en cultivo de tomate (Urbaneja et al., 2009; Mollá et al., 2011).
21
Para la aplicación de N. tenuis en programas de GIP se debe tener en cuenta:
-Las condiciones ambientales del invernadero: las temperaturas deben ser altas (>20 ºC)
para su correcto establecimiento. Los meses de primavera y verano son los más
adecuados para su introducción en el cultivo de tomate, ya que durante el invierno el
desarrollo de sus poblaciones se hace más lento, no observándose una población elevada
en el cultivo (Van der Blom, 2005; Robledo et al., 2009).
-La existencia de presa en planta: no sólo por prevenir posibles daños en el cultivo a
causa de su carácter fitófago (Sánchez et al., 2008; Calvo et al., 2009; Castañé et al.,
2011), sino porque como se ha visto anteriormente, la supervivencia de N. tenuis en el
cultivo se ve condicionada por la presencia de presa (Urbaneja et al., 2005b).
-El cultivo y el ciclo del mismo: existen estudios que muestran que la planta de tomate
es una buena hospedadora para N. tenuis (Urbaneja et al. 2005b), pero sobre plantas de
pimiento muestra cierta dificultad a la hora de alcanzar niveles poblacionales adecuados
(Calvo & Belda, 2006). Además, N. tenuis posee un ciclo biológico lento, por lo que
sólo sería recomendable su uso en aquellos cultivos protegidos que posean un ciclo de
cultivo largo, más de 3 meses, como tomate, o berenjena, y no sería recomendable en
pepino, calabacín, judía, melón y sandía (Van der Blom, 2007).
-Los enemigos naturales: el uso de N. tenuis es compatible con la utilización de otros

agentes de biocontrol, como los parasitoides Eretmocerus mundus Mercet
(Hymenoptera: Aphelinidae) y Encarsia formosa Gahan (Hymenoptera: Aphelinidae)
(Robledo et al., 2009).
-La aplicación: la suelta se realiza distribuyendo el producto sobre las hojas del cultivo
o en cajas de cartón que se cuelgan de los tallos. Las introducciones se harán al
principio en focos, aumentando la posibilidad de encuentro entre sexos, para luego
realizarlas de manera más general por todo el cultivo (Biobest, 2013b). La dosis de
suelta recomendada es de 1-2 individuos/m2 a las 2-4 semanas tras la realización del
trasplante (Calvo et al., 2009). Con baja disponibilidad de presa, la reproducción y la
instalación de N. tenuis se ralentiza, esto suele ocurrir en tomate, donde se suele
empezar con bajas poblaciones de mosca blanca debido a las medidas preventivas que
22
se toman para la entrada de adultos (malla 10 X 20 hilos/cm2), o a prácticas culturales

(deshojados y podas). En estos casos se aconseja alimentar a N. tenuis utilizando huevos
de E. kuehniella (Robledo et al., 2009), o sucrosa (Urbaneja-Bernat et al., 2013).
Actualmente y con unos resultados prometedores, se está poniendo en práctica una
nueva estrategia para el control de mosca blanca y T. absoluta en tomate, que es la
inoculación de N. tenuis en plántulas que posteriormente serán usadas en el trasplante,
con el fin de que se establezca en el cultivo desde el inicio del mismo, reduciendo así el
uso de productos fitosanitarios (Calvo & Belda, 2010; Calvo et al., 2012a,b).
23
Capítulo 2
2. Objetivos
2. OBJETIVOS.
La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de

Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y
sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico,
físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos en
cultivos hortícolas es a veces un complemento necesario para el adecuado manejo de
plagas. Por ello, el objetivo general de esta tesis es aportar conocimientos para mejorar
el control de plagas en cultivos hortícolas mediante la integración de tres estrategias de
lucha: biológica, física y química. Para su consecución los objetivos particulares
tratados en el estudio son los siguientes:
-Estudiar la compatibilidad de nuevas barreras físicas (mallas tratadas con bifentrin) con
enemigos naturales utilizados en cultivos hortícolas protegidos (Capítulo 4).
-Estudiar la toxicidad de modernos insecticidas (abamectina, deltametrina, emamectina,

flubendiamida, spinosad y spiromesifen) empleados en cultivos hortícolas protegidos
sobre los agentes de biocontrol O. laevigatus y N. tenuis (Capítulo 5).
-Estudiar la compatibilidad de insecticidas aceleradores de la muda (RH-5859,

tebufenocida y metoxifenocida) con los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis,
así como su modo de acción mediante estudios de modelado por homología y de
acoplamiento molecular (“docking”) (Capítulo 6).
24
Capítulo 3
Capítulo 3. Materiales y métodos generales
3. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES.
3.1. Lugar de estudio y condiciones ambientales.
3.1.1. Laboratorio.
Los ensayos de laboratorio correspondientes a mallas tratadas con bifentrin

(Capítulo 4, puntos 4.2.2. y 4.3.1.) y toxicidad de insecticidas (Capítulo 5 y 6,
puntos 6.3.2. y 6.4.1.), se realizaron en las instalaciones que la Unidad de Protección de
Cultivos posee en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos (E.T.S.I.A.) de
Madrid.
Las condiciones ambientales del insectario (4,25 m de largo, 2 m de ancho y 2,5 m de

alto) en la que se llevaron a cabo los ensayos fueron las siguientes:
• Temperatura: 25 ± 5º C.
• Humedad relativa del aire (HR): 50 ± 5 %.
• Fotoperiodo: 16 horas luz: 8 horas oscuridad (16L: 8 O).
Para permitir la renovación del aire y evitar variaciones bruscas de la temperatura, la

cámara incluía un equipo de ventilación y calefacción (Interclisa®, modelo
CUCV026M3-CXE026M3), regulado por un termostato (Sunvic®).
Mediante un higrostato conectado a un humificador se reguló el porcentaje de humedad

(Defensor®, modelo 505), controlada por un termohigrómetro digital con memoria de
niveles máximos y mínimos.
La iluminación dentro de la cámara fue proporcionada por dos tubos fluorescentes (Gro-
Lux®) en cada estante. En cuanto al fotoperiodo, un reloj conmutador (Orbis®)
controló el encendido y apagado de las lámparas.
25
3.1.2. Invernadero.
El invernadero que la Unidad de Protección de Cultivos posee en los Campos de

Prácticas de la E.T.S.I.A. (Madrid), consta de una estructura de cristal, con un sistema
de refrigeración, calefacción, iluminación y riego por goteo (Figuras 14-15). En él se
realizaron parte de los ensayos de toxicidad de mallas tratadas con bifentrin
(capítulo 4, puntos 4.2.3. y 4.3.2.), y se mantuvieron las plantas tratadas con
insecticidas empleadas en los estudios de persistencia (capítulo 5, puntos 5.2.5. y
5.3.2.).
Figura 14. Vista general del invernadero. Figura 15. Interior del invernadero.
Las condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa se registraron mediante

un medidor (Tinytag Ultra 2®, Gemini Data Loggers, Chichester, Reino Unido), (Figura
16). Además, en los ensayos de persistencia también se realizaron mediciones puntuales
de la radiación ultravioleta (UV) y fotosintéticamente activa (PAR), las cuales se
tomaron diariamente a las 12 horas, realizando 6 medidas tanto en el interior como en el
exterior del invernadero. Los radiómetros empleados en la medición de la radiación UV
y PAR fueron (Ultra-Violet Meter®, modelo MU-200, y Quantum-Meter®, modelo
BQM, Apogee Instruments, Logan, Estados Unidos), respectivamente (Figura 17-18).
26
Figura 16. Medidor de temperatura y Figura 17. Medidor de radiación ultravioleta (UV).
humedad relativa.
Figura 18. Medidor de radiación fotosintéticamente activa (PAR).
3.1.3. Campo (túneles semi-comerciales).
Los ensayos de campo en túneles semi-comerciales con mallas tratadas con

bifentrin (Capítulo 4, punto 4.2.4. y 4.3.3.) se realizaron a 22 km de Madrid en la
finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid), perteneciente al Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).
Los parámetros de temperatura, humedad relativa, radiación UV y PAR se registraron

del mismo modo al descrito anteriormente para los ensayos llevados a cabo en
invernadero. El estadio fenológico de las plantas se determinó según Meier (1997), en 6
plantas elegidas al azar en cada una de las unidades experimentales. Finalmente, los
valores de pluviometría se obtuvieron de la estación metereológica situada en el barrio
de La Poveda (Arganda del Rey, Madrid) (Meteoclimatic, 2013).
27
3.2. Material biológico y su manejo.
3.2.1. Cría de Orius laevigatus.
Los adultos y ninfas evaluados en los ensayos fueron suministrados por Agrobío
(ORIcontrol®, La Mojonera, España) y Distiagro (Oriline®, Sagunto, España),
respectivamente. Para asegurar su calidad, el día de su recepción se separaban en lotes
de 30 insectos confinándolos en cajas de plástico redondas (5 cm de altura y 12 cm de
diámetro, con una rejilla de ventilación de 3 cm de diámetro), a las que se les añadía una
judía verde como fuente de líquido, y como dieta 0,4 gr de huevos de E. kuehniella
(Entofood®, Koppert, La Mojonera, España). Las cajas se mantenían en el laboratorio
durante 24 h bajo las condiciones ambientales descritas anteriormente. Transcurrido este
periodo se evaluaba el estado de cada lote, seleccionándose únicamente para la
realización de los ensayos aquellos lotes cuya mortalidad media era inferior al 10 %.
3.2.2. Cría de Nesidiocoris tenuis.
La metodología empleada en la cría de N. tenuis que se describe a continuación se

desarrolló íntegramente en nuestro laboratorio en 2011, a partir de 500 adultos
procedentes de la empresa Agrobío (NESIDIOcontrol®, La Mojonera, España).
Los adultos se colocan en cajas de metacrilato (40 X 30 X 30 cm), con una tapa cubierta
con visillo en la parte superior para facilitar la ventilación. En ambos laterales, y con el
fin de facilitar la manipulación de los insectos se dispone de mangas de visillo (Figura
19).
Figura 19. Caja de cría de adultos N. tenuis (40 X 30 X 30 cm).
28
En cada caja de cría de adultos, se introducen 500 gr de judías verdes [Phaseolus

vulgaris L. (Fabaceae)] (Figura 20), a modo de sustrato de oviposición y fuente de
líquido, y como dieta 4,8 gr de huevos de E. kuehniella distribuidos en cuatro
comederos de 3,5 cm de diámetro cada uno (Figura 21).
Figura 20. Judías verdes utilizadas como Figura 21. Dieta basada en huevos de E. kuehniella.
sustrato de oviposición y fuente de líquido.
La puesta de dos días procedente de la caja de cría de adultos se coloca en cajas de

plástico (22 X 10 X 7 cm), con una rejilla de ventilación (13 X 4 cm) (Figura 22). En
cada una se introducen de 2 a 5 judías verdes. Tras un plazo aproximado de ocho días a
una temperatura de 25 ± 5º C, HR 50 ± 5 % y fotoperiodo 16L: 8O, se obtienen las
primeras ninfas N1 (Figura 23). Para su óptimo desarrollo en cada una de las cajas de cría
de ninfas se introducen 65 gr de judías verdes y 0,4 gr de huevos de E. kuehniella, paso
que se repite a los 7 días, retirando además aquellas judías verdes en mal estado.
Figura 22. Caja de cría de ninfas de N. tenuis, Figura 23. Ninfas N1 de N. tenuis.
(22 X 10 X 7 cm).
Pasados 3 días, cuando las ninfas alcanzan el estadio N4-N5, se introducen de nuevo en
cajas de cría de adultos (Figura 19) hasta completar su ciclo de desarrollo.
29
Tabla 5. Resumen de la cría de N. tenuis a una temperatura de 25 ± 5º C, humedad relativa (HR) 50 ± 5

% y fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad (16L: 8O).
Día Actividad
Se parte de una caja de cría (40 X 30 X 30 cm) con 500 adultos de
0 N. tenuis de 3-4 días de edad, en la cual se introducen 500 gr de
judías verdes y 4,8 gr de huevos de E. kuehniella
Se retiran las judías verdes de la caja de cría de adultos, y
2 se introducen en cajas de cría de ninfas (22 X 10 X 7 cm).
(De 2-5 judías verdes por caja de cría de ninfas)
Se introducen 65 gr de judías verdes y 0,4 gr de huevos de
10
E. kuehniella en cada una de las cajas de cría de ninfas
Se repite el paso realizado el día 10, retirando aquellas
17
judías verdes en mal estado
Las ninfas N4-N5 son introducidas de nuevo
20 en cajas de adultos (40 X 30 X 30 cm), con
500 gr de judías verdes y 4,8 gr de huevos de E. kuehniella
Ciclo completo
22-24
(25 ± 5º C; HR, 50 ± 5 %; fotoperiodo, 16L: 8O)
30
3.2.3. Material vegetal.
En los ensayos de toxicidad de mallas tratadas con bifentrin en invernadero

(capítulo 4, puntos 4.2.3. y 4.3.2.) y persistencia (capítulo 5, puntos 5.2.5. y 5.3.2), se
emplearon plantas de pimiento [Capsicum annuum L. (Solanaceae)] variedad California
Wonder (CMI, Courtaboeuf Cedex, Francia), cuando el enemigo natural a evaluar fue
O. laevigatus, y plantas de tomate [Solanum lycopersicum L. (Solanaceae)] variedad
Marmande (Batlle S.A., Molins de Rei, España), en el caso de N. tenuis.
Por otro lado, en los ensayos realizados en campo en túneles semi-comerciales

(capítulo 4, puntos 4.2.4, y 4.3.3.), se emplearon plantas de pepino [Cucumber sativus
L. (Cucurbitaceae)]. En el ensayo de otoño del 2011 se utilizó la variedad Ashley
(Rocalba, Gerona, España), mientras que en los ensayos posteriores de primavera-
verano y otoño del 2012 la variedad empleada fue Marumba (Enza Zaden C.I., Sª María
del Águila, España).
Para la obtención de las plantas, el semillado se realizó a 3 cm de profundidad en

semilleros de 80-150 alveólos, con una mezcla de tierra y vermiculita en proporción 1:2.
Una vez realizado el semillado, las bandejas se trasladaron a una cámara de germinación
con unas condiciones ambientales de 25 ± 5º C y humedad relativa 75 ± 5 %.
Tras su germinación, en un plazo de 4, 7 y 14 días, para semillas de pepino, tomate y

pimiento, respectivamente, las plántulas de tomate y pimiento se trasladaron en
bandejas de plástico al invernadero que posee la Unidad de Protección de Cultivos en
los Campos de Prácticas de la E.T.S.I.A. Dos semanas más tarde, se trasplantaron a
macetas de 12 cm de diámetro (Figuras 24-25) hasta alcanzar el tamaño deseado (Figuras
26-27). En el caso de los semilleros con plántulas de pepino, se trasladaron a la finca
experimental “La Poveda” con el fin de garantizar una buena aclimatación de la planta
(Figura 28). En un plazo de 10-14 días se procedió a realizar el trasplante en campo,
cuando el estadio fenológico de la planta era aproximadamente de primera-segunda hoja
verdadera del tallo principal desplegada (Figura 29).
31
Figura 24. Plántulas de tomate Figura 25. Plántulas de pimiento

recién trasplantadas. recién trasplantadas.
Figura 26. Plantas de tomate (50 cm) empleadas Figura 27. Plantas de pimiento (30-40 cm)
en los ensayos. empleadas en los ensayos.
Figura 28. Semilleros de pepino. Figura 29. Trasplante de pepino, estado

fenológico primera-segunda hoja verdadera
del tallo principal desplegada
32
3.3. Análisis estadístico.
Los datos de los ensayos se analizaron con el programa Statgraphics® Plus, Versión 5.0
(STSC, 1987).
Las pruebas de contraste de hipótesis utilizadas aparecen en la tabla 6 agrupadas según

el tipo de variable a analizar.
Tabla 6. Pruebas de contraste de hipótesis aplicadas en los ensayos.
Variable Variable Pruebas

independiente dependiente empleadas Observaciones
Compara medias
Categórica Cuantitativa t-de Student entre 2 grupos
Análisis de
Compara medias
Categórica Cuantitativa
Varianza entre >2 grupos
2 grupos.
Categórica Cuantitativa Mann-Whitney-
Análisis no
Wilcoxon paramétrico
>2 grupos.
Categórica Cuantitativa Kruskall-Wallis
Análisis no
paramétrico
(Fuente, Martínez-González et al., 2001).
En los capítulos 5 y 6 (puntos 6.3.2. y 6.4.1.) los resultados se sometieron a análisis

de varianza de una vía (ANOVA). El requisito indispensable para poder realizar el test
F de análisis de varianza es la verificación de dos hipótesis, la hipótesis de normalidad
(Test de Kolmogorov-Smirnoff, P≥0,05) y homocedasticidad (Test de Barlett, P≥0,05).
33
La primera hipótesis exige que los datos sigan una distribución normal y la segunda,
que las varianzas sean homogéneas. Cuando no se cumplió alguna de las hipótesis,
normalidad y/o homocedasticidad, se recurrió a hacer un cambio de variable. Cuando
los parámetros evaluados fueron un porcentaje, la transformación utilizada fue y=arcsen
(√(x/100)). En el resto de los casos se utilizó, y=log (x+1).
Si después del cambio de variable no se cumplieron las premisas anteriores, se recurrió

al test no paramétrico de Kruskall-Wallis. Por el contrario, si las hipótesis se cumplieron
y se detectaban diferencias significativas (P<0,05), se recurrió al Test LSD (mínimas
diferencias significativas). Este test separa las medias de los datos en grupos
homogéneos para facilitar la comparación entre los distintos tratamientos.
Por otro lado, los resultados que aparecen en el capítulo 4 se analizaron mediante
el test de la t de Student. Al igual que en el análisis de varianza (ANOVA), para poder
aplicar este tipo de análisis es necesario que se cumplan las hipótesis de normalidad y
homocedasticidad.
Para comprobar si la variable cuantitativa sigue una distribución normal, se deben

cumplir tres requisitos, que la curtosis, la cual analiza el grado de concentración que
presentan los valores alrededor de la zona central de la distribución, sea menor a dos
veces su error estándar (en valor absoluto); que la asimetría, concepto que se refiere a si
la curva que forman los valores de la serie representa la misma forma a izquierda y
derecha de un valor central (media aritmética), sea menor que dos veces su error
estándar (en valor absoluto), y finalmente que el valor máximo y mínimo de la variable
cuantitativa quede dentro del intervalo definido por tres desviaciones estándar por
encima y por debajo de la media. Si se cumplieron estos requisitos, además hay que
comprobar que las varianzas de ambos grupos sean iguales, es decir, homogéneas. Para
ello se recurrió a la prueba F de Snedecor que nos permite comprobar que no haya
diferencias significativas entre las varianzas, P≥0,05. Si en algún caso la hipótesis de
normalidad y homocedasticidad no se cumplieron, se recurrió al test no paramétrico de
Mann-Whitney-Wilcoxon (Martínez-González et al., 2001).
34
Capítulo 4
Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin
4. COMPATIBILIDAD DE LOS ENEMIGOS NATURALES

ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS CON EL
USO DE MALLAS TRATADAS CON BIFENTRIN COMO
MÉTODO FÍSICO DE CONTROL 1.
4.1. Introducción.
Las mallas tratadas con insecticida se desarrollaron inicialmente como barreras físico-
químicas para tratar de controlar a varias especies de mosquitos vectores de la malaria
[Anopheles spp. (Diptera: Culicidae)] (Hougard et al., 2002). Principalmente son
utilizadas en países tropicales, particularmente en Asia, y cada vez su uso está más
extendido en el continente africano (Lines et al., 1996; Hougard et al., 2002). Existen
dos tipos de mallas tratadas con insecticida: mallas convencionales usadas como
mosquiteras que se bañan en una solución insecticida a la dosis recomendada, o mallas
insecticidas de larga duración [“long lasting insecticidal nets” (LLINs)] que llevan
incorporado el tratamiento insecticida en el interior de sus fibras (Jaramillo et al., 2011).
Los piretroides son los compuestos comúnmente empleados en este tipo de barreras
debido a su elevado efecto de choque y alto potencial insecticida a bajas dosis,
combinado con su relativa seguridad para personas y uso doméstico (Zaim et al., 2000).
Los piretroides recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para su
uso en entomología médica son: alfa-cipermetrina (10 %), ciflutrin (5 %), deltametrina
(1-25 %), etofenprox (10 %), lambda-cihalotrin (2,5 %) y permetrina (10 %) (Jaramillo
et al., 2011). Todos ellos, a excepción de permetrina, están incluidos en la lista
comunitaria de sustancias activas incluidas para uso agrícola, anexo I de la Directiva
91/414/CEE (MAGRAMA 2013a). Además, otros piretroides como bifentrin, también
incluido en el anexo anterior, se ha evaluado como posible candidato para ser utilizado
en este tipo de mallas con resultados positivos (Hougard et al., 2002; Chouaibou et al.,
2006).
1
Safety of insecticide-impregnated nets on natural enemies commonly used in horticultural crops. En
redacción.
35
A parte de su uso en entomología médica, desde hace años también se viene trabajando
en el desarrollo de posibles aplicaciones agrícolas. Las mallas tratadas con insecticidas
pueden actuar como un método de exclusión, que reduzca el número de insectos capaces
de entrar en los invernaderos, y como un método directo de control de plagas, (Díaz et
al., 2004). Algunos trabajos realizados en campo en cultivos hortícolas como col,
berenjena africana y pepino, han mostrado resultados prometedores en el uso de este
tipo de mallas. En un cultivo de col, el uso de mallas tratadas con deltametrina produjo
una menor incidencia y daño ocasionado por lepidópteros y pulgones (Díaz et al., 2004;
Martín et al., 2006; Licciardi et al., 2008). En el cultivo de berenjena africana, la malla
tratada con el acaricida dicofol también controló con éxito a los ácaros
Poliphagotarsonemus latus (Banks) (Acari: Tarsonemidae) y Tetranychus spp. (Acari:
Tetranychidae) (Martín et al., 2010). En un cultivo de pepino, Dader y colaboradores
(2012) describieron como la utilización de mallas tratadas con bifentrin redujo la
entrada del pulgón Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae), y la incidencia de los
virus CMV (Cucumber mosaic virus) y CABYV (Cucurbit aphid-borne yellows virus).
Por otro lado, ensayos llevados a cabo en lechuga por Legarrea (2011) en laboratorio y
en invernadero también mostraron la efectividad de mallas tratadas con deltametrina
sobre el pulgón Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae).
Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado estudios sobre los posibles efectos
que pudieran provocar las mallas tratadas con insecticidas en los enemigos
naturales. Por ello, es necesaria la realización de ensayos, que bajo diferentes
escenarios y formas de exposición nos proporcionen información sobre su
compatibilidad en el marco de la GIP.
36
4.2. Materiales y métodos.
4.2.1. Características y manejo de la malla tratada con bifentrin y

malla control.
La malla tratada con bifentrin con la que se realizaron los ensayos, fue suministrada
por la empresa Intelligent Insect Control (IIC) (Castelnau Le Lez, Francia) (Figura 30).
Este tipo de malla lleva incorporado el tratamiento insecticida en el interior de sus fibras
(LLINs), siendo su dosis inicial de 3,6 gr bifentrin/kg de malla según el fabricante. En
cuanto a sus características físicas, la malla posee 10 X 10 hilos/cm, tamaño de poro 1
X 1 mm y color amarillo claro (Figura 31).
1 mm.
1 mm.
Figura 30. Malla tratada con bifentrin Figura 31. Detalle de las características físicas de
tras su recepción. la malla tratada con bifentrin.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las mallas tipo LLINs pueden
mantener su capacidad insecticida durante tres años en condiciones de campo (WHO,
2005). Aún así, antes de la realización de los ensayos y con el fin de preservar sus
propiedades insecticidas, la malla se almacenó en una cámara frigorífica a 10-12 ºC en
ausencia de luz por recomendación del fabricante.
En los ensayos de campo realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del
Rey, Madrid), la malla tratada con bifentrin no se reemplazó en ninguno de los tres
ciclos de cultivo evaluados, de modo que para comprobar que la degradación de la
malla no fuese excesiva, al final de cada ciclo de cultivo la cantidad de bifentrin
37
presente en la misma se analizó en el Laboratorio Arbitral Agroalimentario (LAA),

dependiente del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente
(MAGRAMA) (Tabla 7).
Tabla 7. Dosis de la malla tratada con bifentrin tras cada ciclo de cultivo y su reducción en los ensayos
realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid).
Final ciclo Final ciclo Final ciclo

Dosis inicial Otoño 2011 Primavera- Otoño 2012
(Septiembre 2011) (Diciembre 2011) Verano 2012 (Noviembre 2012)
(Julio 2012)
gr bifentrin/kg de malla 3,6 2,9 2,3 2,1
Reducción respecto a la
dosis inicial -----
19,4 36,1 41,7
(Septiembre 2011)
(%)
Reducción respecto a la
dosis inicial -----
19,4 20,7 8,7
de cada ciclo
(%)
Además en cada uno de los ensayos se contó con una malla control, suministrada
también por la empresa IIC, que poseía características idénticas a las descritas
anteriormente para la malla tratada con bifentrin, pero sin tratamiento insecticida.
38
4.2.2. Laboratorio.
4.2.2.1. Evaluación de la preferencia entre malla control y tratada con bifentrin.
El primer ensayo tuvo por objeto determinar la preferencia entre malla control y tratada,
ya que con frecuencia los piretroides producen efectos de repelencia e irritabilidad tanto
en plagas, como en organismos beneficiosos (Penman & Chapman, 1988; Rieth &
Levin, 1998; Liu & Stansly, 1995; Willes & Jepson, 1994; Takken, 2002; Provost et
al., 2003; Maund et al., 2011). Para la realización del ensayo se construyeron cinco
estructuras de metacrilato en forma de Y basadas en las propuestas por Chiel y
colaboradores (2006) con algunas modificaciones. Los tres extremos eran libres, de 25
cm de longitud el brazo principal, 11 cm de longitud los brazos laterales, 5 cm de
diámetro, y forrados con film de color negro para garantizar que la entrada de la luz
fuese únicamente cenital (Figura 32).
Figura 32. Tubos en Y empleados en los ensayos de preferencia.
Durante el montaje y realización de los ensayos, los tubos en Y se colocaron

verticalmente sobre una placa de cristal a modo de soporte (Figura 33). A continuación,
los extremos superiores de cada estructura se cubrieron con las mallas objeto de estudio.
En un extremo la malla control, y en el otro la malla tratada con bifentrin, ambas sujetas
por unos topes de metacrilato (Figura 34). En el interior de los tubos se introdujo como
atrayente alimenticio una porción de judía verde impregnada con huevos de E.
kuehniella (Figura 35). Y finalmente para evitar que los insectos se escapasen, ambos
extremos se cerraron con Parafilm® (Figura 36).
39
Figura 33. Placa de cristal a modo de base. Figura 34. Montaje tubo en Y.
Figura 35. Judías verdes impregnadas con Figura 36. Extremo tubo Y cerrado con
huevos de E. kuehniella a modo de atrayente parafilm.
alimenticio.
Tras el montaje de las cinco estructuras se trasladaron al insectario para la realización

del ensayo, disponiéndose en el mismo como se indica en la figura 37.
Figura 37. Disposición de los tubos en Y en el insectario (ensayo de preferencia en laboratorio).
C, Malla control; B, Malla tratada con bifentrín.
40
Una vez en el insectario, en cada uno de los tubos en Y se introdujeron 25 individuos

por un orificio de 0,5 mm situado en la base (Figura 38). Para el enemigo natural O.
laevigatus se liberaron adultos. Sin embargo, en el caso de N. tenuis se liberaron ninfas
N2, ya que la talla de los adultos (≈4 mm) era mayor al tamaño de poro de las mallas a
ensayar (1 X 1 mm), y por tanto eran incapaces de atravesarla.
Figura 38. Orificio (0,5 mm de diámetro) en la base del tubo en Y por el cual se introdujeron los insectos.
Basados en pruebas preliminares, a las 8 horas se evaluó el número de insectos que

alcanzaron el extremo del tubo en Y. Este tiempo asegura que al menos el 75 % de los
insectos introducidos son capaces de alcanzar el extremo del mismo, y que la mortalidad
sea inferior al 10 % (datos no mostrados).
Adicionalmente, para los insectos que alcanzaron el extremo del tubo en Y se evaluó la
mortalidad a corto plazo (72 horas). Para ello se recuperaron y agruparon en tantas
repeticiones como fue posible, de tal forma que hubiese 15 insectos por repetición y al
menos 4 repeticiones por malla a evaluar. Cada unidad de ensayo consistió en una caja
de plástico redonda (11,5 cm de diámetro x 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5
cm de diámetro) en la cual se suministró como alimento 0,4 gr de E. kuehniella y una
judía verde como fuente de líquido.
41
4.2.2.2. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin por contacto.
El segundo ensayo llevado a cabo en laboratorio, tuvo por objeto determinar la

toxicidad de la malla tratada por contacto bajo una forma más desfavorable de
exposición, en cajas de dimensiones reducidas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura.
En los ensayos se determinó la mortalidad (efecto letal) y los parámetros reproductivos
(efecto subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de al menos el 50 %.
Cada unidad experimental consistió en 15 adultos de O. laevigatus o N. tenuis

confinados en cajas de ensayo diseñadas por Jacas y Viñuela (1994). La parte superior e
inferior de las cajas consistieron en placas de cristal (12 X 12 X 0,5 cm) envueltas en
malla tratada con bifentrin o malla control. Ambas placas estuvieron conectadas entre sí
por medio de un aro de metacrilato (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), con un
orificio de 0,5 cm de diámetro, en el cual se colocó una aguja hipodérmica conectada a
un circuito de ventilación forzada durante todo el periodo de evaluación. En el interior
de las cajas se ofrecieron 0,4 gr de huevos de E. kuehniella como alimento y un trozo de
judía verde como fuente de líquido (Figura 39). Se hicieron cinco repeticiones por malla
a evaluar (75 insectos en total por cada malla evaluada), con un tiempo de exposición de
72 horas, que es la duración de exposición habitual en ensayos de contacto residual con
productos fitosanitarios en laboratorio.
Figura 39. Ensayo en laboratorio, unidad experimental Figura 40. Ensayo en laboratorio,
(10 cm de diámetro X 3 cm de altura), para ensayos de vista general del ensayo.
contacto residual.
42
Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo la lupa binocular y se

reagruparon en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm diámetro, 5 cm de
altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm diámetro, 3 cm de
altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) para evaluar sus parámetros
reproductivos del mismo modo al que se describe en el capítulo 5, punto 5.2.4.
4.2.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin en

invernadero.
Tras la realización de los ensayos de laboratorio, se evaluó la compatibilidad de adultos

de O. lavigatus y N. tenuis con el uso de mallas tratadas con bifentrin en un invernadero
experimental bajo condiciones de exposición más reales, en jaulas de 25 X 25 X 60 cm
de altura. Al igual que en el ensayo anterior, se evaluó la mortalidad (efecto letal) y
parámetros reproductivos (efecto subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de
al menos el 50 %.
La unidad experimental en la que se confinaron los insectos fue la diseñada por

González-Núñez y colaboradores (1998), con algunas modificaciones. La estructura de
60 cm de altura era de madera, al igual que la base (25 X 25 cm). El techo, y dos de los
laterales se cubrieron con visillo de color blanco, en uno de ellos además se dispuso de
una manga para facilitar la manipulación. En los dos laterales restantes, uno se cubrió
con una lámina de metacrilato para facilitar el seguimiento y observación del ensayo
(Figura 41). En el otro, se colocó la malla a evaluar, bien tratada con bifentrin o control
(Figura 42). En el interior de las cajas se ofrecieron huevos de E. kuehniella (0,8 gr/jaula)
como alimento (Figura 43), y como soporte vital, plantas de pimiento para O. laevigatus
o de tomate en el caso de N. tenuis.
Un total de 25 adultos de O. laevigatus o N. tenuis se introdujeron en cada una de las

cajas. Se emplearon cinco repeticiones por malla a evaluar (75 insectos en total por cada
malla evaluada) (Figura 44), con un tiempo de exposición de 72 horas con la finalidad de
comparar los resultados con aquellos obtenidos por contacto residual en el punto
4.2.2.2.
43
Figura 41. Ensayo en invernadero, jaula Figura 42. Ensayo en invernadero, jaula
de 25 X 25 X 60cm de altura, lateral de 25 X 25 X 60cm de altura, lateral
cubierto por una lámina de metacrilato cubierto por las mallas a evaluar, tratada
para la observación. con bifentrin o control.
Figura 43. Ensayo en invernadero, Figura 44. Ensayo en invernadero,

comederos (3,5 cm de diámetro) con huevos vista general del ensayo.
de E. kuehniella.
Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo lupa binocular y reagruparon
en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm diámetro, 5 cm de altura,
ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm diámetro, 3 cm de altura,
ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) para evaluar sus parámetros reproductivos
del mismo modo al que se describe en el capítulo 5, punto 5.2.4.
44
4.2.4. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin en

campo (túneles semi-comerciales).
Finalmente, se evaluaron los efectos de la malla tratada con bifentrin en condiciones

reales de cultivo, mediante ensayos de campo (túneles semi-comerciales), y sobre
diferentes especies de enemigos naturales comúnmente usados en control biológico de
pepino (Figura 45).
Figura 45. Enemigos naturales evaluados en los ensayos de campo (túneles semi-comerciales) en la
finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid). En negrita aparecen aquellas especies que
aparecieron de manera espontánea en el cultivo.
45
Para su evaluación se emplearon tres invernaderos tipo túnel (8 m de largo X 6,5 m de

ancho X 2,6 m de altura) siguiendo un diseño en parcelas subdivididas (“split-plot”)
con tres repeticiones (Figuras 46-47).
Figura 46. Montaje de los invernaderos tipo túnel.
Figura 47. Diseño y vista general del ensayo con tres invernaderos, cada uno de ellos lleva en su banda
lateral (4 m de largo X 2 m de altura) los dos tipos de mallas, control y tratada con bifentrin
46
Cada invernadero tipo túnel se dividió en dos parcelas experimentales (4 m de largo X

6,5 m de ancho) (Figura 48) separadas entre sí por una malla comercial de 10 X 20
hilos/cm y color blanco, suministrada por la empresa Criado y López S.L. (El Ejido,
España). En los laterales de cada parcela experimental (4 m de largo X 2 m de altura)
se colocó la malla tratada con bifentrin o la malla control (Figura 49), con el objeto
de simular su uso práctico en los laterales de los invernaderos comerciales, y el resto del
invernadero, techo y puertas, se cubrió con la malla comercial anteriormente citada.
Figura 48. Vista lateral de las dos parcelas Figura 49. Vista lateral de la parcela
experimentales correspondientes a un invernadero. experimental (26 m2).
En cada una de las parcelas experimentales se trasplantaron 42 plantas de pepino

distribuidas en 7 filas, con 6 plantas por fila separadas entre sí 0,6 m, marco de
plantación habitual en el cultivo (Maroto, 2002) (Figura 50).
47
Figura 50. Distribución de las plantas marcadas en cada parcela experimental del invernadero.
Una vez que el cultivo adquiría el estado fenológico de segunda-tercera hoja

verdadera del tallo principal desplegada (Meier, 1997), se procedía a la liberación de
la plaga. A continuación, y en función del establecimiento inicial de ésta, se procedía a
la liberación de los enemigos naturales.
En las tablas 8 y 9 se muestran las plagas y enemigos naturales estudiados, origen,

fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como su dosis y modo de
suelta en el ciclo de cultivo de otoño 2011.
48
Tabla 8. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus
dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011.
Fecha de introducción Fecha de primera

Insectos Origen en el cultivo aparición en el cultivo Modo de suelta/dosis
3 pulgones alados/planta marcada
Aphis gossypii Liberado 21 y 23 septiembre 28 septiembre (Figura 51) +
Liberado en el centro de cada una

de las parcelas experimentales
Bemisia tabaci Liberado 21 y 23 septiembre 28 septiembre mediante plataforma de liberación
(Figuras 52-53)/
9 adultos/m2 *
+ Modo de suelta y dosis empleada por Sal y colaboradores (2008). Los pulgones utilizados para infestar la parcela experimental
procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón. Además, se inocularon con 5 pulgones/planta
semanalmente en aquellas plantas marcadas con un nivel de infestación menor a 19 pulgones/planta, en base a la experiencia propia
adquirida en otros ensayos para garantizar un buen establecimiento de la plaga.
* Modo de suelta y dosis recomendada por Fernández (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la
parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.
Tabla 9. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo,
así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011.

5 octubre 19 octubre de las parcelas experimentales
Aphidius colemani Liberado 28 octubre 10 noviembre mediante plataforma de liberación
(Figura 52 y 54/10 adultos/m2 +
22 larvas L3/planta marcada
Adalia bipunctata Liberado 5 octubre Sin datos (Figura 55)/
28 octubre 10 larvas L3/m2 *
11 adultos/planta marcada/
Orius laevigatus Liberado 5 octubre 13 octubre 5 adultos/m2 &
1 sobre con 250 individuos/planta
Amblyseius swirskii Liberado 5 octubre 13 octubre marcada (Figura 56)/105
individuos/m2 #
+ Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. A. colemani fue suministrado por la empresa
Agrobío (APHIcontrol®, La Mojonera, España).
* Modo de suelta y dosis recomendada por el distribuidor, AGROBÍO (2013a). A. bipunctata fue suministrada por la empresa
Agrobío (ADALIAcontrol®, La Mojonera, España).
& Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La
Mojonera, España).
# Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). A. swirskii fue suministrado por la empresa Agrobío (SWIRScontrol®, La
Mojonera, España).
49
Figura 51. Inoculación de A. gossypii. Figura 52. Plataforma de liberación de adultos de

B. tabaci y A. colemani.
Figura 53. Liberación de adultos Figura 54. Liberación de adultos de A. colemani

de B. tabaci.
Figura 55. Larvas L3 de A. bipunctata Figura 56. Sobres de liberación de

tras su liberación. A. swirskii.
50
En cuanto a las plagas y enemigos naturales estudiados en el ciclo de primavera-

verano del 2012, se produjeron algunas modificaciones en base a los resultados
obtenidos en el anterior ciclo de cultivo. Se sustituyó al enemigo natural Adalia
bipunctata L. (Coleoptera: Coccinellidae) por Chrysoperla carnea (Stephens)
(Neuroptera: Chrysopidae), ya que no se estableció, ni se encontró en ninguno de los
muestreos realizados. Además, también se incluyeron en el estudio las plagas,
Aeolothrips sp. (Thysanoptera: Aeolothripidae), F. occidentalis y Tetranychus sp., y el
enemigo natural Orius majusculus (Reuter) (Hemiptera: Anthocoridae), todos ellos de
aparición espontánea en el cultivo.
En las tablas 10 y 11 se detallan las plagas y enemigos naturales estudiados, origen,

suelta.
dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.
Fecha
Insectos Origen de introducción Fecha de primera Modo de suelta/dosis
en el cultivo aparición en el cultivo
Aphis gossypii Liberado 1 junio 7 junio 3 pulgones alados/planta marcada +

Bemisia tabaci Liberado 1 junio 7 junio mediante plataforma de liberación/
9 adultos/m2 *
Aeolothrips sp. Exógeno ------------- 7 junio -------------
Frankliniella occidentalis Exógeno ------------- 7 junio -------------
Tetranychus sp. Exógeno ------------- 20 junio -------------
* Modo de suelta y dosis recomendada por Fernández (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la
parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.
51
así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.

Aphidius colemani Liberado 6 julio Sin datos mediante plataforma de liberación/
10 adultos/m2 +
Chrysoperla carnea Liberado 29 junio Sin datos 7 larvas L3/planta marcada/

6 julio 3 larvas L3/m2 *
Orius laevigatus Liberado 20 junio 27 junio 11 adultos/planta marcada/

5 adultos/m2 &
Orius majusculus Exógeno ------------- 13 junio -------------
Amblyseius swirskii Liberado 20 junio 27 junio 1 sobre con 250 individuos/planta

marcada /105 individuos/m2 #
Liberados sobre la superficie del
cultivo donde se detectaron los
Phytoseiulus persimilis Liberado 4 julio No muestreado focos de Tetranychus sp.
12 julio (Figura 57)/
20 individuos/m2 @
* Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. C. carnea fue suministrada por la empresa
Biobest (Chrysopa-System®, Vícar, España).
& Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La
Mojonera, España).
# Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). A. swirskii fue suministrado por la empresa Agrobío (SWIRScontrol®, La
Mojonera, España).
@ Modo de suelta y dosis recomendada por el distribuidor, AGROBÍO (2013b). P. persimilis fue suministrado por la empresa
Agrobío (PHYTOcontrol®, La Mojonera, España).
En el ensayo realizado en otoño del 2012 no se evaluaron aquellos enemigos naturales

que en ciclos anteriores no se pudieron cuantificar o no se establecieron de manera
adecuada en el cultivo de pepino, como fue el caso de los depredadores A. bipunctata,
C. carnea y A. swirskii. Además, y en base a la dificultad de establecimiento de B.
tabaci, se liberó F. occidentalis como presa principal del depredador O. laevigatus.
52
Finalmente, también se incluyó en el muestreo las plagas, Aeolothrips sp. y Aleyrodes

sp. (Hemiptera: Aleyrodidae), así como el enemigo natural O. majusculus, todos ellos
de aparición espontánea en el cultivo.
En las tablas 12 y 13 se detallan las plagas y enemigos naturales estudiados, origen,

suelta.
Fecha Fecha de primera

Insectos Origen de introducción aparición en el Modo de suelta/dosis
en el cultivo cultivo
Aphis gossypii Liberado 19 septiembre 28 septiembre 3 pulgones alados/planta marcada +

de las parcelas experimentales por
Bemisia tabaci Liberado 11 septiembre 19 septiembre medio de una planta de melón
infestada (Figura 58)
15 adultos/m2 *
Aleyrodes sp. Exógeno ------------- 25 septiembre ------------- (Figura 59)
Aeolothrips sp. Exógeno ------------- 25 septiembre -------------

de las parcelas experimentales por
Frankliniella occidentalis Liberado 11 septiembre 19 septiembre medio de una planta de melón
infestada (Figura 58)
8 adultos-ninfas/m2 &
* Modo de suelta y dosis recomendada por Morales (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la parcela
experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.
& Modo de suelta y dosis recomendada por Morales (comunicación personal). Los trips utilizados para infestar la parcela
experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.
53
Figura 57. Liberación de Figura 58. Liberación de adultos Figura 59. Adultos de
P. persimilis. de B. tabaci y adultos- Aleyrodes sp.
ninfas de F. occidentalis.

Aphidius colemani Liberado 2 octubre 17 octubre mediante plataforma de liberación/
10 adultos/m2+
11 adultos/planta marcada y
Orius laevigatus Liberado 2 octubre 11 octubre parcela experimental/
5 adultos/m2*
Orius majusculus Exógeno ------------- 25 septiembre -------------

* Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La
Mojonera, España).
54
En cuanto a la evaluación del ensayo, semanalmente se realizaron dos tipos de

muestreos:
-En el primero, se determinó que porcentaje de las 42 plantas por parcela experimental
estaban ocupadas por plagas o enemigos naturales. Para ello, se muestreó la totalidad de
la planta determinando su presencia o ausencia, sin cuantificar su densidad de
población.
-En el segundo, se determinó la densidad de plaga y enemigos naturales en 11 plantas

marcadas por parcela experimental (Figura 50). Para ello, se muestrearon 3 hojas por
planta marcada. El criterio de elección de las mismas fue al azar, pero teniendo en
cuenta la posición que tienden a ocupar las diferentes plagas en el cultivo (Tabla 14).
Tabla 14. Localización de plagas en el cultivo de pepino en función de las observaciones tomadas en
campo en los distintos ciclos de cultivo de otoño (2011 y 2012) y primavera-verano (2012).
Plaga Localización en el cultivo Observaciones

Poco móvil inicialmente,
soporta temperaturas
Tendencia a ocupar la parte más por debajo de 15 ºC.
Aphis gossypii baja del cultivo inicialmente. Su inoculación fue exitosa tanto
en los ciclos de otoño como de
primavera-verano.
Muy móvil, se establece en el
cultivo de manera adecuada a
temperaturas comprendidas
Aeolothrips sp. y Brotes tiernos, flores, parte entre los 25-30 ºC
Frankliniella occidentalis mitad-superior de la planta. (ciclo de primavera-verano),
por debajo de 15 ºC desaparece
paulatinamente del cultivo
(ciclo de otoño).
Bemisia tabaci y Brotes tiernos, parte mitad- No se establece en el cultivo de
Aleyrodes sp. superior de la planta. manera permanente.
Coloniza el cultivo con rapidez,
problemático cuando las
Tetranychus sp. Tendencia a ocupar la parte más temperaturas son superiores a
baja del cultivo inicialmente. 25 ºC (ciclo primavera-verano)
55
4.3. Resultados y discusión.
4.3.1. Laboratorio.
4.3.1.1. Evaluación de la preferencia entre malla control y tratada con bifentrin.
La repelencia se produce cuando un insecto detecta químicos a cierta distancia evitando

el área tratada sin entrar en contacto con la misma, mientras que la irritabilidad se
produce cuando un insecto se aleja de una superficie tratada tras entrar en contacto con
la misma (Mongkalangoon et al., 2009). Ambos efectos son con frecuencia producidos
por los piretroides tanto en plagas, como en organismos beneficiosos (Penman &
Chapman, 1988; Rieth & Levin, 1998; Liu & Stansly, 1995; Willes & Jepson, 1994;
Takken, 2002; Provost et al., 2003; Maund et al., 2011). Sin embargo, en nuestros
ensayos no se detectó ningún efecto de repelencia o irritabilidad, ya que tanto las ninfas
N2 de N. tenuis, como los adultos de O. laevigatus mostraron igual preferencia por la
malla control y la tratada con bifentrin (N. tenuis, +t=1,08; P=0,30 y *t=0,81; P=0,44; O.
laevigatus, +t=-0,42; P=0,68 y *t=-0,35, P=0,73) (Figura 60). Esta divergencia de
resultados con los descritos en la bibliografía, puede ser debida a que la malla tratada
tiene incorporado en sus fibras el insecticida haciéndolo menos detectable para el
insecto, que cuando se expone al mismo por contacto residual sobre sustrato inerte o
vegetal.
Figura 60. Porcentaje de ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus que alcanzaron el extremo de
los tubos en Y a las ocho horas de su liberación, cuando se sitúan en posición vertical. a. Valor referido al
número total de insectos introducidos en el tubo en Y. b. Valor referido al número total de insectos que
eligieron entre las dos mallas evaluadas.
a 100 b 100
80 80
*
+
a a
D ist r ib u c ió n ( % )
D istribució n (% )
60 60
a a
a a Malla control Malla control
a a Malla bifentrin Malla bifentrin
40 40
20 20
0 0
N. tenuis O. laevigatus N. tenuis O. laevigatus
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05). 56

Adicionalmente, en el caso de los insectos que alcanzaron el extremo del tubo en Y, se

evaluó la mortalidad a corto plazo (72 horas) (Figura 61). Ni para N. tenuis, ni O.
laevigatus hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambas mallas (t=-0,93;
P=0,38 y t=-1,44; P=0,19, respectivamente), siendo la mortalidad registrada a las 72
horas inferior al 10 %.
Figura 61. Mortalidad a las 72 horas en ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus tras atravesar
las mallas control y tratada con bifentrin en el ensayo de preferencia con tubos en Y.
100
80
Mortalidad 72 h (%)
60
Malla control
Malla bifentrin
40
20 a
a a
a
0
N. tenuis O. laevigatus
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).
Este resultado era esperable, ya que a pesar de que bifentrin actúa por contacto e
ingestión, y posee un elevado efecto de choque (Tomlin, 2009), el tiempo de exposición
de las ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus a la malla tratada con bifentrin
no fue prolongado. Únicamente entraron en contacto con la misma en el momento de
atravesarla atraídos por el cebo alimenticio, por lo que parece que la contaminación con
el plaguicida fue mínima.
57
4.3.1.2. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin por contacto.
En la figura 62 se muestran los datos de mortalidad en adultos de N. tenuis y O.

laevigatus, tras su exposición por contacto durante 72 horas a las mallas control y
tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura. Esta forma de
exposición produjo diferencias estadísticamente significativas entre ambas mallas (N.
tenuis, t=-43,22; P<0,05; O. laevigatus, t=35,88; P<0,05). En la malla control la
mortalidad no superó el 10 %, sin embargo, cuando ambos enemigos naturales se
expusieron a la malla tratada con bifentrin, la mortalidad registrada en N. tenuis fue del
84 %, y en el caso de O. laevigatus del 100 %. Debido a la alta mortalidad registrada
no se pudieron evaluar posibles efectos subletales.
Figura 62. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición por contacto a
las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura.
b
100
b
80
Mortalidad 72 h (%)
60
Malla control
Malla bifentrin
40
20 a
a
0
A diferencia del caso anterior, al incrementarse el tiempo de exposición a la malla

tratada con bifentrin, y los enemigos naturales estar confinados en una unidad
experimental de pequeñas dimensiones (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), sin
posibilidad de evitar el contacto con la misma, se produjo un aumento significativo de la
mortalidad en ambos chinches depredadores. Coincidiendo con nuestros resultados,
58
numerosos estudios describen como bifentrin es un insecticida poco selectivo dado su

amplio espectro de actividad, clasificando este producto como tóxico para una amplia
gama de organismos beneficiosos pertenecientes a distintos órdenes, Orius spp.
(Hemiptera: Anthocoridae), Macrolophus pygmaeus (Rambur) (Hemiptera: Miridae),
Podisus maculiventris Say (Hemiptera: Pentatomidae), Trichogramma chilonis Ishii
(Hymenoptera: Trichogrammatidae), Telenomus remus (Nixon) (Hymenoptera:
Scelionidae), Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), B. terrestris, Chrysoperla
rufilabris (Burmeister) (Neuroptera: Chrysopidae), Ceraeochyrsa cubana (Hagen)
(Neuroptera: Chrysopidae), y ácaros fitoseidos, como Phytoseiulus persimilis Athias-
Enriot (Acari: Phytoseiidae) y Amblyseius californicus (McGregor) (Acari:
Phytoseiidae), (Schuster & Stansly, 2000; Alzoubi & Cobanoglu, 2008; Albernaz et al.,
2009; Thomazoni et al., 2009; Besard et al., 2010; Carmo et al., 2010; Dai, et al., 2010;
Hussain et al., 2010; Biobest, 2013c; Koppert, 2013).
4.3.2. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin en

invernadero.
En la figura 63 se muestran las condiciones ambientales registradas durante la

realización del ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero.
Figura 63. Condiciones ambientales registradas en el ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin
en invernadero realizado en Mayo del 2012 sobre los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis.
Ensayo N. tenuis
30 100
T e m p er a tu r a m e d ia (ºC )
25 80
H R m e dia (% )
20 60
15 40
10
20
5
0
18-V 19-V 20-V 21-V
18-V 19-V 20-V 21-V
Días de ensayo
Días de ensayo
Ensayo O. laevigatus
30 100
Tem pe r a tura m e dia (ºC)
25 80
H R m edia (% )
20 60
15 40
10 20
5 0
25-V 26-V 27-V 28-V 25-V 26-V 27-V 28-V
Días de ensayo Días de ensayo
59
En las figuras 64-65 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de toxicidad de

malla tratada con bifentrin en invernadero, realizado con adultos de N. tenuis y O.
laevigatus en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura. No hubo diferencias estadísticamente
significativas de mortalidad entre las mallas control y tratada con bifentrin (N. tenuis,
t=-1,53; P=0,16 y O. laevigatus, t=-0,76; P=0,46), que fue del 14,15 %, y 22,10 % para
N. tenuis, y del 22,96 % y 33,02 % para O. laevigatus. (Figura 64).
Figura 64. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas
control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
100
80
Mortalidad 72 h (%)
60
Malla control
a Malla bifentrin
40
a a
20 a
0
En cuanto a la evaluación de posibles efectos subletales, no se observaron efectos

negativos en la descendencia de N. tenuis, situándose el número de ninfas por hembra y
día entorno a 4,5 para ambas mallas (t=-0,44; P=0,66) (Figura 65).
60
Figura 65. Descendencia evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de N. tenuis tras 72 horas de
exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
Descendencia
10
Nº ninfas/hembra/día
6 a
a
4
0
Malla control Malla bifentrin
En línea con estos resultados, tampoco los parámetros reproductivos de fecundidad y

fertilidad de O. laevigatus se vieron afectados, siendo el número de huevos por hembra
y día en la malla control y tratada con bifentrin de 3,61 y 2,66 respectivamente (t=1,30;
P=0,24), y la fertilidad en ambas mallas, entorno al 75 % (t=-0,36; P=0,72) (Figura 66).
Figura 66. Fecundidad y fertilidad evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de O. laevigatus tras
72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
Fecundidad Fertilidad
10 100
8 80
a a
N º huev o s/hem bra /día
% Huevos eclosados
6 60
4
a 40
a
2 20
0 0
Malla control Malla bifentrin Malla control Malla bifentrin
61
Por ello, la malla tratada con bifentrin fue selectiva para adultos de N. tenuis y O.
laevigatus en los ensayos realizados en invernadero. Para explicar la no susceptibilidad
de ambos chinches depredadores, se debe tener en cuenta que la exposición a la malla
tratada con bifentrin fue menor que en el caso de los ensayos llevados a cabo en
laboratorio por contacto, ya que al ser las cajas de ensayo de mayor tamaño (25 X 25 X
60 cm de altura), los enemigos naturales tienen una mayor movilidad, y la posibilidad
de evitar el contacto con la superficie tratada con bifentrin. Nuestros resultados
concuerdan con los descritos por Maund y colaboradores (2011), que en su revisión
sobre la ecotoxicología de piretroides sintéticos, indican que en general este tipo de
compuestos tienden a ser más selectivos cuando son evaluados en ensayos de semi-
campo y campo que en laboratorio.
62
4.3.3. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin en

campo (túneles semi-comerciales).
4.3.3.1. Otoño 2011.
En el ensayo de otoño del 2011 las condiciones ambientales y estado fenológico de las
plantas de pepino fueron iguales bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura
67).
Figura 67. Ensayo de campo. Condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el
ensayo de otoño del 2011.
1400 100
Radiación UV media ( mol/m*s)
PAR medio ( mol/m2 *s)
1200
2
80
1000
Control 60
800 Control
Bifentrin Bifentrin
600 Exterior Exterior
40
400
200 20
0
0
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
Días de muestreo Días de muestreo
100
25
Temperatura media (ºC)
20 80
HR media (%)
Control
15 Control 60 Bifentrin
Bifentrin
10 40
5
20
0
21-IX/28-IX
14-X/19-X
20-X/28-X
11-XI/18-XI
29-IX/5-X
6-X/13-X
29-X/3-XI
4-XI/10-XI
0
21-IX/28-IX
14-X/19-X
20-X/28-X
29-IX/5-X
6-X/13-X
11-XI/18-XI
29-X/3-XI
4-XI/10-XI
Intervalos de muestreo Intervalos de muestreo

Pluviometría acumulada (mm)
30
25
40
Estado fenológico medio
20
15 30
10 Control
20
Bifentrin
5
0 10
21-IX/28-IX
14-X/19-X
20-X/28-X
11-XI/18-XI
29-IX/5-X
6-X/13-X
29-X/3-XI
4-XI/10-XI
0
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
Intervalos de muestreo Días de muestreo
63
Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a O.
laevigatus, A. swirskii, Aphidius colemani Viereck (Hymenoptera: Braconidae) y A.
bipunctata. Sin embargo, los datos obtenidos no fueron concluyentes debido a que
ninguno de ellos se estableció de manera adecuada en el cultivo.
-Orius laevigatus y Amblyseius swirskii:

Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por estos enemigos naturales (42
plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, únicamente
se detectaron en el cultivo durante las tres semanas posteriores a su liberación (5-X)
(Figura 68 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por O. laevigatus osciló entre un 3-13
% en la malla control, y un 1-5 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 68 a,b). En el
caso de A. swirskii los porcentajes fueron ligeramente superiores, 8-25 % en la malla
control, y del 8-30 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 68 a,b). Cuando se
cuantificó la densidad media de ambos enemigos naturales en las plantas marcadas (11
plantas por parcela experimental), se vio que los niveles alcanzados fueron muy bajos
(<0,5 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas
(Figura 68 c) (O. laevigatus, W=23,5; P=0,26 y A. swirskii, W=31,5; 0,99). O. laevigatus
y A. swirskii no se establecieron por la escasez de presa presente en el cultivo.
Inicialmente B. tabaci estuvo presente en el mismo, con porcentajes que oscilaron entre
el 30-40 % en ambas mallas (Figura 68 a,b). Sin embargo, no se estableció probablemente
porque la temperatura media en el ensayo no fue superior a los 25 ºC (Figura 67), y esta
plaga necesita temperaturas más altas (próximas a los 30 ºC) para su desarrollo óptimo
(Malais & Ravensberg, 2006). Al cuantificar la densidad media de B. tabaci en las
plantas marcadas para determinar si su establecimiento se había visto influenciado por
la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo, los niveles alcanzados fueron
muy bajos (<0,3 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas
mallas (Figura 68 c) (B. tabaci, W=26; P=0,56).
64
Figura 68 a,b. Ciclo de otoño 2011, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada
con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci. c. Densidad media
de población en las plantas marcadas de O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci.
*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).
a Malla control b Malla bifentrin
100 100
P la n ta s o c u p a d a s (% )
P la n ta s o c u p a d a s (% )
80 80
60 B. tabaci 60 B. tabaci
O. laevigatus O. laevigatus
40 A. swirskii 40
A. swirskii
20 20
0 0
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
c 2
Nº medio individuos/planta marcada*
1,5
Malla control
1
Malla bifentrin
a a
0,5 a
a
a a
0
B. tabaci O. laevigatus A. swirskii
-Aphidius colemani:
Coincidiendo con lo descrito por Jacobson y Croft (1998) y Malais y Ravensberg
(2006), las primeras momias del parasitoide aparecieron a las dos semanas tras la
liberación de los adultos en el cultivo (5-X y 28-X) (Figura 69 a,b). Cuando se evaluó el
porcentaje de plantas ocupadas por momias de A. colemani (42 plantas por parcela
experimental), sin cuantificar su densidad de población, su presencia fue constante
desde su primera aparición (19-X) hasta la finalización del ensayo (18-XI) (Figura 69
a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por A. colemani osciló entre un 5-20 % en la
malla control, y un 8-30 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 69 a,b). Sin embargo,
cuando se cuantificó la densidad media del parasitoide en las plantas marcadas (11
plantas por parcela experimental), se observó que los niveles alcanzados fueron muy
bajos (<1 momia/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas
(Figura 69 c) (A. colemani, W=32,5; P=0,99). La razón de que creciera tan poco en el
65
cultivo no fue atribuida a la escasez de presa presente en el mismo, ya que el pulgón A.

gossypii se estableció de manera adecuada tanto en la malla control, como en la tratada
con bifentrin (Figura 69 a,b,c), sino a la posibilidad de que entre el depredador A.
bipunctata y el parasitoide A. colemani se hubiera producido una depredación
intragremial (Pell et al., 2008).
Figura 69 a,b. Ciclo de otoño, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con
bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii. c. Densidad media de
población en el cultivo del enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii.
a Malla control
b Malla bifentrín
100 100
P r la n t a s o c u p a d a s ( % )
P la n t a s o c u p a d a s ( % )
80 80
60 A. gossypii 60 A. gossypii
40 Momias A. 40 Momias A.
colemani colemani
20 20
0 0
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
50
c
a
*
Nº m edio individuos/planta m arcada
40
a
30
Malla control
Malla bifentrin
20
10
a a
0
A. gossypii A. colemani

66
-Adalia. bipunctata:
La interpretación de los resultados obtenidos con el depredador A. bipunctata es
complicada, ya que previamente a su liberación (5-X) se pudo observar como la
población de pulgón, que se había instalado correctamente en el cultivo en ambas
mallas, se incrementó significativamente en la malla control respecto la malla tratada
con bifentrin (t=-3,15, P<0,05) (Figura 70). Esta diferencia parece ser debida a la
presencia de hormigas en una de las parcelas experimentales correspondiente a la malla
control (Figura 71), ya que se ha visto que su presencia en colonias de pulgón facilita su
dispersión y protección frente a los enemigos naturales, favoreciendo su crecimiento a
niveles superiores de los que alcanzaría en su ausencia (Burgio et al., 1997).
Figura 71. Ciclo de otoño 2011, evolución de la población de A. gossypii en las mallas control y tratada
con bifentrin.
90
+
Nº medio A. gossypii / planta marcada
80
70
60
50
Malla
40 bifentrín
30 Malla control
20
10
0
28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI
Días de muestreo
* Representa diferencias estadísticamente significativas (P<0,05).

+ Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).
Figura 71. Hormigas en el cultivo.
67
Otro hecho que dificultó la interpretación de los resultados fue la imposibilidad de

determinar la presencia o densidad de población en el cultivo de A. bipunctata, ya que
una vez liberado no se encontró en ninguno de los muestreos realizados. Sin embargo,
tras sus dos liberaciones se observó un control a corto plazo de la población de A.
gossypii tanto en la malla control, como en la tratada con bifentrin (Figura 70). Después
de su primera liberación (5-X), la población de pulgón disminuyó entorno a un 50 % en
ambas mallas, no habiendo diferencias significativas entre ellas (W=430,5, P=0,13)
(Figura 70). Por otro lado, tras su segunda liberación (28-X), de nuevo se observó una
disminución de la población de pulgón en ambas mallas, pero esta vez se detectaron
diferencias estadísticamente significativas entre ellas (W=297,5, P<0,05), siendo un 30
% mayor la disminución en la malla control (Figura 70). Este resultado puede ser
atribuido a la interferencia que produjeron las hormigas en el ensayo, ya que tras un
periodo de descenso de temperaturas y lluvia (20-X al 28-X) (Figura 67), las hormigas
desaparecieron de la parcela experimental correspondiente a la malla control. De este
modo, en ausencia de protección y tras la segunda liberación de A. bipunctata en el
cultivo (28-X), la población de pulgón en dicha parcela experimental disminuyó
proporcionalmente en mayor número que en el resto de parcelas del ensayo, al tener A.
bipunctata una mayor cantidad de presa disponible.
68
4.3.3.2. Primavera-Verano 2012.
Al igual que en el ensayo de otoño del 2011, en el ciclo de primavera-verano 2012 las
condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino fueron iguales
bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura 72).
Figura 72. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el
ensayo de primavera-verano del 2012.
1800 160
Radiación UV media ( mol/m*s)

1600 140
2
PAR medio ( mol/m*s)
1400 120
2
1200
100
Control Control
1000
Bifentrin 80 Bifentrin
800
Exterior Exterior
60
600
400 40
200 20
0 0
7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII 7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII
Días de muestreo Días de mue stre o
35 100
30
80
25
HR media (%)
20 60
Control Control
15 Bifentrin Bifentrin
40
10
5 20
0
14-VI/20-VI
21-VI/27-VI
13-VII/17-VII
8-VI/13-VI
28-VI/4-VII
5-VII/12-VII
1-VI/7-VI
0
14-VI/20-VI
21-VI/27-VI
13-VII/17-VII
8-VI/13-VI
28-VI/4-VII
5-VII/12-VII
1-VI/7-VI
100
Estado fenológ ico m edio
80
60
Control
40 Bifentrin
20
0
7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII
Días de muestreo
69
Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a los
enemigos naturales liberados, O. laevigatus y A. swirskii, ni al enemigo natural que
colonizó de manera espontánea el cultivo, O. majusculus. Sin embargo, en el caso de los
enemigos naturales C. carnea y A. colemani los datos obtenidos no fueron concluyentes
debido a que ninguno de ellos se estableció de manera adecuada en el cultivo.
-Chrysoperla carnea:
No se pudo determinar su presencia o densidad de población en el cultivo, ya que una
vez liberado no se encontró en los muestreos realizados. Además, tampoco se observó
ningún efecto en la población de pulgón tras su liberación (datos no mostrados). Este
hecho podría ser debido a que las larvas de este depredador ven limitada su locomoción
por la pilosidad de la hoja de pepino, dificultando su capacidad de depredación y en
consecuencia su establecimiento (Burgio et al., 1997).
-Aphidius colemani:
No se dispuso del tiempo suficiente (al menos dos semanas tras su primera liberación,
6-VII) para que apareciesen las primeras momias de pulgón en el cultivo, ya que el
ensayo fue interrumpido prematuramente (17-VII) al ser colonizado en su totalidad por
un ataque de araña roja, Tetranychus sp. (Figuras 73-74).
Figura 73. Detalle de ataque por araña roja. Figura 74. Vista general del ataque de araña roja.
Para controlar a este ácaro fitófago se realizaron dos sueltas del ácaro depredador P.
persimilis (4-VII y 12-VII), que fueron insuficientes debido a la rapidez de crecimiento
de la araña roja, que hubiera requerido para su control la aplicación de un acaricida, lo
cual se descartó para no interferir en el crecimiento de las poblaciones de enemigos
naturales presentes.
70
Como se indica en la figura 75, la malla tratada con bifentrin no dificultó la entrada o
establecimiento de Tetranychus sp., siendo el porcentaje de plantas atacadas en el
cultivo estadísticamente idéntico en ambas mallas, (4-VII, ataque Tetranychus sp. <50 %, t=-
0,63, P=0,56, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=0,41, P=0,69, planta muerta, t=1,26, P=0,27; 12-VII,
ataque Tetranychus sp. <50 %, t=1,29, P=0,26, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=0,89, P=0,42, planta
muerta, t=-1,68, P=0,16; 17-VII, ataque Tetranychus sp. <50 %, sin datos, en la malla control ninguna
planta poseía un ataque de Tetranychus sp. inferior al 50 %, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=-0,8,
P=0,46, planta muerta, t=0,31, P=0,77). La falta de susceptibilidad de Tetranychus sp. a la
malla tratada con bifentrin puede ser atribuida a que no entrase en contacto directo con
la misma, debido a que el tamaño de poro de la malla (1 X 1 mm) no es el más
adecuado para evitar la entrada de este ácaro fitófago, cuyas dimensiones del adulto
(hembra) son 400-500 m (Zhang, 2003).
Figura 75. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas atacadas por Tetranychus
sp. en las mallas control y tratada con bifentrin.
100 100
P la n tas a ta ca d a s (% )
P la n ta s a taca d a s (% )
80 80
Ataque Tetranychus Ataque Tetranychus
60 60
sp. < 50 % planta sp. < 50 % planta
Ataque Tetranychus Ataque Tetranychus
40 40
sp. > 50 % planta sp. > 50 % planta
Planta muerta Planta muerta
20 20
0 0
4-VII 12-VII 17-VII 4-VII 12-VII 17-VII
-Orius laevigatus, Orius majusculus y Amblyseius swirskii:

El principal motivo para que se produjese el adecuado establecimiento de O. laevigatus,
O. majusculus, y en menor medida, A. swirskii, estuvo relacionado con la colonización
del cultivo de manera espontánea por los trips Aeolothrips sp. y F. occidentalis. Ambos
sustituyeron como presa alternativa a B. tabaci, la cual de nuevo no se estableció en el
ensayo (datos no mostrados). Como puede observarse en la figura 76, la malla tratada
con bifentrin no supuso un impedimento para la entrada o establecimiento de los trips
en el cultivo, no produciéndose diferencias estadísticamente significativas con respecto
a la malla control (13-VI, W=648, P=0,18; 20-VI, W=652, P=0,17; 27-VI, W=471,
P=0,34; 4-VII, W=505,5, P=0,62; 12-VII, 509,5, P=0,47). No existen datos en la
71
literatura de la actividad insecticida de mallas tratadas con piretroides en trips, aunque

es un hecho conocido que los piretroides tienen un amplio espectro de actividad, y son
utilizados para el control de tisanópteros, por lo que un control era esperable (De Liñán,
2003). Sin embargo, la falta de susceptibilidad de Aeolothrips sp. y F. occidentalis a la
malla tratada con bifentrin puede ser atribuida a que no entrase en contacto directo con
la misma, debido a que su densidad de hilos (10 X 10 hilos/cm) no es el más adecuado
para evitar su entrada, necesitando de mallas más densas para su control (10 X 14 a 26
X 26 hilos/cm) (Lacasa & Llorens, 1998a).
Por otro lado, la población de trips disminuyó progresivamente tras la liberación de los
enemigos naturales O. laevigatus y A. swirskii (20-VI), y la aparición espontánea de O.
majusculus (13-VI) en ambas mallas.
Figura 76. Ciclo de primavera-verano 2012, evolución de la población de Aeolothrips sp. y F.

occidentalis (trips) en las mallas control y tratada con bifentrin.
Nº medio trips /planta marcada *
35
30
25
Malla
20 bifentrin
15 Malla
control
10
5
0
13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII
Días de muestreo
Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por estos enemigos naturales (42
plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, el control de
la población de trips parece ser debido principalmente a la sinergia formada por O.
laevigatus y O. majusculus (Orius spp.), y no a la acción de A. swirskii. En el transcurso
del ensayo se observa un incremento del porcentaje de plantas ocupadas por Orius spp.
(malla control, de un 1 a un 33 %; malla tratada con bifentrin de un 6 a un 44 %), en
72
detrimento de la población de trips en ambas mallas (malla control, de un 92 a un 9 %;

malla tratada con bifentrin de un 94 a un 12 %), mientras que A. swirskii únicamente
estuvo presente en el cultivo durante las dos semanas posteriores a su liberación (el
porcentaje de plantas ocupadas fue <20 % en ambas mallas) (Figura 77).
Figura 77. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas
control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales Orius spp. y A. swirskii y sus presas,
Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips).
100 100
Plantas ocupadas (%)
80 Plantas ocupadas (%) 80
60 Trips 60 Trips
Orius spp. Orius spp.
40 A. swirskii 40 A. swirskii
20 20
0 0
20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII
En la figura 78 se muestra la densidad media de Orius spp. en las plantas marcadas (11
plantas por parcela experimental). Coincidiendo con los resultados descritos en los
ensayos de preferencia en laboratorio (tubos en Y), y los realizados en invernadero en
jaulas (25 X 25 X 60 cm de altura), se observa como tampoco O. laevigatus y O.
majusculus resultaron afectados por la malla tratada con bifentrin, no produciéndose
diferencias estadísticamente significativas con respecto a la malla control (27-VI,
W=522, P=0,71; 4-VII, W=550,5, P=0,91; 12-VII, W=424,5; P=0,06).
73
Figura 78. Ciclo de primavera-verano del 2012, evolución de la población de Orius spp. en las mallas
control y tratada con bifentrin.
N º m e d io O riu s sp p . /p la n ta m a r c a d a *
1,5
Malla bifentrin
1
Malla control
0,5
0
13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII
Días de muestreo
74
4.3.3.3. Otoño 2012.
Como se vio en ciclos de cultivo anteriores, en el ciclo de otoño del 2012 las
condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino fueron iguales
bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura 79).
1400
R a dia ció n U V m e dia ( m o l/m2 * s)

1200 80
PAR medio ( mol/m *s)
1000
2
60
800 Control Control
Bifentrin Bifentrin
600 Exterior
40
Exterior
400
20
200
0 0
25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X
Días de muestreo
Días de muestreo
25
100
20
80
HR media (%)
15 60
Control Control
10 Bifentrin 40 Bifentrin
5 20
0 0
19-IX/25-IX
12-X/17-X
18-X/24-X
25-X/31-X
26-IX/2-X
3-X/11-X
19-IX/25-IX
12-X/17-X
18-X/24-X
25-X/31-X
26-IX/2-X
3-X/11-X
45 80
Pluviometría acumulada (mm)
40
Esta do feno ló gico m e dio
35
60
30
25 Control
40
20 Bifentrin
15
20
10
5
0 0
19-IX/25-IX 26-IX/2-X 3-X/11-X 12-X/17-X 18-X/24-X 25-X/31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X
Intervalos de muestreo Días de muestreo
75
Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a los
enemigos naturales liberados, O. laevigatus y A. colemani, ni al enemigo natural que
colonizó de manera espontánea el cultivo, O. majusculus. Sin embargo, los datos
obtenidos no fueron concluyentes, ya que los chinches depredadores no se establecieron
en el cultivo, y en el caso de A. colemani la no homogeneidad en el crecimiento de la
población de su presa, A. gossypii, dificultó la interpretación de los resultados.
-Orius laevigatus y Orius majusculus:

Cuando se evaluó que porcentaje de plantas ocupadas por los enemigos naturales (42
plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, la presencia
del conglomerado de especies formado por O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.)
fue constante desde su primera aparición (25-IX) hasta la finalización del ensayo (31-X)
(Figura 80 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por Orius spp. osciló entre un 2-11 %
en la malla control, y un 1-13 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 80 a,b). Cuando
se cuantificó la densidad media de ambos enemigos naturales en las plantas marcadas
(11 plantas por parcela experimental), se vio que los niveles alcanzados fueron muy
bajos (<0,15 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas
mallas (Figura 80 c) (Orius spp., t=-0,41; P=0,68). El principal motivo de que no se
establecieran fue de nuevo atribuido a la escasez de presa presente en el cultivo.
Inicialmente las moscas blancas B. tabaci y Aleyrodes sp., así como los trips
Aeolothrips sp. y F. occidentalis estuvieron presentes en el mismo en ambas mallas
(Figura 80 a,b), pero tras un descenso brusco de la temperatura media la segunda semana
de ensayo (26-IX al 2-X) (15 ºC) (Figura 79), ambas poblaciones desaparecieron
paulatinamente del cultivo. Al cuantificar la densidad media de B. tabaci, Aleyrodes sp.
y trips en las plantas marcadas para determinar si su establecimiento se había visto
influenciado por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo, los niveles
alcanzados fueron muy bajos en todos ellos (<1 individuos/planta marcada), y
significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 80 c) (B. tabaci, t=-0,16; P=0,87;
Aleyrodes sp., W=11; P=0,83; trips, W=19; P=0,93).
76
con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B.
tabaci, Aleyrodes sp., Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips). c. Densidad media de población en las
plantas marcadas de O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp.,
a Malla control
b Malla bifentrin
100 100
Presencia en el cultivo (%)
80 80
Plantas ocupadas(%)
B. tabaci
B. tabaci
60 60 Aleyrodes sp.
Aleyrodes sp.
Trips
40 Trips 40
Orius spp. Orius spp.

20 20
0 0
25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X
c 2
*
Nº medio individuos/planta marcada
1,5
a a a Malla control
1 a
Malla bifentrin
a a
0,5
a a
0
B. tabaci Aleyrodes sp. Trips Orius spp.

-Aphidius colemani:
Al igual que en el ciclo de otoño del 2011, las primeras momias del parasitoide
aparecieron a las dos semanas tras la liberación de los adultos en el cultivo (2-X) (Figura
81 a,b). Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por momias de A. colemani
(42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, su
presencia fue constante desde su primera aparición (17-X) hasta la finalización del
ensayo (31-X) (Figura 81 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por A. colemani osciló
entre un 36-48 % en la malla control, y un 52-64 % en la malla tratada con bifentrin
(Figura 81 a,b). Al cuantificar la densidad poblacional media durante el ensayo en las
plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental), los valores mostraron un
77
adecuado establecimiento del parasitoide en el cultivo (Figura 81 c), no habiendo

diferencias estadísticamente significativas entre malla la control y la tratada con
bifentrin (t=-1,3, P=0,26) (Figura 81 c).
con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa A. gossypii. c. Densidad media de
población en las plantas marcadas de A. colemani (momias) y su presa A. gossypii.
Malla control
a b Malla bifentrín
P r e s e n c ia e n e l c ultiv o (% )
100 100
P resencia en el cultivo (% )
80 80
60 A. gossypii 60 A. gossypii
40 Momias A. colemani 40 Momias A. colemani
20 20
0 0
25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X
c 180 a
Nº medio individuos / planta
160
140
120
*
marcada
100 Malla control

a
80 Malla bifentrin
60 a
40 a
20
0
A. gossypii A. colemani
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0.05).

En este ciclo de cultivo el crecimiento de la población de A. gossypii no fue homogéneo

entre los tratamientos evaluados, lo que dificultó el análisis de los datos (Tabla 15). En el
muestreo previo a la liberación de A. colemani (2-X), el establecimiento de A. gossypii
fue significativamente superior en la malla tratada con bifentrin que en la malla control
(W=374; P<0,05); en la tercera semana de muestreo (11-X) las poblaciones tendieron a
igualarse, y coincidiendo con la primera aparición de momias de A. colemani en el
cultivo (17-X), el número de A. gossypii por planta marcada fue significativamente
superior en la malla tratada con bifentrin (t=3,07; P<0,05) (Tabla 15).
78
Tabla 15. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii en la malla control y tratada
con bifentrin.
*
A. gossypii/planta marcada
Días de
muestreo Malla control Malla bifentrin t W P
25-IX 15,69 ± 2,52 a 26,60 ± 9,02 a ----- 486 0,45

2-X 30,81 ± 5.62 a 59,63 ± 10,75 b ----- 374 <0,05
11-X 83,33 ± 790 a 92,36 ± 13,91 a 0,56 ----- 0,57
17-X 83,42 ± 10,32 a 134,33 ± 12,95 b 3,07 ----- <0,05
24-X 93,18 ± 12,78 a 226,69 ± 26,50 b ----- 276,5 <0,05
31-X 80,46 ± 15,15 a 249 ± 30,49 b ----- 229 <0,05

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05).
Este mayor crecimiento del pulgón bajo la malla tratada no se debe a un efecto negativo
de ésta sobre el parasitoide A. colemani, ya que al analizar el ratio de momias de A.
colemani/A. gossypii en el cultivo, fue significativamente igual de bajo en la malla
control y la tratada con bifentrin (Tabla 16).
Tabla 16. Ciclo de otoño del 2012, ratio momias A. colemani/A. gossypii en la malla control y tratada con
bifentrin.
Ratio
momias A. colemani/A. gossypii
Días de
muestreo Malla control Malla bifentrin t W P
17-X 0,36 ± 0,08 a 0,30 ± 0,06 a ----- 506,5 0,63

24-X 0,90 ± 0,23 a 0,65 ± 0,20 a ----- 423 0,12
31-X 0,93 ± 0,47 a 0,98 ± 0,65 a ----- 337,5 0,94
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05).
Por otro lado, si se analiza a nivel individual la evolución de la población de A. gossypii

en cada una de las repeticiones, se puede observar una alta variabilidad incluso entre
módulos pertenecientes al mismo tratamiento (Tabla 17). Además, al calcular los ratios
de momias de A. colemani/A. gossypii en cada uno de los módulos, los valores más
bajos se registraron en aquellas repeticiones con mayor número de A. gossypii (Tabla 17).
79
Tabla 17. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii y ratio de momias A.
colemani/A. gossypii por repetición (módulo) en la malla control y tratada con bifentrin.
*
A. gossypii/planta marcada
Días
de
muestreo Malla control
Malla bifentrin
Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3
17-X 100,64 ± 23,97 69,73 ± 15,64 79,91 ± 12,46 143,45 ± 21,65 96 ± 16,04 163,55 ± 25,37
24-X 130,27 ± 27,67 64,36± 19,77 84,91 ±13,55 271,45 ± 43,78 80,45 ± 27,97 328,18 ±25,98
31-X 159,18 ± 27,99 34,91 ± 14,76 40 ± 11,70 321,09 ± 37,53 50,55 ± 18 378,36 ± 22,97
Ratio momias A. colemani/A. gossypii
Días
de
muestreo Malla control
Malla bifentrin
Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3
17-X 0,35 ± 0,18 0,43 ± 0,17 0,32 ± 0,06 0,18 ± 0,06 0,59 ± 0,14 0,14 ± 0,02
24-X 0,33 ± 0,09 1,66 ± 0,60 0,74 ± 0,30 0,20 ± 0,06 1,57 ± 0,51 0,19 ± 0,03
31-X 0,10 ± 0,03 2,13 ± 1,33 0,54 ± 0,17 0,16 ± 0,07 2,74 ± 1,89 0,07 ± 0,01
. *Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).
Es un hecho conocido que la influencia del comportamiento de los parasitoides en la

dinámica de poblaciones y de la sus presas, posee su mejor ejemplo en la respuesta
funcional (Fernández-Arhex & Corley, 2004), definida como la relación entre el número
de presas consumidas por un depredador en función de la densidad de presa, en un
espacio e intervalo de tiempo fijos (Solomon, 1949). A. colemani posee una respuesta
funcional tipo II (Zamani et al., 2006), es decir, su tasa de consumo aumenta con la
densidad de presa, pero disminuye la velocidad de aumento hasta alcanzar una
plataforma en la cual la tasa de consumo permanece constante, independientemente de
la densidad de presa disponible (Fernández-Arhex & Corley, 2004). Por lo que los
resultados obtenidos podrían ser debidos a que A. colemani alcanzó su tasa máxima de
consumo de pulgón, a partir de la cual es constante en aquellos módulos en los que la
densidad de A. gossypii fue muy elevada, módulo1 (malla control) y módulos 1 y 3
(malla tratada con bifentrin) (Tabla 17), y no a un efecto de la malla objeto de estudio.
80
Capítulo 5
Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas
5. TOXICIDAD DE MODERNOS INSECTICIDAS SOBRE

LOS ENEMIGOS NATURALES ORIUS LAEVIGATUS Y
NESIDIOCORIS TENUIS 1.
5.1. Introducción.
El principal problema de compatibilización del control biológico surge al utilizarlo de

manera conjunta con el control químico, pues a pesar de que actualmente su uso es más
racional, aún existen insecticidas autorizados en los cultivos que pueden ser no
selectivos para una cierta especie de enemigo natural (Medina et al., 2008). Por tanto,
un paso previo esencial para su uso conjunto es estudiar el efecto que los plaguicidas
producen en los agentes de biocontrol.
Según Croft (1990) las principales vías por las cuales los enemigos naturales se exponen
a los plaguicidas son: contacto directo, en el momento de la aplicación los organismos
beneficiosos entran en contacto con el compuesto o inhalan sus vapores. Contacto
residual, el enemigo natural entra en contacto con el plaguicida tras su aplicación en el
medio. Ingestión, los agentes de biocontrol se contaminan a través del consumo de
presa o planta huésped que ha entrado en contacto con el plaguicida (Figura 82).
Figura 82. Principales formas de exposición de los enemigos naturales a los plaguicidas.
1
FERNÁNDEZ, Mª. M., AMOR, F., BENGOCHEA, P., VELÁZQUEZ, E., MEDINA, P., FERERES, A.
& VIÑUELA, E. 2012. Effects of the insecticides methoxyfenozide and abamectin to adults of the natural
enemies Eretmocerus mundus (Mercet) (Hymenoptera: Aphelinidae), Orius laevigatus (Fieber)
(Hemiptera: Anthocoridae) and Nesidiocoris tenuis Reuter (Hemiptera: Miridae) under laboratory
conditions. IOBC/wprs Bulletin, 82, 1-7.
Effects of pesticides commonly used on horticultural crops on the predatory bugs Orius laevigatus
(Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) and Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae). En redacción.
81
El modo más común por el cual los enemigos naturales se exponen a los plaguicidas es
por contacto residual (Croft, 1990). Sin embargo, no siempre es la forma de exposición
más adecuada para evaluar el efecto de un plaguicida, ya que también dependerá de su
modo de acción, pudiendo ser interesante analizar otras formas de exposición
(ingestión, aplicación tópica o contaminación de la cadena trófica) para tener una visión
más completa de su efecto (Candolfi, et al., 2000; Medina et al., 2008).
La OILB, a través del grupo de trabajo “Plaguicidas y Organismos Beneficiosos”, tiene

como uno de sus objetivos identificar los productos fitosanitarios que respeten a los
enemigos naturales y puedan ser usados en programas de GIP (IOBC, 2013). La
selección de plaguicidas se realiza en base a un esquema secuencial que asume que
aquellos que son inocuos en laboratorio, serán seguros en semi-campo y campo, no
necesitando de otros estudios. Si por el contrario no lo son, se pasa al siguiente nivel de
evaluación (Van de Veire et al., 2002a) (Figura 83).
Figura 83. Secuencia de pruebas para la evaluación de los efectos secundarios en organismos
beneficiosos.
Inocuo Inocuo Inocuo

Ensayos de laboratorio
(Estadio más susceptible, estadio
menos susceptible) Ensayos Ensayos
Semi-campo Campo
Ensayos de laboratorio
extendido
Tóxico Tóxico Tóxico
Otros ensayos: Persistencia
Según Hassan (1994), Sterk y colaboradores (1999) y Van de Veire y colaboradores

(2002a), en una primera fase se desarrollan ensayos de laboratorio en condiciones
controladas que tienen por objetivo estudiar la toxicidad del residuo fresco del
insecticida sobre placas de cristal en (a) los estados de desarrollo más susceptibles, y
(b) menos susceptibles del enemigo natural. Los estados de desarrollo más
susceptibles corresponden a adultos en parasitoides, estadios juveniles en ácaros, y
82
larvas o ninfas en el caso de insectos depredadores por su mayor movilidad. Por otro
lado, los estados de desarrollo considerados menos susceptibles son parasitoides en el
interior de su huésped, o en el caso de ácaros e insectos depredadores, los adultos,
aunque en este apartado también se podría considerar el estado de desarrollo de huevo y
pupa (Medina, et al., 2003a). Adicionalmente, también pueden llevarse a cabo (c)
ensayos de laboratorio extendido, que tienen por objeto el estudio de la toxicidad del
residuo fresco del insecticida sobre material vegetal.
Siguiendo el esquema secuencial propuesto por la OILB, y si el producto insecticida

presenta toxicidad para el enemigo natural en estudio tras los ensayos de laboratorio. El
siguiente paso será la realización de (d) ensayos de semi-campo, sobre plantas en
invernadero o al aire libre a pequeña escala. De seguir siendo nocivo el plaguicida, se
empezarían a desarrollar los (e) ensayos de campo, los cuales corresponden a las
condiciones reales de cultivo.
Los parámetros a evaluar en estos ensayos son los efectos directos a corto plazo,
mortalidad, cambios en la población del enemigo natural y posibles efectos a largo
plazo o efectos subletales, que son fundamentalmente en el caso de parasitoides el
parasitismo, y en el de depredadores, parámetros reproductivos (fecundidad, fertilidad o
descendencia) (Medina et al., 2008). Además, también se pueden considerar en el
estudio otro tipo de efectos subletales, como los producidos a nivel fisiológico
(longevidad, desarrollo, proporción sexual, inmunología) o aquellos que afectan a su
comportamiento (movilidad, orientación, comportamiento alimenticio de puesta y
aprendizaje) (Desneux et al., 2007), o incluso los efectos a nivel de poblaciones,
comunidades y ecosistemas, aún más difíciles de determinar (Köhler & Triebskorn,
2013). En base al efecto total que produzcan en los enemigos naturales, los plaguicidas
se clasifican básicamente en cuatro categorías: 1-2-3-4 (1 inocuo, 2 ligeramente tóxico,
3 moderadamente tóxico y 4 tóxico) (Hassan, 1994).
Los plaguicidas pueden proporcionar selectividad fisiológica y/o ecológica (Croft,

1990), por lo que otro tipo de estudio para identificar los plaguicidas no persistentes, (f)
es la duración del efecto nocivo de los insecticidas o persistencia. Para ello, los
compuestos son aplicados sobre material vegetal, que puede ser mantenido al aire libre
bajo una cubierta que le proteja de la lluvia, pero que permita una exposición directa
83
con la luz solar simulando las condiciones de degradación del insecticida en campo o en
invernadero. En este caso, la toxicidad de los residuos del plaguicida es evaluada a
diferentes intervalos de tiempo hasta la perdida de su toxicidad (categoría 1 OILB para
laboratorio extendido), clasificándose en cuatro categorías según el tiempo que tarda en
alcanzarse: A-B-C-D (A=poco persistente, <5 días, B=ligeramente persistente, 5-15
días, C=moderadamente persistente, 16-30 días, D=persistente >30 días).
5.1.1. Insecticidas evaluados.
Los productos fitosanitarios descritos a continuación se seleccionaron por representar a

un grupo de modernos plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos
para los enemigos naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados,
organofosforados y carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde los
enemigos naturales evaluados están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso
de inclusión en la lista comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, anexo I de la
Directiva 91/414/CEE (MAGRAMA 2013a).
5.1.1.1. Abamectina.
La avermectina B1, comúnmente conocida como abamectina, fue desarrollada por Merc
Sharp & Dohme Agvet (actualmente Syngenta Crop Protection) en 1985 (Mei, et al.,
2011).
Las avermectinas son un grupo de 16 lactonas macrocíclicas producidas durante la

fermentación del microorganismo del suelo Streptomyces avermitilis Kim &
Goodfellow (Bacteria: Streptomycetaceae) (Ikeda et al., 2003). Burg y colaboradores
(1979) describieron las características de su cultivo, estructura, así como las
características y propiedades físicas de las avermectinas producidas durante el proceso
de fermentación, el cual da lugar a cuatro pares homólogos de moléculas altamente
relacionadas entre sí, entre las que se encuentra la avermectina B1 o abamectina.
De acuerdo con la clasificación de los modos de acción de insecticidas/acaricidas del

IRAC (Insecticide Resistance Action Committee) (2013), pertenece al grupo 6:
activador del canal del cloro. Las avermectinas se unen a los receptores del
84
neurotransmisor ácido gamma-aminobutírico (GABA) en las células nerviosas

inhibidoras, creando una corriente de iones cloro constante hacia el interior de las
células del músculo, que se traduce en una supresión continua de la contracción
muscular, poniéndose de manifiesto con síntomas de parálisis (Clark et al., 1994).
En cuanto a su rango de acción, abamectina es un producto utilizado como acaricida,

nematicida e insecticida (Tomlin, 2009). Como insecticida controla distintas especies de
insectos pertenecientes a diferentes órdenes: lepidoptera, coleoptera, homoptera y
diptera (Mei, et al., 2011). Actúa por ingestión y contacto, presentando movimiento
translaminar (Tomlin, 2009).
En España está autorizado el uso de Vertimec 1,8 % EC (Syngenta Agro S.A.) en una
amplia variedad de cultivos, siendo utilizado principalmente contra ácaros y minadores
de hoja (Liriomyza spp. (Diptera: Agromyzidae) (MAGRAMA, 2013b).
5.1.1.2. Deltametrina.
Los piretroides son el mayor grupo de insecticidas neurotóxicos. Su origen insecticida

viene dado por el extracto natural piretro, derivado de las flores del género
Chrysanthemum (Asteraceae). Los primeros piretroides sintéticos fotoestables, con alta
capacidad insecticida, baja toxicidad a mamíferos, y limitada persistencia en el suelo, se
desarrollaron entre 1968-1974 por Michael Elliot y colaboradores en los laboratorios
Rothamsted (Reino Unido). El primero de estos compuestos fue la permetrina, seguido
a continuación por la cipermetrina y la deltametrina (Davies et al., 2007).
De acuerdo con la clasificación del IRAC (2013), deltametrina pertenece al grupo 3:

moduladores del canal de sodio. Afecta al sistema nervioso, produciendo una apertura
permanente de los canales de sodio que causan hiperexcitación, y en algunos casos
bloqueo nervioso (Casida & Durkin, 2013).
Se trata de un producto con amplio espectro de actividad, por lo que se utiliza para
controlar plagas de diferentes órdenes: coleoptera, lepidoptera, tisanoptera, homoptera,
ortoptera, díptera, etc. Actúa por contacto e ingestión, tiene un elevado efecto de choque
(Tomlin, 2009), y cierta actividad repelente (De Liñán, 2003). En nuestro estudio fue
85
empleado como control positivo para asegurar que bajo las condiciones de nuestros
ensayos los dos enemigos naturales resultarían afectados.
En España el uso de la formulación utilizada en este estudio Decis 2,5 % EC (Bayer

Crop Science S.L.), estaba autorizada en un elevado número de cultivos (De Liñán,
2010), y fue sustituida en 2011 por una nueva formulación, Decis Protech 1,5 % EW
(Bayer Crop Science S.L.) (De Liñán, 2011).
5.1.1.3. Emamectina.
El benzoato de emamectina (denominado comúnmente como emamectina) es un

derivado de la avermectina B1 o abamectina, anteriormente descrita. Fue descubierto en
evaluaciones de selección in vivo (“screening”) en Helicoverpa virescens (Fabricius)
(Lepidoptera: Noctuidae) y Spodoptera eridiana (Cramer) (Lepidoptera: Noctuidae)
entre varios cientos de derivados de avermectinas (Jansson et al., 1996).
Al igual que abamectina, el modo de acción principal de la emamectina es la activación

de los canales cloro (grupo 6 IRAC) descrito anteriormente. Emamectina ha sido
desarrollado principalmente para el control de plagas pertenecientes al orden lepidoptera
en una amplia variedad de cultivos (Tomlin, 2009). Actúa por ingestión y en menor
medida por contacto (Dybas & Babu, 1988), y aunque presenta un movimiento
translaminar no es un insecticida sistémico, ya que el movimiento está limitado a los
tejidos de las hojas tratadas, y es casi inexistente en hojas adyacentes y demás partes de
la planta (Willis & Mc Dowell, 1987).
En España el uso de Affirm 0,855 % SG (Syngenta Agro S.A.) está autorizado en

cultivos hortícolas y vid (MAGRAMA, 2013c).
86
5.1.1.4. Flubendiamida.
Insecticida perteneciente al grupo químico de las diamidas. Los primeros pasos en el

descubrimiento del compuesto flubendiamida fue llevado a cabo por investigadores del
centro de investigación Nihon Nohyaku (Japón) durante el desarrollo de un herbicida,
en el año 1993 (Lahm, et al., 2009).
Para clasificar a este plaguicida, IRAC ha creado un nuevo grupo principal/punto de

acción primario, el 28: moduladores del receptor de rianodina, con acción nerviosa y
muscular (IRAC, 2013). El receptor de rianodina, también conocido como el receptor
del canal del calcio, debe su nombre al metabolito de origen vegetal rianodina, extraído
de la planta Ryania speciosa Vahl (Salicaceae). El ión calcio juega un papel esencial en
el sistema nervioso y el comportamiento de insectos (Liu, et al., 2010a), y dependiendo
del tipo de célula en la cual es liberado se desencadenarán diferentes estímulos celulares
o fisiológicos (Ebbinghaus-Kintscher et al., 2007). El compuesto flubendiamida activa
el receptor de rianodina produciendo una liberación incontrolada de iones calcio (Casida
& Durkin, 2013), lo que provoca alteraciones en la contracción muscular del insecto que
se manifiestan con un rápido cese de la alimentación, regurgitación, letargo y parálisis
(Lahm, et al., 2009).
Flubendiamida muestra una alta especificidad en el control de plagas pertenecientes al

orden lepidóptera (Tohnishi, et al., 2005; Ebbinghaus-Kintscher, et al., 2007; Lahm, et
al., 2009) y se ha mostrado ineficaz contra plagas pertenecientes a los órdenes
coleoptera, homoptera o frente ácaros fitófagos (Hirooka, et al. 2007). Actúa por
ingestión y presenta movimiento translaminar (Hirooka, et al., 2007; Lahm, et al., 2009;
Tomlin, 2009).
En España el uso de Fenos 24 % WG (Bayer Crop Science S.L.) está permitido en

cultivos hortícolas y en ornamentales herbáceas (MAGRAMA, 2013d).
87
5.1.1.5. Spinosad.
Spinosad es un compuesto derivado de la fermentación del actinomiceto

Saccharopolyspora spinosa Mertz y Yao (Bacteria: Pseudonocardiaceae), mezcla de dos
metabolitos (lactosas macrocíclicas), spinosin A y spinosin D (Thompson et al., 2002).
IRAC (2013) ha incluido a spinosad en el grupo 5: agonistas/antagonistas del receptor

nicotínico de acetilcolina. La acción de este compuesto se sitúa principalmente sobre
los receptores nicotínicos de la acetilcolina, donde ejerce un efecto sinérgico a la
actividad de la acetilcolina pero en un lugar de actuación diferente. De esta manera,
cuando se fija sobre el receptor permite la entrada de cationes, que al ser continua
provoca una excitación constante de las células nerviosas, traduciéndose en
contracciones musculares, temblores, parálisis y finalmente la muerte del insecto
(Salgado, 1997, 1998; Medina et al., 2003a,b). Por otro lado, el spinosad probablemente
también ejerce una acción adicional sobre los receptores del GABA, neurotransmisor
que activa los canales que permiten el flujo de los iones hacia las células, provocando
una sintomatología similar a la descrita anteriormente (Salgado 1997, 1998; Cleveland
et al., 2002).
Spinosad es muy activo frente a dípteros (Adán et al., 1996), aunque se utiliza también
para el control de lepidópteros, homópteros, tisanópteros y coleópteros en una amplia
variedad de cultivos (Tomlin, 2009), y contra termitas (Dripps et al., 2011), teniendo
actividad por contacto e ingestión (Tomlin, 2009).
En España el uso de Spintor 480 SC (Dow Agrosciences Ibérica S.A.) está permitido en
cultivos hortícolas, vid y frutales (MAGRAMA, 2013e).
88
5.1.1.4. Spiromesifen.
Spiromesifen es el segundo compuesto descrito perteneciente a la clase química de los

ácidos tetrónicos espirocíclicos, descubiertos por Bayer Crop Science en los años 90
(Bretschneider, et al., 2005). Su precursor fue spirodiclofen, y recientemente se ha
introducido en el mercado el tercer compuesto perteneciente a esta familia,
spirotetramat (Marĉić, et al., 2011).
IRAC (2013) lo ha incluido en el grupo 23: inhibidores de la acetil CoA carboxilasa,

impidiendo la síntesis de lípidos necesarios para el desarrollo de los insectos (Tomlin,
2009). Su inclusión en este grupo se ha hecho con la salvedad de que no se ha
identificado aún la proteína sobre la que actúa, y que es responsable del efecto biológico
que produce.
Spiromesifen actúa contra moscas blancas (Bemisia spp. (Hemiptera: Aleyrodidae) y

Trialeurodes spp. (Hemiptera: Aleyrodidae)), y ácaros tetraníquidos, como Tetranychus
spp. tras su aplicación foliar (Nauen, et al., 2005). Su modo de acción principal es por
contacto, aunque también alguna cantidad del insecticida puede penetrar dentro del
tejido foliar (Marĉić, et al., 2011).
En España el uso de Oberon 24 % SC (Bayer Crop Science S.L.) está autorizado en

cultivos hortícolas y ornamentales leñosas y herbáceas (MAGRAMA 2013f).
89
5.2. Materiales y métodos.
5.2.1. Insecticidas evaluados.
Las características de los insecticidas estudiados se dan en la tabla 18.
Tabla 18. Características de los insecticidas evaluados.
Ingrediente Concentración Incluido en el

Concentración
activo Modo de acción Producto/ máxima en Anexo I
1 (mg i.a./l)
(i.a.) (IRAC) casa comercial hortícolas en 91/414/CEE3
España
(cc/hl)2
Abamectina Activador canal de cloro Vertimec 1,8 % EC/ 100 18 Sí

Syngenta Agro S.A.
Deltametrina Moduladores del canal Decis 2,5 % EC/ 50 12,5 Sí

de sodio Bayer Cropscience S.L.
Emamectina Activador canal de cloro Affirm 0,855 % SG/ 150 12,82 Pendiente 4
Syngenta Agro S.A.
Flubendiamida Moduladores del receptor Fenos 24 % WG/ 25 60 Pendiente 4

de rianodina Bayer Cropscience S.L.
Agonistas/antagonistas Spintor 480 SC/

Spinosad del receptor de nicotínico Dow Agrosciences 25 120 Sí
acetilcolina Ibérica
Spiromesifen Inhibidores de la acetil Oberon 24 % SC/ 60 144 Sí

CoA carboxilasa Bayer Cropscience S.L.
EC, Concentrado emulsionable; SG, Gránulos solubles en agua; SC, Suspensión concentrada; WG, Granulado
dispersable en agua; i.a., ingrediente activo. 1IRAC ((Insecticide Resistance Action Committee). 2Producto comercial.
3
Sustancias incluidas en el anexo I de la Directiva 91/414/CEE trasladadas al anexo I del Reglamento Nº 1107/2009
(MAGRAMA 2013a). 4Con registro excepcional en España: Emamectina (27-7-2010 a 31-1-2015) (MAGRAMA
2013c); Flubendiamida (5-7-2010 a 30-4-2015) (MAGRAMA 2013d).
90
5.2.2. Clasificación de los insecticidas.
Para cada parámetro estudiado, los valores medios de mortalidad se corrigieron por la
fórmula de Schneider-Orelli:
Y las reducciones en fecundidad, fertilidad y descendencia se calcularon por la fórmula

de Abbot:
Una vez obtenidos los valores corregidos, se utilizaron para clasificar los insecticidas
según propone la OILB (Hassan, 1994) (Tabla 19).
Tabla 19. Clasificación de los productos fitosanitarios según el efecto sobre los organismos en:
a. Ensayos de laboratorio, laboratorio extendido, semi-campo y campo.
Laboratorio extendido /
Categorías OILB Laboratorio Semi-campo / Campo
1. Inocuo <30% <25%
2. Ligeramente tóxico 30–79% 25-50%
3. Moderadamente tóxico 80–99% 51-75%
4. Tóxico >99% >75%
b. Ensayos de persistencia.
Categorías OILB Persistencia (días)

A. Poco persistente <5
B. Ligeramente persistente 5-15
C. Moderadamente persistente 16-30
D. Persistente >30
91
5.2.3. Resumen de los ensayos realizados con insecticidas.
A continuación se resumen los ensayos realizados con insecticidas en los enemigos

naturales O. laevigatus y N. tenuis (Figura 84).
Figura 84. Resumen de ensayos realizados con insecticidas en los enemigos naturales O. laevigatus y N.
tenuis.
O. laevigatus
Adultos
(estado menos
susceptible)
N. tenuis
Ensayos de laboratorio,
contacto residual sobre placas
de cristal O. laevigatus
Ninfas N2
(estadio más
susceptible)
N. tenuis
O. laevigatus
Persistencia, sobre plantas de Adultos

pimiento o tomate (estado menos
susceptible)
N. tenuis
5.2.4. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio.
En la aplicación residual de los compuestos se utilizó la Torre de Potter (Figura 85), un

pulverizador automático que permite la distribución del producto de manera uniforme
por toda la superficie a tratar y con el tamaño de gota más pequeño posible (Potter,
1952).
En el cálculo de las soluciones se utilizó el PIEC (Predicted Inicial Environmental

Concentration) (Barret et al., 1994) (Tabla 20), el cual es función de la dosis máxima
aplicada en campo del insecticida, y del gasto de agua para cada tipo de cultivo
considerando un factor de corrección. Esta fórmula propuesta por la OILB en 1993, es
92
el resultado de medir los residuos foliares en campo después de haber realizado un

tratamiento racional con el producto.
Tabla 20. Cálculo del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration).
PIEC ( g/cm2) = DMC * fd / 100

DMC (g/ha) = Dosis máxima de campo
fd = factor de corrección
En los ensayos se usó el PIEC (300), debido a que el gasto de agua considerado habitual
en cultivos hortícolas es de 300 l/ha. La dosis máxima de campo se obtuvo en base a las
indicaciones del vademécum de productos sanitarios en cultivos hortícolas (De Liñán,
2011), a excepción de Decis 2,5 % EC (deltametrina) (De Liñán, 2010), que fue
sustituida en 2011 por una nueva formulación, Decis Protech 1,5 % EW (Bayer Crop
Science S.L.) (De Liñán, 2011).
El factor de corrección empleado fue 1, que es el valor correspondiente para cultivos

herbáceos.
Tabla 21. Valores del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration) para los insecticidas
evaluados.
Ingrediente activo PIEC ( /cm2)
Abamectina 3
Deltametrina 1,5
Emamectina 4,5
Flubendiamida 0,75
Spinosad 0,75
Spiromesifen 1,8
93
Para calcular las soluciones de los compuestos en cada aplicación residual, además del
PIEC, es necesario conocer el valor medio de pulverización con el que se está
trabajando, que no deberá ser menor de 1 mg/cm², ni superar los 2 mg/cm², con una
variación del 10 % como máximo (Vogt et al., 1998). Por ello, antes de comenzar a
tratar las repeticiones en cada uno de los ensayos, se pulverizó un 1 ml de agua destilada
sobre un porta de peso y área conocida, y pesado de nuevo para calcular la cantidad de
agua que quedó en la superficie. La operación se repetía diez veces, secando el porta
cuidadosamente entre ellas para finalmente hallarse la media, que es el valor del residuo
por área tratada.
El equipo de pulverización debe estar previamente calibrado a una presión de 50 Kpa y

limpio de posibles residuos antes de comenzar el ensayo. Por ello, entre la aplicación de
los diferentes tratamientos, se lavó la Torre de Potter con agua destilada y acetona. Las
placas de cristal pulverizadas (12 X 12 X 0,5 cm) en los ensayos por contacto residual
se dejaban secar antes de montar las unidades de ensayo (Figura 86).
Figura 85. Torre de Potter. Figura 86. Placas de vidrio (12 X 12 X 0,5 cm).
En los ensayos se evaluó la mortalidad (efecto letal) y parámetros reproductivos (efecto

subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de al menos el 50 %. A
continuación se resumen los parámetros evaluados en los enemigos naturales O.
laevigatus y N. tenuis (Tablas 22-24).
94
Tabla 22. Parámetros evaluados en adultos de O. laevigatus y N. tenuis.
Adultos
Mortalidad: 72 horas (O. laevigatus y N. tenuis)
Durante 6 días
Fecundidad: nºhuevos/hembra/día (O. laevigatus)
Fertilidad: % huevos eclosados (O. laevigatus)
Descendencia: nºninfas/hembra/día (N. tenuis)
Tabla 23. Parámetros evaluados en ninfas N2 de O. laevigatus.
Ninfas N2 de O. laevigatus
Mortalidad: 72 horas, 7 días y 11 días
Durante 6 días en adultos
Fecundidad: nºhuevos/hembra/día
Fertilidad: % huevos eclosados
Tabla 24. Parámetros evaluados en ninfas N2 de N. tenuis.
Ninfas N2 de N. tenuis
Mortalidad: 72 horas, 5 días y 10 días
Durante 6 días en adultos
Descendencia: nºninfas/hembra/día
La unidad experimental consistió en 15 adultos (estado menos susceptible) ó ninfas N2

(estadio más susceptible) de O. laevigatus ó N. tenuis confinados en cajas de ensayo
diseñadas por Jacas y Viñuela (1994). La parte superior e inferior de las cajas consistía
en placas de cristal tratadas con los insecticidas evaluados. Ambas placas estaban
conectadas entre sí por medio de un aro de metacrilato (10 cm de diámetro X 3 cm de
altura), con un orificio de 0,5 cm de diámetro, en el cual se colocó una aguja
hipodérmica conectada a un circuito de ventilación forzada durante todo el periodo de
evaluación para evitar la acumulación de vapores (Figura 87). En el interior de las cajas
95
se ofrecieron huevos de E. kuehniella como alimento y un trozo de judía verde como

fuente de líquido (Figura 88). Se hicieron cinco repeticiones por tratamiento (75 insectos
en total por tratamiento), con un tiempo de exposición de 72 horas en el caso de adultos.
En el caso de ninfas N2, el tiempo de exposición fue función del tiempo que tardaban en
completar su ciclo biológico, permaneciendo en la unidad de ensayo hasta que al menos
el 80 % de los individuos que formaban parte del tratamiento control no alcanzasen su
estado adulto, 11 días en el caso de O. laevigatus, y 10 días para N. tenuis (Castañé et
al., 1996; Bakker et al. 2000; Tedeschi et al., 2002; Van de Veire et al., 2002a).
Figura 87. Unidad experimental de ensayo Figura 88. Judía verde y huevos de E. kuehniella.
de contacto residual.
Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo lupa binocular, para
posteriormente reagruparlos en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm
diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm
diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) sin residuos de
insecticidas para evaluar sus parámetros reproductivos.
En el caso de O. laevigatus 3 machos y 3 hembras supervivientes (Cocuzza et al.,

1997b) eran introducidos por cada unidad de ensayo hasta formar 4 repeticiones por
compuesto a evaluar (24 insectos en total por tratamiento). Cada unidad de ensayo
constaba de una vaina de judía verde, la cual servía de sustrato de oviposición y fuente
de líquido, y 0,4 gr de huevos de E. kuehniella (Figura 89). Cada dos días, durante un
periodo de seis, se reponía el sustrato de oviposición y se contaban el número de huevos
depositados en cada vaina de judía verde. Las vainas de judía con puesta se introducían
en nuevas cajas de plástico redondas (9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación 5,5
96
cm. diámetro) (Figura 90) y en un plazo de siete días se contaban el porcentaje de huevos
eclosados.
Figura 89. Cajas de evaluación de fecundidad Figura 90. Detalle de caja de evaluación
en O. laevigatus (11,5 cm diámetro, 5 cm de de fertilidad en O. laevigatus (9 cm de
altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la
tapa de 5,5 cm de diámetro).
En el caso de N. tenuis un macho y una hembra supervivientes eran introducidos por

cada unidad de ensayo hasta formar 12 repeticiones por compuesto a evaluar (24
insectos en total por tratamiento) (Lara et al., 2010). Cada unidad de ensayo constaba de
una vaina de judía verde la cual servía de sustrato de oviposición y fuente de líquido, y
0,4 gr de huevos de E. kuehniella (Figura 91). Cada 2 días durante un periodo de seis se
reponía el sustrato de oviposición, siendo las vainas de judía repuestas introducidas en
vasos de plástico (8 cm de diámetro, 11 cm de altura) cubiertos con visillo por la parte
superior (Figuras 92). En un plazo de once días se contaba el número de ninfas
emergidas.
Figura 91. Cajas de evaluación de descendencia Figura 92. Vasos de evaluación de descendencia
en N. tenuis (9 cm diámetro, 3 cm de altura, en N. tenuis (8 cm de diámetro, 11 cm de altura).
ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro).
97
5.2.5. Persistencia.
Los ensayos de persistencia en adultos de O. laevigatus y N. tenuis se llevaron a cabo en

aquellos compuestos que en laboratorio por contacto residual no fueron clasificados
según la OILB categoría 1 (inocuos).
Para determinar la persistencia de los insecticidas, ambos chinches depredadores se

expusieron a los residuos de los plaguicidas a diferentes intervalos de tiempo (0, 4, 7,
14, 21 y 31 días) hasta la pérdida de su toxicidad (categoría 1 OILB para laboratorio
extendido), clasificándolos en cuatro categorías según el tiempo que ésta tarda en
alcanzarse, A-B-C-D (A=poco persistente, <5 días, B=ligeramente persistente, 5-15
días, C=moderadamente persistente, 16-30 días, D=persistente >30 días) (Hassan,
1994)..
Como sustrato se utilizaron plantas de pimiento (30-40 cm de altura) en el caso de O.

laevigatus (Figura 93), o plantas de tomate (50 cm de altura) en el caso de N. tenuis
(Figura 94). Las plantas fueron tratadas con un pulverizador manual hasta punto de goteo
(Figuras 95-96), permaneciendo en el invernadero durante la totalidad del ensayo. Para
evaluar cada tratamiento, las hojas se cortaron a diferentes intervalos de tiempo como se
ha mencionado anteriormente, y se introdujeron en un eppendorf de 1,5 ml con una
solución de 1,5 % de agar nutritivo, con el fin de asegurar la hidratación de las hojas. A
continuación, las hojas eran colocadas en una caja de plástico redonda (11,5 cm
diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro) (Figuras 97-98).
En cada una de las unidades de ensayo (5 repeticiones por compuesto a evaluar) se
introdujeron 15 adultos de O. laevigatus o N. tenuis (75 adultos en total por tratamiento)
a los que se les suministró 0,4 gr huevos de E. kuehniella.
Para cada uno de los residuos del insecticida, la mortalidad fue evaluada tras 72 horas,
siendo además evaluados los parámetros reproductivos cuando el plaguicida resultó
inocuo (categoría 1 OILB para laboratorio extendido) para el parámetro de mortalidad.
En su evaluación se siguió la misma metodología que en el punto 5.2.4.
98
Figura 93. Planta de pimiento (30-40 cm de altura). Figura 94. Planta de tomate (50 cm de altura).
Figura 95. Planta de pimiento tras el tratamiento. Figura 96. Planta de tomate tras el tratamiento.
con el insecticida. con el insecticida.
Figura 97. Unidad experimental de O. laevigatus Figura 98. Unidad experimental de N. tenuis
en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, en el ensayo de persistencia (11,5 cm de
5 cm de altura, ventilación en la tapa de diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la
5,5 cm de diámetro). . tapa de 5,5 cm. de diámetro)
99
5.3. Resultados.
5.3.1. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio
5.3.1.1. Orius laevigatus.
En las tablas 25 y 26 se muestra un resumen de los resultados tras la exposición de

adultos y ninfas N2 de O. laevigatus al residuo fresco de los compuestos sobre placas de
cristal durante 72 horas y 11 días, respectivamente. Para ambos estados los efectos
insecticidas fueron similares, produciéndose diferencias estadísticamente significativas
con respecto al control en adultos a las 72 horas (F6,27=328,35; P<0,05) y en ninfas N2 a
las 72 horas, (K=32,69; P<0,05), 7 días (F3,16=169,90; P<0,05) y 11 días (F3,16=95,46;
P<0,05).
En cuanto a la mortalidad, los compuestos abamectina, deltametrina y spinosad

fueron los que produjeron una mayor toxicidad, con valores del 100 % en adultos y
ninfas N2 tras 72 horas de exposición. En el caso de emamectina, los porcentajes de
mortalidad producidos en adultos y ninfas N2 fueron similares tras 72 horas de
exposición, 46,66 % y 53,33 %, respectivamente. Sin embargo, sólo el 8 % de las ninfas
N2 fueron capaces de alcanzar el estado adulto tras su exposición al insecticida durante
11 días. Por otro lado, los compuestos flubendiamida y spiromesifen produjeron las
mortalidades más bajas para ambos estados de O. laevigatus. Sus porcentajes de
mortalidad fueron respectivamente del 5-12 % para adultos, y del 13,33-21,33 % para
ninfas N2 (Figuras 99-100).
100
Tabla 25. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en adultos de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas
de cristal en laboratorio.
Compuestos Mortalidad Incremento Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación

72 h (%)1 (%)2 (huevos/♀/día) 1 (%)3 (%)1 (%)3 OILB4
(efecto total)
Control 7,99 ± 2,49 a ------ 5,50 ± 0,84 a ------ 83,67 ± 0,31 a ------ ------
Abamectina 100 ± 0 c 100 ------ ------ ------ ------ 4
Deltametrina 100 ± 0 c 100 ------ ------ ------ ------ 4
Emamectina 46,66 ± 3,65 b 42,03 4,47 ± 0,86 a 18,73 76,43 ± 3,55 a 8,65 2
Flubendiamida 4,99 ± 1,66 a -3,26 6,33 ± 0,77 a -15,09 82,29 ± 0,23 a 1,65 1
Spinosad 98,66 ± 1,33 c 98,54 ------ ------ ------ ------ 3
Spiromesifen 11,99 ± 5,33 a 4,35 5,92 ± 0,99 a -7,64 82,27 ± 0,20 a 1,67 1
F (g.l.) o K 328,25 (6;27) ------ 0,83 (3;12) ------ 3,23 (3;12) ------ ------
P <0,05 ------ 0,50 ------ 0,06 ------ ------
1
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05).
2
Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100
3
Fecundidad y fertilidad corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100
4
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%),
3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)
101
Tabla 26. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas
de cristal en laboratorio.
Incremento
Compuestos Mortalidad Mortalidad Mortalidad a los Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación
72 h (%)1 7 días (%)1 11 días (%)1 11 días (huevos/♀/día) 1 (%)3 (%)1 (%)3 OILB4
(%)2 (efecto total)
Control 1,33 ± 1,33 a 10,66 ± 2.66 a 15,99 ± 4,52 a ------ 7,32 ± 0,47 a ------ 71,42 ± 2,59 a ------ ------
Abamectina 100 ± 0 c ------ ------ 100 ------ ------ ------ ------ 4
Deltametrina 100 ± 0 c ------ ------ 100 ------ ------ ------ ------ 4
Emamectina 53,33 ± 3,65 b 89,33 ± 2,66 b 91,99 ± 3,26 b 90,47 ------ ------ ------ ------ 3
Flubendiamida 3,99 ± 1,63 a 9,33 ± 3,99 a 13,33 ± 2,98 a -3,17 6,91 ± 0,78 a 5,60 69,60 ± 3,79 a 2,55 1
Spinosad 100 ± 0 c ------ ------ 100 ------ ------ ------ ------ 4
Spiromesifen 0±0 a 11,99 ± 2,49 a 21,33 ± 4,42 a 6,36 7,14 ± 0,66 a 2,46 75,37 ± 3,39 a -5,53 1
F (g.l.) o K 32,69 169,90 (3;16) 95,46 (3;16) ------ 0,10 (2;9) ------ 0,80 (2;9) ------ ------
P <0,05 <0,05 <0,05 ------ 0,90 ------ 0,48 ------ ------

1
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05).
2
3
4
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico
(reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)
102
Figura 99. Porcentajes de mortalidad en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de
los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
100
c c c
% Mortalidad 72 h
80
60 b
40
a
20
a a
0
Flubendiamida
Spiromesifen
Spinosad
Control
Abamectina
Deltametrina
Emamectina
Compuestos
Figura 100. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras su

exposición al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 11 días sobre placas de cristal en
laboratorio.
cc c
100
b b
90
80
Control
70
% Mortalidad
60
b Abamectina
Deltametrina
50
Emamectina
40
Flubendiamida
30
a a Spinosad
20
a a a a Spiromesifen
10
a a a
0
72 h 7 días 11 días
103
Respecto a la reproducción, tras la evaluación de los parámetros de fecundidad y

fertilidad se vio que no hubo diferencias estadísticamente significativas ni en los
tratamientos de adultos (F3,12=0,83; P=0,50 y F3,12=3,23; P=0,06) (Tabla 25), ni en los de
ninfas N2 de O. laevigatus (F2,9=0,10; P=0,90 y F2,9=0,80; P=0,48) (Tabla 26).
En el caso de adultos, la fecundidad fue de 6,33, 5,92, y 4,47 huevos por hembra y día
para los compuestos flubendiamida, spiromesifen y emamectina, respectivamente,
con una fertilidad entorno al 80 % (Figuras 101-102).
Figura 101. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo
fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
10
Nº huevos / hembra/día
8
a a
a
6
a
4
Control Emamectina Flubendiamida Spiromesifen

Compuestos
104
Figura 102. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo
100
a a a a
80
% Huevos eclosados
60
40
20
Control Emamectina Flubendiamida Spiromesifen

Compue stos
En el caso de aquellas ninfas N2 que consiguieron llevar al estado adulto, la fecundidad

se situó entorno a 7 huevos por hembra y día para los compuestos flubendiamida y
spiromesifen, y la fertilidad fue del 69,6 % y 75,37 %, respectivamente (Figuras 103-
104).
Figura 103. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus
expuestas al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas de cristal en laboratorio.
10
a a a
Nº huevos / hembra/día
Control Flubendiamida Spiromesifen

Compuestos
105
Figura 104. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus
100
a
80 a a
% Huevos eclosados
60
40
20

Compue stos
Por lo tanto según los resultados obtenidos tras la exposición de adultos y ninfas N2 de
O. laevigatus al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal, y siguiendo la
clasificación de la OILB, los plaguicidas pueden clasificarse en base a su efecto total
como:
Tabla 27. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo
fresco de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.
Clasificación OILB1 (efecto total)

Compuestos O. laevigatus: Contacto residual en laboratorio
Adultos Ninfas N2
Abamectina 4 4
Deltametrina 4 4
Emamectina 2 3
Flubendiamida 1 1
Spinosad 3 4
Spiromesifen 1 1
1
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción
30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)
106
5.3.1.2. Nesidiocoris tenuis.
En las tablas 28 y 29 se muestra un resumen de los resultados tras la exposición de

adultos y ninfas N2 de N. tenuis al residuo fresco de los compuestos sobre placas de
cristal durante 72 horas y 10 días, respectivamente. Para ambos estados los efectos
insecticidas fueron similares, produciéndose diferencias estadísticamente significativas
con respecto el control en adultos a las 72 horas (F6,28=33,44; P<0,05) y en ninfas N2 a
las 72 horas (F6,28=21,76; P<0,05), 5 días (F6,28=28,40; P<0,05) y 10 días (F6,28=44,60;
P<0,05).
En cuanto a la mortalidad, los compuestos abamectina, deltametrina, emamectina y

spinosad produjeron las mortalidades más elevadas tanto en adultos, como en ninfas N2.
En adultos, los porcentajes de mortalidad fueron superiores al 50 % para todos los
compuestos anteriormente mencionados tras 72 horas de exposición. En el caso de
ninfas N2, aunque se supone que es el estado más expuesto, las mortalidades fueron
menores, entorno al 40 % tras 10 días de contacto, excepto para emamectina que
alcanzó el 86,66 %. Por otro lado, los compuestos flubendiamida y spiromesifen
produjeron las mortalidades más bajas para ambos estados de N. tenuis. Situándose sus
porcentajes de mortalidad entre el 4-6 % en el caso de adultos, y entre un 12-22 % en
ninfas N2 (Figuras 105-106).
107
Tabla 28. Porcentajes de mortalidad y descendencia en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal
en laboratorio.
Compuestos Mortalidad Incremento Descendencia Reducción Clasificación

72 h (%)1 (%)2 (ninfas/♀/día) 1 (%)3 OILB4
(efecto total)
Control 1,33 ± 1,33 a ------ 6,43 ± 0,46 a ------ ------
Abamectina 54,28 ± 8,06 b 53,66 ------ ------ 2
Deltametrina 54,50 ± 4,83 b 53,89 ------ ------ 2
Emamectina 60,14 ± 7,69 bc 59,60 ------ ------ 2
Flubendiamida 6,66 ± 2,98 a 5,40 4,95 ± 0,19 a 23,02 1
Spinosad 71,05 ± 5,66 c 70,66 ------ ------ 2
Spiromesifen 3,99 ± 2,66 a 2,70 6,24 ± 0,73 a 2,95 1
F (g.l.) o K 33,44 (6;28) ------ 2,95 (2;26) ------ ------
P <0,05 ------ 0,07 ------ ------
1
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0.05)
2
3
Descendencia corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100
4
108
Tabla 29. Porcentajes de mortalidad y descendencia en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal
en laboratorio.
Incremento Clasificación
Compuestos Mortalidad Mortalidad Mortalidad a los Descendencia Reducción OILB4
72 h (%)1 5 días (%)1 10 días (%)1 10 días (ninfas/♀/día) 1 (%)3 (efecto total)
(%)2
Control 1,11 ± 1,1a 2,64 ± 1,65 a 12,86 ± 3,11 a ------ 5,01 ± 0,53 a ------ ------
Abamectina 14,91 ± 2,80 bc 22,53 ± 5,95 c 42,37 ± 5,41 b 34,23 2,23 ± 0,66 a 55,49 2
Deltametrina 25,78 ± 7,01 c 28,93 ± 7,13 c 41,38 ± 4,19 b 32,73 4,13 ± 0,57 a 17,56 2
Emamectina 67,99 ± 3,88 d 74,66 ± 5,33 d 86,66 ± 3,65 c 84,69 ------ ------ 3
Flubendiamida 4,63 ± 1,90 ab 10,29 ± 1,99 ab 21,93 ± 3,58 a 10,4 4,30 ± 0,81 a 14,17 1
Spinosad 15,90 ± 6,97 bc 18,28 ± 5,15 bc 40,67 ± 2,72 b 31,91 5,13 ± 0,62 a -2,40 2
Spiromesifen 0±0a 3,89 ± 1,62 a 11,98 ± 3,66 a -1,01 4,77 ± 0,76 a 4,79 1
F (g.l.) o K 21,76 (6;28) 28,40 (6;28) 44,60 (6,28) ------ 2,30 (5;64) ------ ------
P <0,05 <0,05 <0,05 ------ 0,055 ------ ------
1
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0.05)
2
3
4
109
Figura 105. Porcentajes de mortalidad en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los
insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
% Mortalidad 72 h
100
80 c
b b bc
60
40
20
a a a
0
Emamectina
Flubendiamida
Deltametrina
Control
Spiromesifen
Abamectina
Spinosad
Compuestos
Figura 106. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición
al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 10 días sobre placas de cristal en laboratorio.
100
c
d
80
d Control
Abamectina
% Mortalidad
60 Deltametrina
bb b Emamectina
40
c Flubendiamida
c c a Spinosad
bc bc bc Spiromesifen
20
ab a a
a ab a a a
0
72 h 5 días 10 días
110
Respecto a la reproducción, para el parámetro de descendencia se vio que no hubo

diferencias estadísticamente significativas ni en los tratamientos de adultos (F2,26=2,95;
P=0,07) (Tabla 28), ni en los de ninfas N2 (F5,64=2,30; P=0,055) (Tabla 29). Sin embargo,
abamectina produjo una reducción en la descendencia del 55,49 % (Tabla 29).
En adultos, el número de ninfas por hembra y día fueron de 4,95 y 6,24 para los
compuestos flubendiamida y spiromesifen, respectivamente. (Figura 107).
Figura 107. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo
10
Nº ninfas / hembra/día
8
a a
6
a
4
0
Compuestos
111
En el caso de aquellas ninfas N2 que consiguieron llevar al estado adulto, el número de

ninfas por hembra y día osciló entre 2,23-5,13 (Figura 108).
Figura 108. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de N. tenuis
10
6 a a a
a a
4
a
2
0
Control Abamectina Deltametrina Flubendiamida Spinosad Spiromesifen
Compuestos
112
Por lo tanto según los resultados obtenidos tras la exposición de adultos y ninfas N2 de
N. tenuis al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal, y siguiendo la
clasificación de la OILB, los plaguicidas pueden clasificarse en base a su efecto total
como:
Tabla 30. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de N. tenuis tras la exposición al residuo fresco de
los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.

Compuestos N. tenuis: Contacto residual en laboratorio
Adultos Ninfas N2
Abamectina 2 2
Deltametrina 2 2
Emamectina 2 3
Flubendiamida 1 1
Spinosad 2 2
Spiromesifen 1 1
1
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción
30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)
113
5.3.2.1. Orius laevigatus.
En la figura 109 se muestran las condiciones ambientales registradas en el invernadero

durante la degradación de los residuos en plantas de pimiento.
Figura 109. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Condiciones
ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre-Octubre del 2010.
25 100
80
20
HR m edia (% )
60
15
40
10
20
5 0
20-IX
22-IX
24-IX
26-IX
28-IX
30-IX
2-X
4-X
6-X
8-X
10-X
12-X
14-X
16-X
18-X
20-X
20-IX
22-IX
24-IX
26-IX
28-IX
30-IX
2-X
4-X
6-X
8-X
10-X
12-X
14-X
16-X
18-X
20-X
Días de ensayo
Días de ensayo
R adiación UV m edia ( m ol/m 2*s)
2500 160
140
PA R medio ( mol/m2*s)
2000
120
1500 100
PAR interior UV interior
80
PAR exterior UV exterior
1000
60
500 40
20
0 0
20-IX
22-IX
24-IX
26-IX
28-IX
30-IX
2-X
4-X
6-X
8-X
10-X
12-X
14-X
16-X
18-X
20-X
-I X
-I X
-I X
-I X
-I X
-I X
-X
-X
-X
-X
-X
-X
X
X
X
X
2-
4-
6-
8-
10
12
14
16
18
20
20
22
24
26
28
30
La temperatura media registrada durante el ensayo se situó entorno a los 20 ± 5 ºC, a

excepción de los últimos días de ensayo, que cayó por debajo de 15 ºC a causa de una
avería en la calefacción del invernadero. La humedad relativa media osciló entre un 60-
80 %, la radiación PAR media en el invernadero fue un 31 % menor que en el exterior,
y la radiación UV media un 48 % menor. Un resumen de los valores medios, máximos y
mínimos de radiación registrados en el invernadero durante el ensayo se dan en la tabla
31.
114
Tabla 31. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Resumen de las
radiaciones PAR y UV registradas en el interior del invernadero en Septiembre del 2010.
PAR interior UV interior

( mol/m2*s) ( mol/m2*s)
Medio 846,6 ± 55,85 41,9 ± 3,81
Máximo 1285 79,2
Mínimo 175 8,3
En la tabla 32 se muestran los datos de mortalidad en adultos de O. laevigatus, tras su

exposición durante 72 horas al residuo de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas
sobre hojas de pimiento. Se produjeron diferencias estadísticamente significativas con
respecto al control en todos los intervalos de tiempo evaluados, residuo de 0 días
(F4,20=51,08; P<0,05), 4 días (F4,19=40,28; P<0,05), 7 días (F4,20=73,10; P<0,05), 14 días
(F3,16=382,42; P<0,05), 21 días (F3,15=42,76; P<0,05) y 31 días (F3,16=26,51; P<0,05).
Los compuestos abamectina y deltametrina produjeron mortalidades superiores al 85

% en adultos de O. laevigatus durante toda la duración del ensayo (31 días). Incluso
cuando los adultos del chinche depredador se expusieron al residuo de 31 días de
abamectina y deltametrina, se produjeron mortalidades del 90,66 % y 87,99 %,
respectivamente. Por otro lado, el compuesto spinosad también produjo mortalidades
elevadas durante todo el ensayo con valores que oscilaron entre el 86,66 % y el 43,99
%. Sin embargo, se observó una progresiva degradación del insecticida a partir del día
14 de ensayo, como puede apreciarse en los porcentajes de mortalidad registrados los
días 14, 21 y 31, 75,99 %, 49,32 % y 43,99 %, respectivamente. En el caso de
emamectina, hubo una mortalidad superior al 40 % cuando los adultos de O. laevigatus
se expusieron al residuo de 0 y 4 días. Sin embargo, tras exponerse al residuo de 7 días
la mortalidad fue sensiblemente menor (26,66 %) (Figura 110).
115
Tabla 32. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de
pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).
0 DDT1 4 DDT1 7 DDT1 14 DDT1 21 DDT1 31 DDT1
Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Clasificación

Compuestos 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 OILB5
(efecto total)
(Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/
4 4 4 4 4
OILB OILB OILB OILB OILB OILB4
Control 9,33 ± 3,99 a 6,66 ± 3,84 a 6,66 ± 4,21 a 5,32 ± 1,33 a 4,99 ± 1,66 a 2,66 ± 1,63 a -------
Abamectina 100 ± 0 c 100 ± 0 c 100 ± 0 d 100 ± 0 c 91,99 ± 2,49 c 90,66 ± 4,98 c D
(100)/4 (100)/4 (100)/4 (100)/4 (91,57)/4 (90,40)/4
Deltametrina 100 ± 0 c 100 ± 0 c 100 ± 0 d 97,33 ± 1,63 c 96,00 ± 4,00 c 87,99 ± 10,41 c D
(100)/4 (100)/4 (100)/4 (97,18)4 (95,79)/4 (87,66)/4
Emamectina 54,66 ± 7,7 b 42,66 ± 8,58 b 26,66 ± 8,94 b ------- ------- ------- B
(49,99)/2 (38,57)/2 (21,43)/1
Spinosad 86,66 ± 8,43 c 82,66 ± 9,56 c 77,32 ± 5,41 c 75,99 ± 4,00 b 49,32 ± 9,79 b 43,99 ± 10,45 b D
(85,29)/4 (81,42)/4 (75,70)/4 (74,64)/3 (46,66)/2 (42,46)/2
F (g.l.) o K 51,08 (4;20) 40,28 (4;19) 73,10 (4;20) 382,42 (3;16) 42,76 (3;15) 26,51 (3;16) -------
P <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 -------
1
DDT=Días después de tratamiento
2
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05)
3
4
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico (reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción 51-75%) y 4=tóxico
(reducción>75%)
5
Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)
116
Figura 110. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los
residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento en invernadero (Radiación
UV media=41,9 mol/m2*s).
100 cc c cc dd cc c cc
c c
90
c b
80
% Mortalidad 72 h
70
b b Control
60
b b Abamectina
50 Deltametrina
40 b Emamectina
30 Spinosad
20 a a a
10 a a a
0
Residuo 0 Residuo 4 Residuo 7 Residuo 14 Residuo 21 Residuo 31
días días días días días días
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0,05).
En el caso de emamectina, se evaluaron los posibles efectos subletales que el residuo

de 7 días podría haber ocasionado en los parámetros reproductivos de fecundidad y
fertilidad. No hubo diferencias estadísticamente significativas con respecto el control
para el número de huevos por hembra y día (t=0,38; P=0,71), y porcentaje de eclosión
de los mismos (t=-1,18; P=0,28), siendo los valores de 5,77 y del 85,41 %,
respectivamente (Tabla 33).
117
Tabla 33. Fecundidad y fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras exponerse al
residuo de 7 días de emamectina durante 72 horas sobre hoja de pimiento en invernadero (Radiación UV
media=41,9 mol/m2*s).
Compuestos Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación

(huevos/♀/día) 1 (%)2 (%)1 (%)2 OILB3
Control 6,44 ± 1.21 a ------ 80,05 ± 3,36 a ------ ------

Emamectina 5,77 ± 1.23 a 10,40 85,41 ± 3,00 a -6,70 1
t 0,38 ------ -1,18 ------ ------
P 0,71 ------ 0,28 ------ ------
1
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05)
2
3
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico
(reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción 51-75%) y 4=tóxico (reducción>75%)
Por lo tanto según los resultados obtenidos en el ensayo de persistencia con adultos de
O. laevigatus y siguiendo la clasificación de la OILB, los productos se clasificaron en
base a su efecto total como:
Tabla 34. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas en adultos de O. laevigatus cuando se
aplicaron sobre plantas de pimiento y degradaron en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).
Compuestos O. laevigatus: Persistencia en

plantas de pimiento
Adultos
Abamectina D
Deltametrina D
Emamectina B
Spinosad D
1
Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia:
A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días),
C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)
118
5.3.2.2. Nesidiocoris tenuis.
En la figura 111 se muestran las condiciones ambientales registradas en el invernadero

durante la degradación de los residuos en plantas de tomate.
Figura 111. Ensayo de persistencia sobre tomate en el enemigo natural N. tenuis. Condiciones
ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre del 2011.
30 100
25 80
HR media (%)
20 60
15 40
10 20
5 0
14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX
2500 180
Radiación UV media ( mol/m2*s)
160
2000
PAR medio ( mol/m2*s)
140
120
1500
PAR interior 100 UV interior
PAR exterior 80 UV exterior
1000
60
500 40
20
0 0
14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX
La temperatura media y humedad relativa registrada durante el ensayo se situó entorno a

los 20 ± 5 ºC y 60-75 %, respectivamente. Las medidas puntuales medias diarias del
PAR y radiación UV en el interior del módulo invernadero fueron muy constantes,
siendo su media en el transcurso del estudio de 1161,7 ± 43,38 mol/m2*s y 78,4 ± 3,36
mol/m2*s, respectivamente.
119
En la tabla 35 se muestran los datos de mortalidad en adultos de N. tenuis, tras su

exposición durante 72 horas a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas
de tomate. El residuo de 0 días de los compuestos abamectina, deltametrina,
emamectina y spinosad produjo una ligera mortalidad en adultos de N. tenuis,
habiendo diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (F4,20=9,21;
P<0,05). El compuesto más tóxico fue abamectina, con un porcentaje de mortalidad del
51,99 %, seguido de deltametrina, emamectina y spinosad, con mortalidades del 37,44
%, 37,61 % y 35,15 %, respectivamente. Esta toxicidad inicial se vio reducida cuando
adultos del chinche depredador se expusieron al residuo de 4 días de los compuestos
evaluados, no habiendo diferencias estadísticamente significativas con respecto al
control (F4,20=1,19, P=0,34), y no superándose el 20 % de mortalidad en ninguno de los
compuestos. (Figura 112)
120
Tabla 35. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas y descendencia en adultos de N. tenuis tras exponerse a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas de
tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).
0 DDT1 4 DDT1 4 DDT1

Incremento Incremento Reducción Clasificación
Compuestos Mortalidad (%)3/ Mortalidad (%)3/ Descendencia (%)5/ OILB6
72 h (%)2 OILB4 72 h (%)2 OILB4 (ninfas/♀/día) 2 OILB4 (efecto total)
Control 7,99 ± 5,33 a ------ 7,99 ± 5,33 a ------ 8,22 ± 0,96 a ------ ------
Abamectina 51,99 ± 8,27 c 47,82/2 15,99 ± 4,52 a 8,69/1 9,61 ± 0,79 a -16,91/1 A
Deltametrina 37,44 ± 4,43 bc 32,01/2 14,66 ± 3,88 a 7,25/1 8,02 ± 0,62 a 2,43/1 A
Emamectina 37,61 ± 4,74 bc 32,19/2 7,99 ± 2,66 a 0/1 6,21 ± 0,44 a 24,45/1 A
Spinosad 35,15 ± 0,46 b 29,52/2 18,66 ± 3,26 a 11,60/1 7,81 ± 1,15 a 4,99/1 A
F (g,l,) o K 13,06 ------ 1,19 (4,20) ------ 2,37 (4;51) ------ ------
P <0,05 ------ 0,34 ------ 0,06 ------ ------
1
DDT=Días después de tratamiento
2
En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05)
3
4
Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico (reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción
51-75%) y 4=tóxico (reducción>75%)
5
6
Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días),
D=persistente (>30 días)
121
Figura 112. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de N. tenuis tras exponerse a los
residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4
mol/m2*s).
100
80
% Mortalidad 72 h
60
c Control
Abamectina
Deltametrina
bc bc
40 b Emamectina
Spinosad
a a a
20
a a a
0
Residuo 0 días Residuo 4 días
Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05),
Posteriormente se evaluaron los posibles efectos subletales que el residuo de 4 días de

abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían haber ocasionado en la
descendencia de N, tenuis. No se produjeron diferencias estadísticamente significativas
con respecto el control en su descendencia, (F4,51=2,37; P=0,06), oscilando el número de
ninfas por hembra y día entre 6,21 y 9,61 (Figura 113).
Figura 113. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras exponerse al residuo de 4
días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).
a
10
a a a
8
a
6
0
Control Abamectina Deltametrina Emamectina Spinosad
Compuestos
122
Por lo tanto según los resultados obtenidos en el ensayo de persistencia con adultos de
N. tenuis y siguiendo la clasificación de la OILB, los productos se clasificaron en base a
su efecto total como:
Tabla 36. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas adultos de N. tenuis cuando se
aplicaron sobre plantas de tomate y degradaron en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).
Compuestos N. tenuis: Persistencia en

plantas de tomate
Adultos
Abamectina A
Deltametrina A
Emamectina A
Spinosad A
1
Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia:
A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días),
C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)
123
5.4. Discusión.
5.4.1. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio.
El estudio mostró la compatibilidad de los compuestos flubendiamida y spiromesifen,

con adultos y ninfas N2 de O. laevigatus y N. tenuis. Sin embargo, los insecticidas
abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad no fueron selectivos para ambos
chinches depredadores independientemente del estado evaluado. Por otro lado, y aunque
ambas especies pertenecen al mismo orden, Hemiptera, el antocórido O. laevigatus fue
más sensible a los plaguicidas que el mírido N. tenuis.
Abamectina no fue selectivo para ninguno de los depredadores evaluados cuando se

expusieron al residuo fresco del insecticida sobre placas de cristal, a una dosis de 18 mg
i.a./l. En el caso del enemigo natural O. laevigatus abamectina fue clasificado como
tóxico para adultos y ninfas N2. Este compuesto parece afectar muy severamente a esta
especie, ya que varios autores han reportado una mortalidad del 100 % cuando ninfas
N1, N2 y adultos se expusieron por contacto residual en laboratorio a dosis inferiores
(10-13,5 mg i.a./l) a las utilizadas en nuestro ensayo (18 mg i.a./l) (Van de Veire et al.,
1996; Van de Veire & Tirry, 2003 y Biondi et al., 2012a). Además, la toxicidad de este
compuesto es extensiva a otra especie del género Orius, pues Studebaker y Kring
(2003) describieron mortalidades entre el 56,3-100 %, cuando ninfas y adultos de Orius
insidiosus (Say) (Hemiptera: Anthocoridae) se expusieron por contacto residual también
en laboratorio, a dosis comprendidas entre 9-20 g i.a./ha.
Por otro lado, y aunque la mortalidad registrada fue menor en N. tenuis, abamectina fue
clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2. Mortalidades similares a
las registradas en ninfas N2 de N. tenuis (42,37 %), se encontraron en ninfas N2 y N3 del
también mírido M. pygmaeus (38 %), cuando se expusieron por contacto residual a una
dosis de 10 mg i.a./l del insecticida en condiciones de laboratorio (Van de Veire &
Tirry, 2003). Además, abamectina produjo efectos deletéreos en la descendencia de N.
tenuis, reduciendo en un 55,49 % el número de ninfas por hembra y día con respecto al
testigo. Varios autores también han descrito como en ensayos de laboratorio abamectina
afectó a la reproducción de los míridos depredadores Deraeocoris brevis (Uhler)
124
(Hemiptera: Miridae), M. pygmaeus y del antocórido depredador O. laevigatus

(Tedeschi et al., 2002; Kim et al., 2006; Biondi et al., 2012a).
El piretroide sintético deltametrina fue utilizado como control positivo en nuestro

estudio, por lo que como era de esperar, no fue selectivo con ninguno de los
depredadores evaluados cuando se expusieron al residuo fresco del insecticida sobre
placas de cristal, a una dosis de 12,5 mg. i.a./l. Este compuesto está considerado como
un insecticida muy potente y de amplio espectro (Tomlin, 2009). De hecho, en las bases
de datos de las casas comerciales Biobest (2013c) y Koppert (2013) se encuadra a este
producto en la categoría OILB 4, siendo tóxico para una amplia gama de enemigos
naturales pertenecientes a distintos órdenes, C. carnea, E. formosa, Trichogramma spp.
(Hymenoptera: Trichogrammatidae), hemípteros de los géneros Nabis (Nabidae),
Deraeocoris (Miridae), Geocoris (Lygaeidae), Orius (Anthocoridae), y ácaros
fitoseidos, como A. swirskii y P. persimilis (Durán et al., 1998; Biobest, 2013c y
Koppert, 2013).
En nuestro ensayo fue clasificado como tóxico para adultos y ninfas N2 de O.

laevigatus. Otros autores han descrito también como deltametrina fue tóxico para O.
laevigatus y O. insidiosus, produciendo una mortalidad del 100 % en ninfas y adultos
bajo diversas formas de exposición (tratamiento tópico, residual o ingestión) en
laboratorio (Angeli et al., 2005; Torres et al., 2007a; Vilela et al., 2007; Amor et al.,
2012a). Por otro lado, y aunque la mortalidad registrada fue menor en N. tenuis,
deltametrina fue clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2, resultado
confirmado por Wanumen (2012) en adultos de N. tenuis en laboratorio.
Emamectina pertenece a la misma familia química que la abamectina (avermectinas),

por lo que eran de esperar resultados similares a los descritos anteriormente. Sin
embargo, al tratarse de una nueva generación de avermectinas (Jungmann et al., 2005),
sintetizadas y modificadas para incrementar su capacidad insecticida y especificidad
(Wei et al., 2005), en nuestro estudio emamectina fue más selectivo para ambos
chinches depredadores, cuando se expusieron a su residuo fresco sobre placas de cristal
en laboratorio a una dosis de 12,82 mg i.a./l. No obstante, a pesar de exhibir una mayor
selectividad con respecto a abamectina, emamectina fue clasificado como ligeramente
tóxico para adultos, y moderadamente tóxico para ninfas N2 de O. laevigatus y N.
125
tenuis. Estos resultados de toxicidad son similares a los obtenidos por Biondi y
colaboradores (2012a) en condiciones de laboratorio, cuando adultos de O. laevigatus se
expusieron a brotes de plantas de tomate tratadas a una dosis ligeramente superior
(14,25 mg i.a./l) a la de nuestro estudio (12,82 mg i.a./l). Además, este compuesto
tampoco resultó inocuo para otra especie del género Orius, ya que Studebaker y Kring
(2003) describieron mortalidades entre el 68,8-100 %, cuando ninfas y adultos de O.
insidiosus se expusieron por contacto residual también en laboratorio, a dosis
comprendidas entre 4,5-10 g i.a./ha. Por otro lado, en el estudio llevado a cabo por
López y colaboradores (2011), emamectina resultó ser selectivo para los míridos
depredadores M. pygmaeus y N. tenuis tras su exposición a su residuo fresco durante 72
horas. Sin embargo, era de esperar una mayor selectividad, puesto que los ensayos se
realizaron en condiciones de semi-campo en un invernadero, y emamectina tiene
tendencia a una rápida fotodegradación sobre la superficie de la hoja (Willis & Mc
Dowell, 1989; Prabhu et al., 1991). Además, en la realización del ensayo se utilizó
sustrato vegetal vivo (plantas de tomate), que puede favorecer la absorción y
degradación del insecticida, disminuyendo los niveles de residuo, y por tanto la
exposición.
Flubendiamida, que pertenece a la clase química de las diamidas, muestra una alta
especificidad contra plagas pertenecientes al orden lepidoptera (Tohnishi, et al., 2005;
Ebbinghaus-Kintscher, et al., 2007; Lahm, et al., 2009). De hecho, no se ha mostrado
efectivo contra otras plagas pertenecientes a los órdenes coleoptera, homoptera o frente
a ácaros fitófagos (Hirooka, et al. 2007). Basado en esta alta especificidad,
flubendiamida cabe esperar que sea un insecticida muy selectivo para los enemigos
naturales.
En nuestro estudio fue clasificado como inocuo para adultos, y ninfas N2 de O.

laevigatus y N. tenuis cuando se expusieron al residuo fresco del insecticida sobre
placas de cristal, a una dosis de 60 mg i.a./l. Estos resultados de toxicidad coinciden con
los obtenidos por Tohnishi y colaboradores (2005) en numerosos agentes de biocontrol,
expuestos mediante distintas formas de exposición (tópica, residual y pulverización
directa) en laboratorio. Para todos los enemigos naturales evaluados: Harmonia axyridis
Pallas (Coleoptera: Coccinellidae), Coccinella septempunctata L. (Coleoptera:
Coccinellidae), E. formosa, A. colemani, Cotesia glomerata (L.) (Hymenoptera:
126
Braconidae), C. carnea, Orius strigicollis (Poppius) (Hemiptera: Anthocoridae),

Aphidoletes aphidimyza (Rondani) (Diptera: Cecidomyiidae), Amblyseius cucumeris
(Oudemans) (Acari: Phytoseiidae) y P. persimilis, flubendiamida resultó selectivo a una
dosis comprendida entre 100-400 mg i.a./l, valores muy superiores a la dosis
comúnmente empleada en España en cultivos hortícolas, que es de 60 mg i.a./l. Si en
laboratorio flubendiamida fue inocuo, su selectividad en semi-campo y campo está
asegurada como reportaron Ebbinghaus y colaboradores (2007) en los agentes de
biocontrol, C. septempunctata, Forficula auricularia L. (Dermaptera: Forficulidae),
Cantharis spp. (Coleoptera: Cantharidae), Liocoris tripustulatus (Fabricius) (Hemiptera:
Miridae), Anthocoris nemoralis (Fabricius) (Hemiptera: Anthocoridae), M. pygmaeus y
ácaros fitoseidos.
Según la revisión de Williams y colaboradores (2003), spinosad es un compuesto

menos selectivo para parasitoides que para depredadores. Numerosos estudios
realizados en laboratorio con diferentes formas de exposición (tópica, residual e
ingestión) han descrito efectos letales o subletales en los parasitoides A. colemani,
Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera: Braconidae), Hyposoter didymator (Thunberg)
(Hymenoptera: Ichneumonidae), Psyttalia concolor (Szepligeti) (Hymenoptera:
Braconidae), T. chilonis y Bracon hebetor Say (Hymenoptera: Braconidae) (Viñuela et
al., 2001; Takahashi et al., 2005; Khan et al., 2009; Hussain et al., 2010; Stara et al.,
2011). Sin embargo, según la revisión de Biondi y colaboradores (2012b), también
existen estudios que muestran la baja selectividad de spinosad sobre depredadores en
laboratorio, variando los resultados en función de la especie, estado a evaluar o forma
de exposición.
En nuestro estudio spinosad no resultó selectivo para ninguno de los chinches

depredadores evaluados, cuando se expusieron a su residuo fresco sobre placas de
cristal en laboratorio a una dosis de 120 mg i.a./l. En el caso particular de O. laevigatus,
spinosad fue clasificado como moderadamente tóxico en adultos y tóxico para ninfas
N2. Resultados coincidentes se observaron en laboratorio cuando ninfas N2 y adultos de
O. laevigatus fueron expuestos por contacto residual a dosis comprendidas entre 75-250
mg i.a./l (Van de Veire et al., 2002 b; Van de Veire & Tirry, 2003). Para otra especie
perteneciente al género Orius, spinosad tampoco resultó selectivo bajo diferentes
formas de exposición. Torres y colaboradores (2007a,b) describieron como en ensayos
127
de laboratorio se produjo una mortalidad comprendida entre el 40-85 % cuando ninfas y

adultos de O. insidiosus se expusieron tópicamente a una dosis de 144 mg i.a./l. Por otro
lado, Studebaker y Kring (2003) registraron mortalidades por encima del 78 % cuando
ninfas N3 y adultos de O. insidiosus se expusieron por contacto residual sobre placas
Petri a una dosis comprendida entre 90-199 g i.a./ha. Sin embargo, cuando se expone a
las mismas dosis residuales de spinosad en ensayos de semi-campo y campo, parece ser
selectivo y no afectó a ninfas N3 y adultos de O. insidiosus en algodón (Studebaker &
Kring (2003), o a ninfas N1, N2 de O. laevigatus en semi-campo, cuando plantas de
judía verde se pulverizaron a una dosis de 192 mg i.a./l (Miles, 2006). Esto es indicativo
que la selectividad a este insecticida está influenciada por factores abióticos como la
radiación solar (Van de Veire et al., 2002b, 2004), ya que es la principal vía de
degradación de spinosad sobre superficies vegetales (Dripps et al., 2011).
En el caso de N. tenuis, la mortalidad registrada fue menor, aunque spinosad fue

clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2. Mortalidades iguales a las
registradas en ninfas N2 de N. tenuis (40 %), fueron encontradas en ninfas N2 y N3 del
también mírido M. pygmaeus cuando fueron expuestas por contacto residual a una dosis
inferior (100 mg i.a./l) a la de nuestro estudio en laboratorio (120 mg i.a./l) (Van de
Veire & Tirry, 2003). Por otro lado, en el estudio llevado a cabo por Arnó y
colaboradores (2011), spinosad resultó ser selectivo para los chinches depredadores M.
pygmaeus y N. tenuis, tras su exposición al residuo fresco del insecticida a una dosis
igual a la empleada en nuestro ensayo (120 mg i.a./l). Sin embargo, se debe tener en
cuenta que el estudio se realizó bajo condiciones de exposición más reales, laboratorio
extendido sobre plantas de tomate, y por lo tanto es de esperar un menor efecto del
insecticida. Aún así, Arnó y colaboradores (2011) observaron una reducción de la
descendencia que no fue encontrada en nuestro estudio. Este resultado podría ser
explicado por el comportamiento zoofitófago de M. pygmaeus y N. tenuis (Arnó et al.,
2006; Sánchez et al., 2006), ya que al alimentarse de la planta podrían estar más
expuestos a las toxinas del compuesto.
128
El compuesto perteneciente a la segunda generación de la clase química de los ácidos

tetrónicos espirocíclicos, spiromesifen, resultó ser selectivo e inocuo tanto a adultos,
como a ninfas N2 de O. laevigatus y N. tenuis cuando se expusieron a su residuo fresco
sobre placas de cristal en laboratorio, a una dosis de 144 mg i.a./l. Según Nauen y
colaboradores (2005), el principal modo de acción de este insecticida es por contacto,
debido a que su alta lipofilicidad le permite adherirse a las ceras de las hojas, por lo que
en laboratorio cuando es pulverizado sobre sustrato inerte los resultados podrían estar
infraestimados. No obstante, resultados similares a los obtenidos en nuestro estudio de
laboratorio también se observaron en ensayos de campo realizados por Bielza y
colaboradores (2009), en los que tanto la densidad de población, como la actividad de
O. laevigatus, no se vio afectada cuando spiromesifen fue aplicado foliarmente sobre
plantas de pimiento a una dosis igual a la empleada en nuestro estudio (144 mg i.a./l).
En línea con los resultados anteriores, la tercera generación perteneciente a la clase
química de los ácidos tetrónicos espirocíclicos, spirotetramat, también se mostró muy
selectivo en estudios de semi-campo y campo sobre los depredadores A. nemoralis, M.
pygmaeus, O. insidiosus, y los parasitoides Aphelinus mali (Haldeman) (Hymenoptera:
Aphelinidae), Aphytis lingnanensis Compere (Hymenoptera: Aphelinidae),
Coccidoxenoides spp. (Hymenoptera: Encyrtidae) y Trichogramma cryptophlebiae
Nagaraja (Hymenoptera: Trichogrammatidae) (Schnorbach, et al., 2008; Brück et al.,
2009). Sin embargo, al igual que spiromesifen, ambos insecticidas no se han mostrado
tan selectivos con los ácaros depredadores P. persimilis, Galendromus occidentalis
(Nesbitt) (Acari: Phytoseiidae), Typhlodromus pyri Scheuten (Acari: Phytoseiidae) y
Kampimodromus aberrans (Oudemans) (Acari: Phytoseiidae), debido a su buena
actividad acaricida (Cloid et al., 2006; Saénz de Cabezón et al., 2006; Schnorbach, et
al., 2008; Brück et al., 2009).
129
En nuestro estudio, abamectina, spinosad y emamectina resultaron ser más

persistentes para los adultos de O. laevigatus que para los de N. tenuis. La divergencia
de resultados entre las dos especies de chinches depredadores pudiera ser atribuida en
parte a las diferentes condiciones de radiación bajo las cuales se realizaron los estudios
(misma época del año en dos años consecutivos). En el ensayo llevado a cabo con N.
tenuis se registró una mayor radiación puntual media UV en el interior del invernadero
(78,4 mol/m2*s), en comparación con la registrada en el ensayo con O. laevigatus
(41,9 mol/m2*s) (Figuras 109 y 111), lo que pudo contribuir a una diferente velocidad de
degradación de los compuestos, ya que todos ellos tienen tendencia a una rápida
fotodegradación sobre la superficie de la hoja (Willis & Mc Dowell, 1989; Prabhu et al.,
1991; Feely et al., 1992; Wrzesinski et al., 1996; Thompson et al., 1997; Dripps, et al.,
2011; Amor et al., 2012b). De hecho, Van de Veire y colaboradores (2004) describieron
como para el parasitoide E. formosa, la selectividad de abamectina y spinosad variaba
en función de la localización y época del año en la que se realizaban los ensayos, ya que
cuanto mayor era la radiación solar registrada en los mismos, los compuestos resultaban
más selectivos. Otro factor a tener en cuenta es el diferente sustrato empleado en los
estudios, planta de pimiento para O. laevigatus y planta de tomate en el caso de N.
tenuis, pues la eficacia de los insecticidas puede verse afectada por las interacciones que
se pudiesen crear con la planta por diferencias en la pilosidad de la hoja o ceras de la
cutícula (Croft, 1990). Además y como se ha visto en los ensayos mediante contacto
residual en laboratorio, puede existir también una razón fisiológica, pues O. laevigatus
mostró una mayor sensibilidad a los insecticidas que N. tenuis, de modo que su
capacidad para detoxificar los compuestos pudiera ser menor.
Por otro lado, el piretroide sintético deltametrina fue clasificado como persistente para
O. laevigatus, mientras que para N. tenuis no lo fue. Resultados coincidentes se
describieron en los estudios llevados a cabo por Olivares (2012) y Wanumen (2012) en
O. laevigatus y N. tenuis, respectivamente. En ambos ensayos se evaluó en la primavera
del 2012 la persistencia de deltametrina sobre plantas de tomate, siguiendo una
metodología similar a la empleada en nuestro estudio. Para O. laevigatus el residuo de
deltametrina fue evaluado a los 0, 5, 7 y 14 días, produciendo un 100 % de mortalidad
130
tras 72 horas de exposición en todos los casos. Sin embargo, en el caso de N. tenuis no
se observó ningún efecto deletéreo tras exponerse al residuo de 4 días de deltametrina.
En el medio ambiente los piretroides pueden ser degradados por medio de diferentes
procesos, fotodegradación, biodegradación ó hidrólisis, y entre ellos, la fotodegradación
es el proceso más común (Liu et al., 2010b). En nuestro caso, la divergencia de
resultados entre ambas especies de chinches depredadores no puede ser explicada en su
totalidad por este proceso, ya que los ensayos realizados por Olivares (2012) y
Wanumen (2012) se llevaron a cabo en la misma época y año (primavera del 2012), y
aún así los resultados fueron coincidentes a los descritos en nuestros estudios llevados a
cabo en otoño. Por otro lado, la eficacia de deltametrina también puede verse afectada
por el tipo de hoja en el que se aplica (Chowdhury et al., 2005), aunque tampoco
explicaría la diferencia de toxicidad entre ambos enemigos naturales, ya que en el
estudio realizado por Olivares (2012) y Wanumen (2012), el resultado es coincidente al
observado en el nuestro estudio a pesar de que usaron el mismo sustrato vegetal, planta
de tomate. Por tanto, y en base a lo descrito anteriormente en nuestros ensayos de
laboratorio por contacto residual, la principal razón para explicar la diferencia de
resultados parece ser la menor capacidad de O. laevigatus para detoxificar el piretroide
deltametrina respecto N. tenuis.
131
Chapter 6
Chapter 6. Ecdysone agonist
6. ECDYSONE AGONISTS: ECOTOXICOLOGY ON

ORIUS LAEVIGATUS. INSECT TOXICITY BIOASSAYS
AND MOLECULAR DOCKING APPROACHES 1.
6.1. Introduction.
As it was already explained in chapters 1 and 5, knowledge of pesticide selectivity on

beneficial insects is necessary for a successful implementation of biological and
chemical control methods in IPM programs. Diacylhydrazine (DAH)-based insecticides
such as RH-5849, tebufenozide, and methoxyfenozide, also known as molting-
accelerating compounds (MACs), are more selective than conventional groups due to
their interference with specific insect targets, such as insects’endocrinological
pathways. They mimic the natural function of the insect molting hormone 20-
hydroxyecdysone (20E), and their activity is based on binding specifically to the
ecdysone receptor (EcR) of susceptible insects. They induce a premature lethal molting
in larval stages and aborting reproduction in adults, especially in Lepidoptera and
Coleoptera (Dhadialla et al., 1998, 2005; Pineda et al., 2007; Smagghe et al., 2013).
6.1.1. The ecdysone receptor.
The nuclear receptor superfamily is a group of transcription factors which are found in
all metazoans or Animalia. To date, no members of this protein superfamily have been
identified in plants, fungi, or unicellular eukaryotes (Laudet & Bonneton, 2005). They
are involved in a vast array of biological processes such as molting and metamorphosis
(Ashburner, 1973), embryonic development (King-Jones & Thummel, 2005), cell
differentiation (Siaussat et al., 2007) and reproduction (Raikhel et al., 1999). For that
reason, they are considered as important novel targets in pest control (Palli et al., 2005;
Billas et al., 2009). The morphogenetic events associated with insect development are
1
AMOR, F., CHRISTIAENS, O., BENGOCHEA, P., MEDINA, P., ROUGÉ, P., VIÑUELA, E. &
SMAGGHE G., 2012. Selectivity of diacylhydrazine insecticides to the predatory bug Orius laevigatus: In
vivo and modeling/docking experiments. Pest Manage. Sci., 18 (2): 1586-1594.
132
largely triggered by the action of a single class of steroid hormones, the ecdysteroids. It
has been established that among all insect orders the ecdysteroid-induced orchestration
of molting and metamorphosis is mediated by a heterodimer comprised of the EcR and
Ultraspiracle (USP). The heterodimer is stabilized by 20E and recognizes specific
promoter elements in the insect genome to regulate transcription (Heinrich, 2005).
The EcR is a member of the nuclear receptor superfamily, which is present in all
arthropods (Graham et al., 2007; Fahrbach et al., 2012), and recently some functional
orthologues have been discovered in a nematode as well (Shea et al., 2010). The basic
structure of typical nuclear receptors includes several modular domains (Figure 114): an
N-terminal region (A/B-domain), a DNA-binding domain (DBD, C-domain), a hinge
region (D-domain), a ligand-binding domain (LBD, E-domain) and in some cases also a
C-terminal F-domain (Kasuya et al., 2003). The A/B, D and F domains are usually
poorly conserved and their structure is unknown. In contrast, the DBD and LBD are
highly conserved and their structure has been determined for several receptors (Iwema
et al., 2009). The DBD contains two typical cysteine-rich zinc finger motifs in tandem
spanning about 80 amino acids which are involved in hormone response elements
(HRE) recognition (Thomson et al., 2009). The LBD is usually formed by 12 α-helices
numbered from helix-1 (H1) to helix-12 (H12), associated with a hairpin of two short β-
strands (β1 and β2) in the loop between helices H5 and H6 (Carmichael et al., 2005).
This domain is involved in receptor dimerization, ligand recognition and cofactor
interactions (Nakagawa et al., 2009). Moreover, the 12 helices pack together in three
antiparallel layers, and together with the β-strands, fully enclose the ligand-binding
pocket (LBP) (Hill et al., 2013), which binds ecdysteroids, as well as certain non-
steroidal ecdysone receptor agonists, such as the DAH-based insecticides (Tohidi-
Esfahani et al., 2011). Crystal structures of the LBD have provided important
information about ligand recognition and the activation mechanism of nuclear receptors.
In fact, homology models based on a comparison of the ecdysone receptor ligand-
binding domains (EcR-LBD) with known crystal structures have been employed to
determinate the three-dimensional (3D) structure of the EcR-LBD (Wurz, et al. 2000;
Kasuya et al., 2003), and docking studies have been carried out to simulate how a
candidate ligand binds to a receptor (Christiaens et al., 2010; Bengochea et al., 2012a,
2012b; Zotti et al., 2012a, 2012b).
133
Figure 114. Modular structure (domains) of the insects’ ecdysone receptor.
A/B C D E F
(Source, Bengochea, 2012c).
6.2. Objectives.
In the current study, the side-effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on

adults of O. laevigatus were tested in laboratory. Exposure of insects to a treated inert
surface (worst-case laboratory test) as well as ingestion tests (primarily mode of action
of MACs) was performed.
Next, the LBD of the EcR of O. laevigatus (OlEcR-LBD) was cloned and sequenced.
Then, a three dimensional (3D) model of the OlEcR-LBD was constructed to evaluate if
it exhibited the typical canonical structure with 12 α-helices, associated with a hairpin
of two short β-strands.
Subsequently, a docking experiment was carried out to elucidate the interactions

between the receptor ligand cavity and the natural 20E molting hormone. Finally, we
compared these with the DAH-based ecdysone agonist insecticides to provide a better
understanding of their selective activity on the predatory bug O. laevigatus.
134
6.3. Material and methods.
6.3.1. Chemicals.
The commercially available methoxyfenozide (Runner®, 24 % SC, Bayer, Madrid,

Spain), tebufenozide (Mimic 2F®, 24 % SC, Dow Agrosciences Ibérica S.A., Madrid,
Spain), as well as the technical grade compound RH-5849 (>95% pure, Rohm and Haas,
Spring House, PA) were used in the tests. A broad spectrum insecticide, deltamethrin
(Decis®, 2.5 % EC; Bayer, Madrid, Spain), was used as a positive commercial standard,
and distilled water as a control (Table 37). Solutions of every product were freshly
prepared prior to the assays in distilled water based on the maximum field
recommended concentrations (MFRC) on horticultural crops for methoxyfenozide,
tebufenozide and deltamethrin (De Liñán, 2011) and according to the manufacturer
instructions for RH-5849.
135
Table 37. Chemical tested in the experiments.
Maximun field Included in

Active ingredient Mode of action rate on Annex I
1 Concentration
(a.i.) Trade name/Company (IRAC) Target horticultural 91/414/CEE3
(mg a.i./l)
crops in Spain
(cc/hl) 2
Methoxyfenozide Runner 24 % SC Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera 40 96 Yes

Bayer compound
Tebufenozide Mimic 2F 24 % SC Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera, 75 180 Yes

Dow Agrosciences Ibérica compound
RH-5849 Technical product > 95 % Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera 75 180 No

compound
Deltamethrin Decis 2.5 % EC Sodium channel Lepidoptera, Diptera, Hemiptera, 50 12.5 Yes
Bayer modulator Thysanoptera, Coleoptera
EC, Emulsifiable concentrated; SC, Suspension concentrated; a.i., active ingredient.
1
IRAC ((Insecticide Resistance Action Committee). 2Formulated product (De Liñán, 2011).
3
Pesticides included in the Annex I of the European Directive 91/414/EEC transferred to the Annex I of the Regulation Nº 1107/2009 (MAGRAMA, 2013a).
136
6.3.2. Insects bioassays.
The residual exposure test procedure was similar to that described in chapter 5: adults
were exposed to fresh pesticide residue using the dismountable test cages designed by
Jacas & Viñuela (1994). The floor and ceiling of the cages, consisting of glass plates
(12 X 12 X 0.5 cm), were treated with the chemicals under a Potter precision spray
tower. Five replicates per treatment and the control with 15 adults each were used.
Adult mortality was recorded after 72 hours.
In order to assess the reproductive parameters, survivors were individually sexed under
a binocular microscope and groups of three couples were transferred to ventilated
plastic cages (11.5 cm in diameter, 5 cm high). Insects were fed ad libitum with E.
kuehniella eggs and provided with green beans as a source of water and oviposition
substrate, which were changed every two days for a 6-day period in total. The
cumulative number of eggs per female at the end of the 6-day period was used to
evaluate fecundity. The percentage of egg hatch, approximately 7 days after oviposition,
was used to evaluate fertility. Four replicates were done per compound and control.
Exposure via ingestion: thin layers of E. kuehniella eggs, placed in Petri dishes (4 X 4
cm), were treated under the Potter precision spray tower. Groups of 15 adults were kept
in ventilated plastic cages (11.5 cm in diameter, 5 cm high) and fed with the treated E.
kuehniella eggs during three consecutive days. Control groups were supplied with
untreated eggs only. Effects on mortality and reproductive parameters were assessed as
described above.
6.3.3. EcR-LBD sequence.
Adults of O. laevigatus were used to extract total RNA using TRI Reagent (Sigma-
Aldrich, Bornem, Belgium), based on the single-step liquid phase separation method
(Chomeczynski, et al., 1987). The quality and quantity of the extracted RNA was
examined by gel electrophoresis and spectrophotometry using a Nanodrop™ ND-1000
(Thermo Fisher Scientific BVBA, Asse, Belgium). Subsequently, first strand cDNA
was synthesized using SuperScript™ II reverse transcriptase (Invitrogen NV,
137
Merelbeke, Belgium) with the oligo(dT)12–18 primers according to the manufacturer’s

protocol.
The OlEcR-LBD coding sequence was then determined through a number of

Polimerase Chain Reaction (PCR) reaction steps (Sensoquest labcycler, Sensoquest
GmbH Göttingen, Germany). The specific conditions of PCR reaction steps are shown
in table 38. Partial sequences of the LBD were obtained using degenerate and specific
primers (Table 39) located in the coding sequence of the LBD and DBD of the receptor
and designed using Primer3 software (Rozen & Skaletsky, 2000). The design of the
degenerate primers was based on known EcR sequences from different Mecoptera,
Trichoptera, Strepsiptera, Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera and Diptera insect
species. Gene specific primers were designed in the partial sequence obtained with the
degenerate primers. PCR products were purified using the Cycle Pure kit (Omega Bio-
Tek, Norcross, GA). After purification, samples were sent for sequencing (Agowa,
Berlin, Germany).
Table 38. Specific conditions of PCR reaction steps for determining the OlEcR-LBD sequence.
Fragments Primers l primer/10 l Denaturation Annealing Extension Phases

PCR reaction (tª (ºC) / t (sec.) (tª (ºC) / t (sec.) (tª (ºC) / t (sec.) total
Fragment 1 degen. F2-

degen. R3 0.2-0.2 94/30 49/30 72/35 32
(LBD)
Fragment 2 degen. F4-
spec. R2 0.2-0.8 94/30 53/30 72/55 32
(DBD and LBD)
Fragment 3 spec. F2-
degen. R3 0.4-0.4 94/30 49/30 72/35 32
(LBD)
Bridge fragment spec. F3-
(LBD) spec. R3 0-4-0.4 94/30 49/30 72/45 32
cloning F1-
Cloning cloning R1 1-1 94/30 60/30 72/30 32
138
Table 39. Degenerate and specific primers used to complete the OlEcR-LBD coding sequence.
Fragments Forward primer Reversed primer

Fragment 1
5´-GAAGTNATGATGYTNMGNATG-3´ 5´-ACGTCCCAKATYTCWKCNARVAA-3´
(LBD)
Fragment 2
5´-TGCGGHGAYMGDGCNTCYGG-3´ 5´-CCGACAGAATATGAGAAGGT-3´
(DBD and LBD)
Fragment 3
5´-CGTAGTCGAAAACCTTCTCA-3´ 5´-ACGTCCCAKATYTCWKCNARVAA-3´
(LBD)
Bridge fragment
5´-CCATCGGCTTGTCTACTTT-3´ 5´-CTTGGATCTTCTCGACTTTC-3´
(LBD)
Cloning 5´-AAGAGTCACAAAAACCAACG-3´ 5´-AGCTTGAGTGAGAAGCACAT-3´
Afterwards, the whole fragment was cloned and sequenced for confirmation. The same
O. laevigatus cDNA as used for identification of EcR-LBD was used for the initial PCR
reactions of the cloning. Subsequently, the PCR products were ligated into a pGEM-T
vector (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer’s instructions. Then,
plasmids were transformed in competent Escherichia coli XL-1 Blue Cells by heat
stock and then plated out on an ampicilin-containing lisogeny broth agar plate. After 16
h incubation, formed colonies (Figure 115) were checked by colony PCR (Figure116) and
several of these positive colonies were then purified using Plasmid mini prep kit
(Omega Bio-Tek) and sent for sequencing (Agowa).
Figure115. Formed bacteria on an Figure 116. Ethidium bromide-stained

ampicilin-containing LB agar plate. colony PCR.
139
The EcR-LBD sequences of several arthropods and two human orthologs of EcR were
retrieved by Blast searches against the Genbank database. The chosen sequences were
then aligned by CLUSTALW2/CLUSTALX2 (Larkin et al., 2007) and the phylogenetic
trees were designed using MEGA4 software (Tamura et al., 2007) Bootstrap analysis
with 1.000 replicates for each branch position was used to assess support for nodes in
the tree (Felsenstein, 1985).
Figure 117. Nucleotides and amino acids sequence of O. laevigatus.
Nucleotides sequence:
TTGCGGGGGATCCGGGCGTCCGGTTACCATTACAATGCCCTTACTTGTGAGGGTTGTAAAGG
TTTTTTCCGGCGGAGTATAACGAAAAACAACGTTTACCAGTGCAAGTACGGAAACAACTGCG
AGATCGACATGTACATGCGAAGAAAATGTCAAGAATGTCGGCTCAAAAAATGCCTATCGGT
CGGGATGAGGCCAGAATGCGTAGTGCCCGAATATCAGTGCGCTGTGAAAAGAAAAGAAAAG
AAAGCTCAAAAAGACAAAGACAAACCGGTGTCGACGACGAATGGGTCGCCCGAGGCTATCA
AAGTCGAACCTGAACCTCATAGGGTCAGTTACACATCAAGTCTCTTTCAATCTATGATCAAA
GAGTCACAAAAACCAACGACCGACACAGAGTTGGCAAAACTACCGGTGAATGGTGTCAAAC
AAGTCAGCGCCGAACAGGAAGAACTCATCCATCGGCTTGTCTACTTTCAAAATGAGTTCGAA
CACCCTTCGGAAGAAGACGTTCGCAGAATTAATGCTCCTAATGACAATGAAGAACAAAGTG
ATCTGAAGTTCCGACATATAACTCAAATAACGATACTCACTGTACAGCTTATAGTCGAATTC
GCCAAACGGCTTCCTGGGTTCGACAAACTACTTAGAGAAGATCAAATAGCTTTGTTAAAAGC
ATGTTCTAGTGAAGTAATGATGTTAAGAATGGCGAGACGATATGACGCACAATCCGATTCTA
TCCTTTTCGCAAATAACCAACCCTACACCCGAGATTCATACACGATGGCCGGAATGGGTGAC
GTAGTCGAAAACCTTCTCATATTCTGTCGGCATATGTACCACATGAAAGTTGACAATGCCGA
GTATGCTCTTCTTACTGCCATCGTTATATTTTCAGAACGACCTTCATTGACGGAAGGCTGGAA
AGTCGAGAAGATCCAAGAGATTTATTTAGAAGCATTGAAATCGTACGTTGATCATCGAGCGA
AGCCTAGGTCGCCGACAATATTCGCGAAGCTCCTTTCAGTCCTGACTGAGCTGAGGACTCTC
GGAAACCAAAACAGCGAGATGTGCTTCTCACTCAAGCTTCAAAACCGAAAGCTCCCTCCATT
GCTCGCAGAAATCTGGGA
Amino acids sequence:
LRGIRASGYHYNALTCEGCKGFFRRSITKNNVYQCKYGNNCEIDMYMRRKCQECRLKKCLSVG
MRPECVVPEYQCAVKRKEKKAQKDKDKPVSTTNGSPEAIKVEPEPHRVSYTSSLFQSMIKESQKP
TTDTELAKLPVNGVKQVSAEQEELIHRLVYFQNEFEHPSEEDVRRINAPNDNEEQSDLKFRHITQI
TILTVQLIVEFAKRLPGFDKLLREDQIALLKACSSEVMMLRMARRYDAQSDSILFANNQPYTRDS
YTMAGMGDVVENLLIFCRHMYHMKVDNAEYALLTAIVIFSERPSLTEGWKVEKIQEIYLEALKS
YVDHRAKPRSPTIFAKLLSVLTELRTLGNQNSEMCFSLKLQNRKLPPLLAEIW
140
6.3.4. Confirmation of expression of EcR in nymphs.
A mixture of O. laevigatus nymphs of different stages was used to extract the total RNA
and subsequently cDNA was synthesized following the same procedure described
before. The expression of the EcR in O. laevigatus nymphs was investigated by PCR
using specific primers designed to obtain the bridge fragment of the LBD.
6.3.5. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies.
Homology modeling of the OlEcR-LBD was performed with the YASARA Structure
program (Krieger et al., 2002) running on a 2.53 GHz Intel core duo Macintosh
computer. Different models were built from the X-ray coordinates of the EcR of H.
virescens in complex with synthetic ligands (PDB code 3IXP), the RXR-USP receptor
of Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) bound to ponasterone A
(P1A; PDB Code 2NXX, insect steroid hormone involved in regulating metamorphosis)
(Iwema et al., 2007), the EcR-LBD of the hemiptera B. tabaci complexed to P1A (PDB
code 1Z5X) (Carmichael et al., 2005), and the EcR-USP of H. virescens in complex
with 20-hydroxyecdysone (20E; PDB code 2R40) (Browning et al., 2007), used as
templates, respectively. The identity in amino acids in the LDB between OlEcR-LBD
and the corresponding region of H. virescens, T. castaneum and B. tabaci is 63, 84 and
80%, respectively. Finally, a hybrid model was built up from the four previous models.
PROCHECK (Laskowski et al., 1993) was used to assess the geometric quality of the
three-dimensional model. In this respect, all of the residues of OlEcR-LBD were
correctly assigned on the allowed regions of the Ramachandran plot (result not shown).
Using ANOLEA (Melo et al., 1998) to evaluate the models, a single stretch of four
residues (3LPVN6) over 235, corresponding to the disordered N-terminal end of
OlEcR-LBD, exhibited energy over the threshold value. Molecular cartoons were drawn
with YASARA and PyMol (W.L. DeLano, http://pymol.sourceforge.net). Docking of
20E, P1A, tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 to OlEcR-LBD was performed
with the YASARA structure program. Clipping planes of OlEcR-LBD complexed to
20E, P1A, tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 were rendered with PyMol.
141
6.4. Results.
6.4.1. Efficacy and toxicological effects of methoxyfenozide,

tebufenozide and RH-5849.
Details of the biological activity of the treatments against adults of O. laevigatus are
given in figures 118-120. Residual and ingestion exposure to methoxyfenozide,
tebufenozide and RH-5849 during 72 hours did not cause any loss of survival (P>0.05)
over the controls. However, 100% of adults died after 24 hours in both experiments
when exposed to deltamethrin.
Figure 118. Percentage of O. laevigatus mortality after 72 hours during the two performed experiments.
Residual contact (glass) Ingestion exposure
100
b 100
b
% M o r ta lity a fte r 7 2 h
% M o r ta lity a fte r 7 2 h
80 80
60 60
40
a a 40
a
a a a
20 20 a a
0 0
R H -5 8 4 9
R H -5 8 4 9
M e th o x y fe n o z i d e
M e th o x y fe n o z i d e
D e lta m e th ri n
D e lta m e th ri n
C o n tro l
C o n tro l
T e b u fe n o z id e
T e b u fe n o z id e
Data followed by the same letter are not significantly different (P≥0.05).
142
In addition, no sublethal side-effects of the three DAH-based insecticides on

reproductive parameters were observed in both assays (P≥0.05).
Figure 119. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fecundity during
the two carried out experiments.
10 10
8
a a 8
a
E g g s /f e m a le /d a y
E g g s /f e m a le /d a y
6
a 6
a a
a a
4 4
2 2
0 0
Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849
Figure 120. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fertility during the
two carried out experiments.
100
a a
100
a a a
a a a
80 80
(% ) E g g ha tch
(% ) E g g ha tch
60 60
40 40
20 20
0 0
Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849
Based on these results, we decided to investigate the mechanism of DAHs selectivity

towards O. laevigatus at molecular level using modeling and docking experiments.
143
6.4.2. OlEcR-LBD sequence, phylogenetic tree and expression in

nymphs.
The cDNA encoding the LBD from OlEcR-LBD was cloned in order to obtain the
sequence. However, it should be noted that the N-terminal end of the LBD was not
completely obtained in spite of intensive efforts using the 3´RACE (Rapid
Amplification of cDNA Ends-PCR) system kit (Invitrogen, NV, Merelbeke, Belgium).
The last two residues of the LBD were lacking. Thus, a consensus sequence of other
hemipteran species, such as M. persicae, Nezara viridula (L.) (Hemiptera:
Pentatomidae), Nilaparvata lugens (Stål) (Hemiptera: Delphacidae), Acyrthosiphon
pisum (Harris) (Hemiptera: Aphididae) and B. tabaci, were used for our modeling
analysis. Figure 121 shows a multiple alignment with the amino acid sequence of
OlEcR-LBD, together with the EcR-LBD from most other known hemipteran species,
and several members from other insect orders. OlEcR-LBD exhibits some amino acid
substitutions in positions where conservation is usually very high throughout the class
of Insecta. These residues are marked on the figure with blue dots (residues at position
54 in helix 3; 132 in helix 7; and 227 in helix 11). In addition, amino acids involved in
the ligand binding are marked by red dots (Kasuya et al., 2003).
144
Figure 121. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including
OlEcR-LBD (helix 1 to 12). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster,
AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera
(TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera,
NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR:
Orius laevigatus, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Blue dots indicate amino acid
substitutions in OlEcR-LBD sequence in positions where conservation is usually very high throughout
the insect class. Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD
(Kasuya et al., 2003). Green dots indicate hydrophilic, hydrophobic or aromatic residues involved in the
ligand anchorage into the pocket. The figure has been prepared using CINEMA (Colour Interactive
Editor for Multiple Alignments, Utopia, http;//cs.man.ac.uk/utopia/).
145
As shown in figure 122, phylogenetic trees of the EcR-LBD, including various species
from several insect orders such as Diptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Hemiptera,
Orthoptera, Coleoptera together with a number of Crustacea and Chelicerata, group
OlEcR-LBD together with the Hemiptera, close to N. viridula EcR-LBD. Maximum
parsimony trees also confirmed this result (data not shown). Moreover, the EcR-LBDs
of Hemiptera, Hymenoptera, Coleoptera, Phthiraptera, Blatodea and Orthoptera
clustered away from Mecopterida superorder (which includes Lepidoptera and Diptera
orders).
Figure 122. Phylogenetic tree of EcRs. This tree was constructed with the neighbor-joining method using
the amino acid sequences of the LBD of the selected sequences. Bootstrap values as percentage of a 1000
replicates >50 are indicated on the tree.
146
RT-PCR from RNA extracted from mixed nymphal stages of O. laevigatus also
confirmed the expression of the EcR gene in this developmental stage (Figure 123).
Figure 123. Expression of EcR in adults and nymphs of O. laevigatus. Agarose gel electrophoresis of
amplified EcR fragment using cDNA from nymphs and adults.
Additionally, we also attempted to sequence the EcR-LBD of another important

predatory bug, the mirid N. tenuis. In the literature there is no information on the effects
of MACs on this species, but our recent experiments show similar results to those in O.
laevigatus. DAHs are devoid of any deleterious effect on N. tenuis (Figure 124) and it
should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the
sequence for the LBD. However, a partial sequence of the LBD was obtained,
specifically a region between helix 6-helix 11 (Figure 124). A strong conservation
between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. There were some
differences in the amino acids involved in binding with the ligand, however, these were
not structurally different. Therefore, the structure of the LBP could be expected to be
similar as well, but a definite conclusion concerning N. tenuis cannot be reached.
147
Figure 124. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including N.
tenuis (NtEcR-LBD) and OlEcR-LBD (Helix 6 to 11). In the following order: Diptera (DmEcR:
Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR:
Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor);
Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia
tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, NtEcR: Nesidiocoris tenuis, ApEcR:
Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Red dots indicate the amino acids involved in the ligand
binding in the EcR-LBD (Kasuya et al.,2003).
148
6.4.3. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies.
The EcR-LBD of the predatory bug O. laevigatus, as modeled from the X-ray
coordinates of different insect LBDs, exhibited the canonical 3D-conformation of the
LBD of arthropod EcR built up of twelve α-helices (labeled H1-H12) associated with a
short hairpin of two β-strands β1 and β2 (Figure 125 a). The model strikingly resembles
that of T. castaneum RXR-USP used as one of the templates (PDB code 2NXX) (Figure
125 b) even though the loop that connects α-helix H2 to α-helix H3 was not correctly X-
ray solved and is lacking from the 3D-structure of the RXR-USP. Helices H2, H3, H5,
H8 and H11 in OlEcR-LBD delineated a ligand-binding cavity which usually
accommodates the natural insect molting hormone 20E (Figure 125 c) and also the P1A
molecule (Figure 125 e). Docking experiments performed with these two ecdysteroids
yielded a typical H-bonding scheme the OlEcR-LBD shares with other arthropod EcR-
LBDs. Both 20E and P1A interacted with the LBD-pocket via a network of six
hydrogen bonds, involving the hydrophilic residues glutamic acid 14, threonine 44,
threonine 47, alanine 102 and tyrosine 112. In addition, hydrophobic and stacking
interactions occur with hydrophobic (methionine 209, cysteine 210, methionine 117)
and aromatic residues (phenylalanine 101, tyrosine 107, tryptophan 228) located at the
periphery of the ligand-binding cavity to complete the ligand anchorage into the pocket
(Figure 125 d, f).
149
Figure 125. Overall three-dimensional (3D) conformation of the modeled EcR-LBD domain of the
predatory bug O. laevigatus (a) compared to LBD structure of the RXR-USP of T. castaneum (b). The
twelve α-helices distributed along the polypeptide chain are numbered H1-H12 and the two β-strands β1
and β2 forming a protruding hairpin motif are indicated. N and C indicate the N-terminal and C-terminal
ends of the polypeptide chain, respectively. (c) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-
LBD harboring 20-hydroxyecdysone (20E) (pink stick). (d) Network of hydrogen bonds (dashed dark
lines) anchoring 20E to the OlEcR-LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand
by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled
according to the 3D-model built for the OlEcR-LBD. (e) Clip view across the ligand-binding pocket of
the OlEcR-LBD harboring ponasterone A (PA1) (pink stick). (f) Network of hydrogen bonds (dashed
dark lines) anchoring P1A to the LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by
hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according
to the three-dimensional model built for OlEcR-LBD.
150
However, upon docking of tebufenozide (Figure 126 g) to the ligand-binding cavity of the
OlEcR-LBD, more or less severe steric hindrances were shown to occur, especially with
residues methionine 85, valine 120, leucine 125, glutamine 205, asparagine 206 and
methionine 209, that form the wall of one of the two lobes of the ligand-binding cavity
in which the ethyl-phenyl ring of tebufenozide becomes inserted. Also for the closely-
related methoxyfenozide, a rather similar steric hindrance was observed upon docking
of the ecdysone agonist in which the methoxy group of the agonist becomes inserted
(Figure 126 h). Upon docking of the agonist RH-5849 (Figure 126 i), a less severe steric
hindrance occurs with the ligand-binding cavity, involving residues methionine 85,
Leucine 124 and Asparagine 206, owing to the lack of any substituent linked to the
phenyl ring of this agonist.
Figure 126. (g) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring tebufenozide
(blue stick). Note the steric clash ( ) of the ethyl group at the phenyl ring of tebufenozide with the wall
of the ligand-binding pocket. (h) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD
harboring methoxyfenozide (blue stick). Note the steric clash ( ) of the methoxy group at the phenyl
ring of methoxyfenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (i). Clip view across the ligand-
binding pocket of the OlEcR-LBD harboring RH-5849 (blue stick). Note the steric clash ( ) of the
phenyl ring with the wall of the ligand-binding pocket, that is less severe compared with tebufenozide
and methoxyfenozide.
These docking experiments suggest that DAH-based insecticides like tebufenozide,

methoxyfenozide and RH-5849 are likely to exert no deleterious effect on the predatory
bug O. laevigatus, which supports the previous reported experimental data from
biological activity tests performed with both insecticidal molecules.
151
6.5. Discussion.
The DAH-based ecdysone agonist insecticides are active against several economically
important lepidopteran and coleopteran pests, and considered as environmentally
friendly compounds with an excellent margin of safety to non-target organisms
(Dhadialla et al., 1998, 2005). Consequently, these pesticides are usually included in
IPM (Integrated Pest Management) programs targeting different pests and crops all over
the world.
Based on their mode of action, a significant effect on survival must not be expected
when adults of natural enemies are exposed to pesticide residues or fed with treated diet.
In the literature there are many studies supporting the compatibility of both adults and
nymphs of predatory hemipterans with MAC pesticides (Smagghe & Degheele, 1995;
Tedeschi et al., 2002; Elzen, 2001; Baur et al., 2003; Studebaker & Kring, 2003; Van de
Veire & Tirry, 2003). In agreement with this, in our study, methoxyfenozide,
tebufenozide, and RH-5849 were harmless to adults of O. laevigatus at short-term.
Other beneficials belonging to different insect orders, as well as pollinators, also seem
to be compatible with MAC pesticides (Mommaerst et al., 2006; Bueno et al., 2008;
Giolo et al., 2008; Schneider et al., 2008; Carmo et al., 2010).
MACs beside their role in metamorphosis, are also essential in insect reproduction by
taking part in vitellogenesis, ovulation and spermatocyte growth (Chapman, 1998). In
our study, reproduction capacity of O. laevigatus females was similar to that of the
control, which is in agreement with previous studies on this species (Van de Veire et al.,
1996; Angeli et al., 2000, 2005; Van de Veire & Tirry, 2003). However, reproductive
disturbances such as a lower fecundity in D. brevis (Kim et al., 2006) or a higher
number of egg batches in Picromerus bidens L. (Hemiptera: Pentatomidae) were
observed after methoxyfenozide exposure (Mahdian et al., 2007).
Pharmacokinetics and metabolic detoxification of compounds could play an important

role in determining the biological spectrum of DAH-based ecdysone agonists (Smagghe
& Degheele, 1994; Medina et al., 2002; Giolo et al., 2008). The latter molecular studies
are consistent with the concept that an important process in the selectivity of these
152
compounds is the specific binding of the MACs to the target EcR that is governed by a
lock-and-key principle (Dhadialla et al., 2005). For instance, the binding affinity is high
in targeted Lepidoptera pests, whereas binding is low or not detectable in non-targeted
insects (Carlson et al., 2001). In agreement with these results, previous studies have
found tebufenozide to have an extremely low affinity for hemipteran EcRs belonging to
the Sternorrhyncha, namely B. tabaci and M. persicae (Carmichael et al., 2005; Graham
et al., 2007). In this respect, it appears that differences in the architecture of LBP may
provide the differential binding affinities of the DAH-based compounds among
different taxonomic orders (Carmichael et al., 2005). Consequently, for those non-
sensitive insects such as O. laevigatus, it is expected that differences at LBP level may
hinder the MACs´ binding.
The amino acid residues involved in the ligand binding with the OlEcR-LBD are
indicated in figure 121. OlEcR-LBD exhibits a high conservation among these ligand
binding-involved residues compared to other insects that show no or low susceptibility
for MACs. In contrast, in Lepidoptera, which show a high sensitivity for tebufenozide
and methoxyfenozide, we observed that the residues isoleucine 55, methionine 97 and
isoleucine 108 are replaced by methionine 55 and two valines residues (97, 108),
respectively. In particular, the presence of an isoleucine at position 55 in non-sensitive
species generates steric hindrance between the γ-methyl group of the isoleucine-residue
and the C5-methyl group at the B-ring of the tebufenozide or the C4-ethyl group of its
B-ring, depending on the orientation of the tebufenozide molecule (Wurtz et al., 2000).
In addition to these differences, we observed other substitutions in amino acids involved
in the ligand-binding. Proline 48, isoleucine 222 and lysine 227 are conserved in
lepidopteran BmEcR and HvEcR, but replaced in OlEcR by amino acids that are
structurally different: lysine 48, phenylalanine 222 and glutamine 227 (Figure 121).
Moreover, our docking results suggest that due to the restricted extent of the ligand-
binding cavity, a steric clash occurred upon docking of tebufenozide, methoxyfenozide
and RH-5849 to the ecdysone-binding site of the LBD (Figures 126 g, h, i). An
examination of the amino acid composition surrounding the restricted cavity allowed us
to identify those amino acids that may play a role in this restriction. In particular,
residues threonine 129 and isoleucine 130, present in TcEcR and TmEcR, and
isoleucine 130 present in BmEcR and HvEcR, are replaced by valine in O. laevigatus
(Figure 121). We suggest that these combined differences could explain the lack of
153
toxicity of the DAHs against the predatory bug, O. laevigatus. However, it should also
be noted here that, owing to the intrinsic flexibility of the amino acids involved in the
steric hindrance with tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849, some
accommodation of the DAH agonists to the ligand-binding cavity of OlEcR-LBD
should be achieved, which could prevent the most severe steric clash from occurring. In
this respect, the binding of ecdysone to the ultraspiracle protein from H. virescens
(Billas et al., 2001) was shown to depend on an induced fit mechanism. The plasticity
responsible for the promiscuous character of the LBP for different agonists and
antagonists, was further stressed by Billas et al., (2003, 2005). As a result, the steric
discrepancies occurring upon binding of tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849
to the binding pocket of OlEcR-LBD are an important, but likely not the sole,
explanation for the non-toxicity of these agonists to O. laevigatus.
154
Chapter 7
7. Conclusions
7. CONCLUSIONS.
Firstly, the compatibility of a bifenthrin-treated net with natural enemies provided

the following conclusions:
In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not
able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no short-
term mortality (72 hours) was recorded on either predatory bug. In contrast, a high
mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated
net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out
under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages
of 25 X 25 cm X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive
parameters were not affected on O. laevigatus and N. tenuis. Lastly, the bifenthrin-
treated net was evaluated under field conditions in semi-commercial tunnels (8 m long
X 6.5 m width X 2.6 high), to confirm the absence of deleterious effects on beneficial
arthropods. Neither natural enemies nor environmental conditions [temperature, relative
humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] were affected
by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop. However, results were not
conclusive, mainly due to a low settlement of the released biocontrol agents, and further
studies are needed in commercial greenhouses to confirm our preliminary results of
compatibility.
Secondly, after evaluating the toxicity of six modern pesticides (abamectin,

deltamethrin (positive commercial standard), emamectin, flubendiamide, spinosad
and spiromesifen) on O. laevigatus and N. tenuis it can be concluded that:
O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides than N. tenuis. In
addition, the research results indicated no impact of flubendiamide and spiromesifen on
the two natural enemies studied under laboratory conditions. Consequently, both
pesticides are candidates to be included in IPM programmes where both natural enemies
are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad were
not selective for both predatory bugs in laboratory experiments. However, persistence
test demonstrated that in spite of the lack of physiological selectivity, these insecticides
can provide ecological selectivity in some cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin
155
7. Conclusions
and spinosad could be compatible with N. tenuis if the mirid bug is released 4 days after
the insecticide treatment on the crop. With regard to O. laevigatus, abamectin,
deltamethrin and spinosad were classified as persistent in our assays, thus the study
should be completed with semi-field and field experiments in order to ascertain their
possible joint use in IPM programs. In contrast, emamectin could be compatible with O.
laevigatus if the pirate bug is released 7 days after the insecticide treatment on the crop.
Finally, the toxicological effects and molecular docking approaches of MACs on O.

laevigatus and N. tenuis reported the following conclusions:
Results showed no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849,

on either predatory bug. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking
experiments also suggested that methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 were
devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. In the case of N. tenuis, it should be
noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for
the LBD. However, a partial sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and
a strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was
observed. Therefore, our results indicate that these compounds could be safely applied
in IPM programs in which O. laevigatus and N. tenuis are present.
156
Capítulo 8
Capítulo 8. Bibliografía
8. BIBLIOGRAFÍA.
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affinity of dibenzolhydrazine insecticides for the ecdysone receptor in non-lepidopteran insects.
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178
Apéndice
Apéndice
APÉNDICE.
-ÍNDICE DE FIGURAS.
1. Introducción general.
Figura 1. Distribución geográfica de O. laevigatus en Europa.

Figura 2. Ciclo biológico de O. laevigatus.
Figura 3. Huevos y ninfa a punto de eclosionar de O. laevigatus.
Figura 4. Adulto de O. laevigatus.
Figura 5. Hemiélitros de O. laevigatus con la base de la membrana incolora y el extremo oscuro.
Figura 6. Macho (izquierda) y hembra (derecha) de O. laevigatus.
Figura 7. Esquema del abdomen del macho (izquierda) y de la hembra (derecha) de Orius sp.
Figura 8. Distribución geográfica de N. tenuis en Europa.
Figura 9. Ciclo biológico de N. tenuis.
Figura 10. Ninfas de N. tenuis, estadio N1 (izquierda) y N5 (derecha).
Figura 11. Detalle de la hembra y macho de N. tenuis.
Figura 12. Adulto de N. tenuis.
Figura 13. Posición de cópula en N. tenuis.
3. Materiales y métodos generales.
Figura 14. Vista general del invernadero.

Figura 15. Interior del invernadero.
Figura 16. Medidor de temperatura y humedad relativa.
Figura 17. Medidor de radiación ultravioleta (UV).
Figura 18. Medidor de radiación fotosintéticamente activa (PAR).
Figura 19. Caja de cría de adultos N. tenuis (40 X 30 X 30 cm).
Figura 20. Judías verdes utilizadas como sustrato de oviposición y fuente de líquido
Figura 21. Dieta basada en huevos de E. kuehniella.
Figura 22. Caja de cría de ninfas de N. tenuis, (22 X 10 X 7 cm).
Figura 23. Ninfas N1 de N. tenuis.
Figura 24. Plántulas de tomate recién trasplantadas.
Figura 25. Plántulas de pimiento recién trasplantadas.
Figura 26. Plantas de tomate (50 cm) empleadas en los ensayos.
Figura 27. Plantas de pimiento (30-40 cm) empleadas en los ensayos.
Figura 28. Semilleros de pepino.
179
Apéndice
Figura 29. Trasplante de pepino, estado fenológico primera-segunda hoja verdadera del tallo principal
desplegada.
4. Compatibilidad de los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis

con el uso de mallas tratadas con bifentrin como método físico de control.
Figura 30. Malla tratada con bifentrin tras su recepción.

Figura 31. Detalle de las características físicas de la malla tratada con bifentrin.
Figura 32. Tubos en Y empleados en los ensayos de preferencia.
Figura 33. Placa de cristal a modo de base.
Figura 34. Montaje tubo en Y.
Figura 35. Judías verdes impregnadas con huevos E. kuehniella a modo de atrayente alimenticio.
Figura 36. Extremo tubo Y cerrado con parafilm.
Figura 37. Disposición de los tubos en Y en el insectario (ensayo de preferencia en laboratorio).
Figura 38. Orificio (0,5 mm de diámetro) en la base del tubo en Y por el cual se introdujeron los insectos.
Figura 39. Ensayo en laboratorio, unidad experimental (10 cm de diámetro X 3 cm de altura) para
ensayos de contacto residual.
Figura 40. Ensayo en laboratorio, vista general.
Figura 41. Ensayo en invernadero, jaula de 25 X 25 X 60 cm de altura, lateral cubierto por una lámina de
metacrilato para la observación y seguimiento del ensayo.
Figura 42. Ensayo en invernadero, jaula de 25 X 25 X 60 cm de altura, lateral cubierto por las mallas a
evaluar, tratada con bifentrin o control.
Figura 43. Ensayo en invernadero, comederos (3,5 cm de diámetro) con huevos de E. kuehniella.
Figura 44. Ensayo en invernadero, vista general del ensayo.
Figura 45. Enemigos naturales evaluados en los ensayos de campo (túneles semi-comerciales) en la finca
experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid). En negrita aparecen aquellas especies que
aparecieron de manera espontánea en el cultivo.
Figura 46. Montaje de los invernaderos tipo túnel.
Figura 47. Diseño y vista general del ensayo con tres invernaderos, cada uno de ellos lleva en su banda
lateral (4 m de largo X 2 m de altura) los dos tipos de mallas, control y tratada con bifentrin.
Figura 48. Vista lateral de las dos parcelas experimentales correspondientes a un invernadero.
Figura 49. Vista lateral de la parcela experimental.
Figura 50. Distribución de las plantas marcadas en cada parcela experimental del invernadero.
Figura 51. Inoculación de A. gossypii
Figura 52. Plataforma de liberación de adultos de B. tabaci y A. colemani.
Figura 53. Liberación de adultos de B. tabaci.
Figura 54. Liberación de adultos de A. colemani.
Figura 55. Larvas L3 de A. bipunctata tras su liberación.
Figura 56. Sobres de liberación de A. swirskii.
Figura 57. Liberación de P. persimilis.
180
Apéndice
Figura 58. Liberación de adultos de B. tabaci y adultos- ninfas de F. occidentalis.

Figura 59. Adultos de Aleyrodes sp.
Figura 60. Porcentaje de ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus que alcanzaron el extremo de
los tubos en Y a las ocho horas de su liberación, cuando se sitúan en posición vertical. a. Valor referido al
número total de insectos introducidos en el tubo en Y. b. Valor referido al número total de insectos que
eligieron entre las dos mallas evaluadas.
Figura 61. Mortalidad a las 72 horas en ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus tras atravesar
las mallas control y tratada con bifentrin en el ensayo de preferencia con tubos en Y.
Figura 62. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición por contacto a
las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura.
Figura 63. Condiciones ambientales registradas en el ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin
en invernadero realizado en Mayo del 2012 sobre los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis.
Figura 64. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas
control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
Figura 65. Descendencia evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de N. tenuis tras 72 horas de
exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
Figura 66. Fecundidad y fertilidad evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de O. laevigatus tras
72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.
con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci. c. Densidad media
de población en las plantas marcadas de O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci.
Figura 69 a,b. Ciclo de otoño, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con
bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii. c. Densidad media de
población en el cultivo del enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii.
Figura 70. Ciclo de otoño 2011, evolución de la población de A. gossypii en las mallas control y tratada
con bifentrin.
Figura 71. Hormigas en el cultivo.
ensayo de primavera-verano del 2012.
Figura 73. Detalle de ataque por araña roja.
Figura 74. Vista general del ataque de araña roja.
Figura 75. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas atacadas por Tetranychus
sp. en las mallas control y tratada con bifentrin.
Figura 76. Ciclo de primavera-verano 2012, evolución de la población de Aeolothrips sp. y F.
occidentalis (trips) en las mallas control y tratada con bifentrin.
Figura 77. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas
control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales Orius spp. y A. swirskii y sus presas,
181
Apéndice
Figura 78. Ciclo de primavera-verano del 2012, evolución de la población de Orius spp. en las mallas
control y tratada con bifentrin.
con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B.
tabaci, Aleyrodes sp., Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips). c. Densidad media de población en las
plantas marcadas de O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp.,
con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa A. gossypii. c. Densidad media de
población en las plantas marcadas de A. colemani (momias) y su presa A. gossypii.
5. Toxicidad de modernos insecticidas sobre los enemigos naturales Orius

laevigatus y Nesidiocoris tenuis.
Figura 82. Principales formas de exposición de los enemigos naturales a los plaguicidas.
Figura 83. Secuencia de pruebas para la evaluación de los efectos secundarios en organismos
beneficiosos.
Figura 84. Resumen de ensayos realizados con insecticidas en los enemigos naturales O. laevigatus y N.
tenuis.
Figura 85. Torre de Potter.
Figura 86. Placas de vidrio (12 X 12 X 0,5 cm).
Figura 87. Unidad experimental de ensayo de contacto residual.
Figura 88. Judía verde y huevos de E. kuehniella.
Figura 89. Cajas de evaluación de fecundidad en O. laevigatus (11,5 cm diámetro, 5 cm de altura,
ventilación en la tapa de 5,5 cm diámetro).
Figura 90. Detalle de caja de evaluación de fertilidad en O. laevigatus (9 cm diámetro, 3 cm de altura,
ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro).
Figura 91. Cajas de evaluación de descendencia en N. tenuis (9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación
en la tapa de 5,5 cm. diámetro).
Figura 92. Vasos de evaluación de descendencia en N. tenuis (8 cm de diámetro, 11 cm de altura).
Figura 93. Planta de pimiento (30-40 cm de altura).
Figura 94. Planta de tomate (50 cm de altura).
Figura 95. Planta de pimiento tras el tratamiento con el insecticida.
Figura 96. Planta de tomate tras el tratamiento con el insecticida.
Figura 97. Unidad experimental de O. laevigatus en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, 5 cm de
altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). .
182
Apéndice
Figura 98. Unidad experimental de N. tenuis en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, 5 cm de

altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). .
Figura 99. Porcentajes de mortalidad en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de
los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
Figura 100. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras su
exposición al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 11 días sobre placas de cristal en
laboratorio.
Figura 101. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo
Figura 102. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo
Figura 103. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus
Figura 104. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus
Figura 105. Porcentajes de mortalidad en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los
insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
Figura 106. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición
al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 10 días sobre placas de cristal en laboratorio.
Figura 107. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo
Figura 108. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de N. tenuis
expuestas al residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal en laboratorio
Figura 109. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Condiciones
ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre-Octubre del 2010.
Figura 110. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los
Figura 111. Ensayo de persistencia sobre tomate en el enemigo natural N. tenuis. Condiciones
ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre del 2011.
Figura 112. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de N. tenuis tras exponerse a los
residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4
mol/m2*s).
Figura 113. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras exponerse al residuo de 4
días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).
183
Apéndice
6. Ecdysone agonist: Ecotoxicology on Orius laevigatus. Insect toxicity bioassays

and molecular docking approaches.
Figure 114. Modular structure (domains) of the insects’ ecdysone receptor.

Figure115. Formed bacteria on an ampicilin-containing LB agar plate.
Figure 116. Ethidium bromide-stained colony PCR.
Figure 117. Nucleotide and amino acid sequence of O. laevigatus.
Figure 118. Percentage of O. laevigatus mortality after 72 hours during the two performed experiments.
Figure 119. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fecundity during
the two carried out experiments.
Figure 120. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fertility during the
two carried out experiments.
Figure 121. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including
OlEcR-LBD (helix 1 to 12). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster,
AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera
(TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera,
NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR:
Orius laevigatus, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Blue dots indicate amino acid
substitutions in OlEcR-LBD sequence in positions where conservation is usually very high throughout
the insect class. Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD
(Kasuya et al., 2003). Green dots indicate hydrophilic, hydrophobic or aromatic residues involved in the
ligand anchorage into the pocket. The figure has been prepared using CINEMA (Colour Interactive
Editor for Multiple Alignments, Utopia, http;//cs.man.ac.uk/utopia/).
Figure 122. Phylogenetic tree of EcRs. This tree was constructed with the neighbor-joining method using
the amino acid sequences of the LBD of the selected sequences. Bootstrap values as percentage of a 1000
replicates >50 are indicated on the tree.
Figure 123. Expression of EcR in adults and nymphs of O. laevigatus. Agarose gel electrophoresis of
amplified EcR fragment using cDNA from nymphs and adults.
Figure 124. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including N.
tenuis (NtEcR-LBD) and OlEcR-LBD (Helix 6 to 11). In the following order: Diptera (DmEcR:
Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR:
Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor);
Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia
tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, NtEcR: Nesidiocoris tenuis, ApEcR:
Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Red dots indicate the amino acids involved in the ligand
binding in the EcR-LBD (Kasuya et al.,2003).
Figure 125. Overall three-dimensional (3D) conformation of the modeled EcR-LBD domain of the
predatory bug O. laevigatus (a) compared to LBD structure of the RXR-USP of T. castaneum (b). The
twelve α-helices distributed along the polypeptide chain are numbered H1-H12 and the two β-strands β1
and β2 forming a protruding hairpin motif are indicated. N and C indicate the N-terminal and C-terminal
184
Apéndice
ends of the polypeptide chain, respectively. (c) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-
LBD harboring 20-hydroxyecdysone (20E) (pink stick). (d) Network of hydrogen bonds (dashed dark
lines) anchoring 20E to the OlEcR-LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand
by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled
according to the 3D-model built for the OlEcR-LBD. (e) Clip view across the ligand-binding pocket of
the OlEcR-LBD harboring ponasterone A (PA1) (pink stick). (f) Network of hydrogen bonds (dashed
dark lines) anchoring P1A to the LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by
hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according
to the three-dimensional model built for OlEcR-LBD.
Figure 126. (g) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring tebufenozide
(blue stick). Note the steric clash ( ) of the ethyl group at the phenyl ring of tebufenozide with the wall
of the ligand-binding pocket. (h) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring
methoxyfenozide (blue stick). Note the steric clash ( ) of the methoxy group at the phenyl ring of
methoxyfenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (i). Clip view across the ligand-binding
pocket of the OlEcR-LBD harboring RH-5849 (blue stick). Note the steric clash ( ) of the phenyl ring
with the wall of the ligand-binding pocket, that is less severe compared with tebufenozide and
methoxyfenozide.
-ÍNDICE DE TABLAS.
1. Introducción general.
Tabla 1a,b. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados
para su control en España.
Tabla 2. Tiempo de desarrollo y supervivencia de O. laevigatus bajo diferentes temperaturas y tipos de
alimentación.
Tabla 3. Parámetros biológicos de N. tenuis (25 ºC, 75 % HR) en función del a. Efecto del tipo de presa
en tomate y b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella.
Tabla 4. Parámetros biológicos de N. tenuis a diferentes rangos de temperatura cuando es alimentado con
huevos de E. kuehniella sobre planta de tomate.
3. Materiales y métodos generales.
Tabla 5. Resumen de la cría de N. tenuis a una temperatura de 25 ± 5º C, humedad relativa (HR) 50 ± 5

% y fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad (16L: 8O).
Tabla 6. Pruebas de contraste de hipótesis aplicadas en los ensayos.
185
Apéndice
4. Compatibilidad de los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis

con el uso de mallas tratadas con bifentrin como método físico de control.
Tabla 7. Dosis de la malla tratada con bifentrin tras cada ciclo de cultivo y su reducción en los ensayos
realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid).
dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.
así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.
Tabla 14. Localización de plagas en el cultivo de pepino en función de las observaciones tomadas en
campo en los distintos ciclos de cultivo de otoño (2011 y 2012) y primavera-verano (2012).
Tabla 15. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii en la malla control y tratada
con bifentrin.
Tabla 16. Ciclo de otoño del 2012, ratio momias A. colemani/A. gossypii en la malla control y tratada
con bifentrin.
Tabla 17. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii y ratio de momias A.
colemani/A. gossypii por repetición (módulo) en la malla control y tratada con bifentrin.
5. Toxicidad de modernos insecticidas sobre los enemigos naturales Orius

laevigatus y Nesidiocoris tenuis.
Tabla 18. Características de los insecticidas evaluados.

Tabla 19. Clasificación de los productos fitosanitarios según el efecto sobre los organismos en: a.
Ensayos de laboratorio, laboratorio extendido, semi-campo y campo. b. Ensayos de persistencia.
Tabla 20. Cálculo del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration).
Tabla 21. Valores del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration) para los insecticidas
evaluados.
Tabla 22. Parámetros evaluados en adultos de O. laevigatus y N. tenuis.
Tabla 23. Parámetros evaluados en ninfas N2 de O. laevigatus.
Tabla 24. Parámetros evaluados en ninfas N2 de N. tenuis.
186
Apéndice
Tabla 25. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en adultos de O. laevigatus tras la

exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 26. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras la
exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 27. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco
de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 28. Porcentajes de mortalidad y descendencia en adultos de N. tenuis tras su exposición al
residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 29. Porcentajes de mortalidad y descendencia en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición al
residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 30. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de N. tenuis tras la exposición al residuo fresco de
los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.
Tabla 31. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Resumen de las
radiaciones PAR y UV registradas en el interior del invernadero en Septiembre del 2010.
Tabla 32. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los
Tabla 33. Fecundidad y fertilidad en adultos de O. laevigatus tras exponerse al residuo de 7 días de
emamectina durante 72 horas sobre hoja de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9
mol/m2*s).
Tabla 34. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas en adultos de O. laevigatus cuando se
aplicaron sobre plantas de pimiento y degradaron en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).
Tabla 35. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas y descendencia en adultos de N. tenuis tras exponerse
a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas de tomate en invernadero (Radiación UV
media=78,4 mol/m2*s).
Tabla 36. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas adultos deN. tenuis cuando se
aplicaron sobre plantas de tomate y degradaron en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).
6. Ecdysone agonists: Ecotoxicology on Orius laevigatus. Insect toxicity bioassays

and molecular docking approaches.
Table 37. Chemical tested in the experiments.

Table 38. Specific conditions of PCR reaction steps for determining the OlEcR-LBD sequence.
Table 39. Degenerate and specific primers used to complete the OlEcR-LBD coding sequence.
187

Fermin Amor Parrilla

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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos

Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber)

Fermín Amor Parrilla

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos

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Fermín Amor Parrilla

Directores: Elisa Viñuela Sandoval

Realizada la lectura y defensa de la tesis el día de de 2013 en Madrid,

El Presidente Los Vocales

Esta Tesis Doctoral se ha llevado acabo en la Unidades de Protección de Cultivos de la

A Elisa, mi tutora, por darme la oportunidad de trabajar en investigación, transmitirme

To Guy, my promoter in Belgium, because he invited me to be part of his work team

A Antonio López, por confiar en mi trabajo y su apoyo personal.

A Ignacio Colomer, por enseñarme los entresijos de la horticultura Almeriense.

A todo el personal de la universidad, escuela y del departamento que siempre me ha

A Carmen Calleja por resolver mis dudas moleculares.

A Beatriz Díaz por sus enseñanzas de Sadie y Surfer.

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS. vii

1.1. La agricultura sostenible y el control de plagas. 1

1.2. Gestión Integrada de plagas (GIP) en cultivos

1.3. Enemigos naturales. 8

1.3.1. Orius laevigatus. 8

1.3.1.2. Distribución geográfica y hábitat. 9

1.3.1.3. Descripción y biología del insecto. 10

1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos

1.3.2. Nesidiocoris tenuis. 16

1.3.2.2. Distribución geográfica y hábitat. 16

1.3.2.3. Descripción y biología del insecto. 17

1.3.2.4. Importancia en la GIP de cultivos

3. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES. 25

3.1. Lugar de estudio y condiciones ambientales. 25

3.1.3. Campo (túneles semi-comerciales). 27

3.2. Material biológico y su manejo. 28

3.2.1. Cría de Orius laevigatus. 28

3.2.2. Cría de Nesidiocoris tenuis. 28

3.2.3. Material vegetal. 31

3.3. Análisis estadístico. 33

4. COMPATIBILIDAD DE LOS ENEMIGOS NATURALES

ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS CON EL

USO DE MALLAS TRATADAS CON BIFENTRIN COMO

MÉTODO FÍSICO DE CONTROL. 35

4.2. Materiales y métodos. 37

4.2.1. Características y manejo de la malla tratada

con bifentrin y malla control. 37

4.2.2.1. Evaluación de la preferencia entre

malla control y tratada con bifentrin. 39

4.2.2.2. Evaluación de la toxicidad de la

malla tratada con bifentrin por contacto. 42

4.2.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en invernadero. 43

4.2.4. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 45

4.3. Resultados y discusión. 56

4.3.1.1. Evaluación de la preferencia entre

malla control y tratada con bifentrin. 56

4.3.1.2. Evaluación de la toxicidad de la malla

tratada con bifentrin por contacto. 58

4.3.2. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en invernadero. 59

4.3.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 63

4.3.3.1. Otoño 2011. 63

4.3.3.2. Primavera-verano 2012. 69