GUIA

DE
TRABAJOS PRACTICOS

Unidad Temática 2
UNIDAD TEMATICA 2
TRABAJO PRACTICO Nº1

REGULACIÓN DEL VOLUMEN CELULAR

Laboratorio, Aplicación y Resolución de Problemas

Objetivos:
 aplicar el concepto de osmolaridad, osmolalidad, presión osmótica, equilibrio osmótico y tonicidad a los distintos compartimientos líquidos
 explicar los mecanismos de la regulación del volumen celular ante cambios de tonicidad
 plantear hipótesis adecuadas ante el problema presentado
 reconocer elementos básicos del laboratorio
 reconocer las normas de trabajo del laboratorio
 manejar datos obtenidos a partir de experiencias
 construir tablas
 interpretar resultados y gráficos

Material de estudio para realizar el TP:

- Boron y Boulpaep. Capítulo 5 Transporte de solutos y agua, pag 102 a 140

Video de Laboratorio:
Hemólisis globular
https://www.youtube.com/watch?v=sFmRR_RS6BQ

Tiempo aproximado para la lectura y estudio del material para este TP: 6hs

LABORATORIO
Durante el Laboratorio se desarrollarán las actividades con sangre segura. El alumno tiene la obligación de
observar las actividades, pero no de participar de las mismas. Siempre deberá concurrir a las actividades
de Laboratorio con guardapolvo y guantes descartables, y el estudiante debe conocer y respetar las
Normas de Bioseguridad del Manual de Bioseguridad de la Facultad. Por razones de bioseguridad, no se
permitirá la entrada al laboratorio a estudiantes sin guardapolvos y/o guantes descartables. Quien no lleve
el material de protección no podrá permanecer en el laboratorio y quedará ausente de la práctica Se
pondrán a disposición anteojos de seguridad.
El uso y manejo de los equipos de laboratorio deberá hacerse bajo la supervisión del docente.
Se espera de los estudiantes la colaboración como voluntarios; no se les solicitará actividad alguna que
pueda causar trastornos físicos, psíquicos o religiosos; a este último respecto de no desear ser voluntarios
NORMAS DE BIOSEGURIDAD notificar al docente al inicio del TP. Los estudiantes voluntarios deberán firmar en la hoja de asistencia su
consentimiento informado para dejar constancia que aceptan participar, que conocen la práctica y los
instrumentos como los procedimientos usados.
PRUEBA DE HEMOLISIS GLOBULAR

Para la realización de la experiencia se deberá disponer de:

- gradilla conteniendo 10 tubos de hemólisis
- pipetas Pasteur
- soluciones de cloruro de sodio al 1,5%, 0,9%; 0.7%; 0.5% y 0,2%
- solución 5% glucosa
- solución 20% glucosa
- solución de urea 1,8%
- glicerol y etanol
- agua destilada
- sangre segura

Procedimiento:
-enumerar los tubos y colocar 2 ml de cada una de las soluciones acorde a la Tabla.
-posteriormente, agregar a cada tubo 2 gotas de sangre y mezclar suavemente (sin agitar) y dejar en reposo
-observar los resultados cada 5 min y anotar el tiempo en el que se observan cambios
-a los 30 min centrifugar los tubos durante 10 min. a 3000 rpm y volver a observar

Mientras espera los 30min, realice las siguientes actividades:

 complete la Tabla adjunta y genere las Hipótesis respecto a lo que sucederá en cada tubo con los glóbulos rojos
 también complete el fundamento de su hipótesis
 para los resultados que observará utilice alguno de los siguientes términos, si no los conoce busque su definición

Solución translúcida……………………………………
Solución turbia ………………………………………..
Hemólisis………………………………………………. Recuerde que Ud observa
Decantación…………………………………………… fenómenos macroscópicos (es
Botón-sedimento-pellet………………………….……… decir que los puede ver a simple
Sobrenadante………………………….……………… vista), pero los fundamentos
GR crenados……………………………….………… fisiológicos se basan en procesos
Esferocitos…………………………………………… celulares y/o tisulares no
alcanzados por la visión.
 cuál solución de ClNa representa la solución fisiológica? Por qué?
 después de centrifugar qué hay en el sobrenadante y en el sedimento en cada tubo?
Tabla de Resultados

Tubo Solución Calcule Hipótesis Resultado obtenido Resultado con centrifugación Fundamento (solución hiper, hipo ó isotónica)
Nº Osmolaridad (Resultado esperado)
de la solución
1 ClNa 1,5%
2 ClNa 0,9%
3 ClNa 0,7%
4 ClNa 0,5%
5 ClNa 0,2%
6 H2Odestilada
7 glicerol
8 etanol
9 urea 1,8%
10 Glu 5%
11 Glu 20%

APLICACIÓN BIOQUIMICA-CLÍNICA
La Prueba de Resistencia Globular Osmótica (RGO), también llamada Prueba de Resistencia Osmótica Eritrocitaria (ROE) ó de Fragilidad Osmótica Eritrocitaria (FOE), refleja
la capacidad del glóbulo rojo de incorporar cierta cantidad de agua antes su lisis. Puede establecerse así una concentración en la que se inicia la hemólisis (RGO mínima) y
una concentración donde la hemólisis es completa (RGO máxima) que son 0,48-0,45% y 0,33-0,28% respectivamente.

Analice el siguiente gráfico:

 complete las unidades de los ejes
 señale cuál curva corresponde a los valores normales
 cuáles podrían ser las causas de los cambios en la curva que no aparenta ser normal?
 todas las células del cuerpo expuestas a estas soluciones darán estos resultados? fundamente su respuesta
RESOLUCION DE PROBLEMAS
1) Analice el siguiente gráfico que muestra los resultados de experimentos de células mamarias epiteliales en cultivo ante cambios de osmolaridad en el medio de cultivo,
describa lo que observa:
- señale a partir de sus conocimientos qué significan las siglas ISO, HYPO, RVD

-señale con una flecha el momento en que cambia la osmolaridad del medio

-enuncie la secuencia de eventos que se producen en la célula ante el cambio de osmolaridad del medio

-qué sucede en estos tipos celulares si a los 15 minutos del cambio de osmolaridad (señalado ahora con una flecha) se vuelve a modificar el medio haciéndolo
isoosmótico con el LIC (300 mOsm/L)? incorpore a los gráficos los cambios esperados
UNIDAD TEMATICA 2
TRABAJO PRACTICO Nº2

POTENCIAL DE MEMBRANA: CAUSAS QUE LO GENERAN Y MANTIENEN

FACTORES QUE MODIFICAN LA EXCITABILIDAD
Análisis de gráficos y Resolución de Problemas

Objetivos:
 aplicar el concepto de potencial electroquímico
 aplicar la ecuación de Nernst y la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz a la resolución de problemas
 predecir cómo afectará al potencial de membrana cambios en la permeabilidad y concentración de iones
 construir tablas e interpretar datos
 analizar e interpretar gráficos y resultados

Material de estudio para realizar el TP:

- Silvertorn et al. Capítulo 8 Neuronas: propiedades celulares y de las redes; pag 243 a 269
- Boron y Boulpaep. Capítulos 6,7 de Sección II Fisiología de las células y las moléculas; pag 141 a 203

https://www.youtube.com/watch?v=hk09AkV5_Kc

Tiempo aproximado para la lectura y estudio del material para este TP: 7hs

1)Ud. ya conoce de Biología el concepto de Potencial de membrana, que es una propiedad característica de todas las células. El valor del potencial de membrana en reposo
depende de las concentraciones de los iones intra y extracelulares, cuyos valores normales Ud. ya conoce (ver Fichero Conceptual), y de la permeabilidad de la membrana a
dichos iones.

Ahora analizaremos si el potencial de membrana se modifica ante cambios en la composición del LEC.

Se utilizará el siguiente link http://www.physiologyweb.com/calculators/ghk_equation_calculator.html para realizar los cálculos.

Para ello al ingresar al simulador presionar Fill Cells with sample data (ingresa datos basales), y seleccionar mV. La T° está en Kelvin y es equivalente a 36,8°C. Modificar los
datos de las concentraciones de iones con los del apunte (a saber potasio extracelular: 4, potasio intracelular: 140, sodio extracelular: 142, sodio intracelular: 15, cloro extracelular.
104, cloro intracelular: 4; todo en mM/L=mEq/L ya que son iones monovalentes)
La permeabilidad está expresada como forma relativa a la permeabilidad del potasio, pero hay que considerar que las células somáticas y excitables tienen distinta permeabilidad
relativa a estos iones, y eso analizaremos.
 -se considera por motivos didácticos que las neuronas presentan una permeabilidad potasio:sodio:cloro=1:0,05:0,45 que son los valores preestablecidos por el sistema,
presionar Calcular, con los datos que surgen completar la Tabla adjunta (con los valores de Vm potencial de membrana, Vión potencial del equilibrio de cada ión, Fuerza
impulsora de cada ión -driving force)
- las células gliales presentan una permeabilidad al potasio altamente superior al resto de los iones, así que la relación queda 1:0:0, presionar Calcular y completar la
Tabla adjunta con los valores
- las células somáticas presentan mayor permeabilidad al potasio, poco al sodio y casi nulo al cloro, así que la relación queda 1:0.02:0.01, presionar Calcular y completar
la Tabla adjunta con los valores

Neuronas Células gliales Células somáticas

Vm
Vk+
VNa+
VCl-
FK+
FNa+
FCl-

Analizando la Tabla, responda:

-la permeabilidad de qué ión influye principalmente en el Vm?
-el Vm de las células gliales con qué potencial electroquímico se corresponde?
-la permeabilidad a los otros iones no predominantes, hace a la membrana más ó menos electronegativa?
-se modifica el potencial electroquímico de los iones al cambiar la permeabilidad?
-de qué parámetros depende el potencial electroquímico?
-cuál es el significado fisiológico del potencial electroquímico?
-la fuerza impulsora se modifica al cambiar la permeabilidad?
-de qué parámetro/s depende esta fuerza?
-qué significado funcional tiene la fuerza impulsora del ión?
-cuál es la influencia del cloro en estos procesos?

- qué Ecuación/es de trabajo puede utilizar para corroborar los datos de Vm y potencial electroquímico dados por el Simulador utilizado? Escriba la fórmula
- con qué fórmula puede calcular el gradiente ó fuerza electroquímica de cada uno de estos iones?
2) El siguiente gráfico muestra los resultados de experimentos in vitro de células expuestas a diferentes concentraciones de potasio y a cambios en la permeabilidad del sodio
(señaladas como 0,02-0,03-0,05, siempre expresada en forma relativa al potasio- ver ítem 1).
-analice el gráfico
-ubique el valor promedio normal de potasio del líquido extracelular (4mEq/L)
-describa los cambios en el Vm al aumentar y disminuir las concentraciones del potasio extracelular
-describa el impacto de las distintas permeabilidades relativas del sodio sobre el potencial de membrana
-explique, cómo se genera el cambio en el Vm en dada caso?
-puede utilizar para interpretar los eventos apoyatura matemática (cuál fórmula utilizaría?)
-cuál es la consecuencia de estos cambios si se trata de una célula excitable?

3) El Potencial de membrana en reposo también es modificado por cambios en los niveles de calcio del LEC. Analice el gráfico y responda:
-a partir del enunciado identifique a la variable independiente y la variable dependiente del gráfico
-ubique en el gráfico dichas variables
-señale en el gráfico el valor normal de calcio extracelular en el eje correspondiente (calcemia 2.13 a 2.55 milimol/L)
-describa los cambios en el Vm al aumentar y disminuir la calcemia
-explique, cómo se genera el cambio en el Vm?
-cuál es la consecuencia de estos cambios si se trata de una célula excitable?
UNIDAD TEMATICA 2
TRABAJO PRACTICO Nº3

POTENCIAL DE MEMBRANA EN CÉLULAS EXCITABLES

INTEGRACIÓN SINÁPTICA
Análisis de gráficos y Resolución de Problemas

Objetivos:
 señalar la relación estructura-función en la neurona, a nivel celular y molecular
 relacionar funcionalmente los distintos tipos de potenciales de membrana
 graficar un potencial de acción y señalar las relaciones entre las distintas fases y períodos, conductancia de distintos iones y estado de los canales iónicos
 describir una sinapsis y el proceso de transmisión sináptica
 inferir los resultados de la sumación espacial y temporal
 interpretar gráficos y resultados

Material de estudio para realizar el TP:

- Silvertorn et al. Capítulo 8 Neuronas: propiedades celulares y de las redes; pag 243 a 269
- Boron y Boulpaep. Capítulos 5,6,7 de Sección II Fisiología de las células y las moléculas; pag 141 a 203

https://www.youtube.com/watch?v=BbUcWbtVjT4

Tiempo aproximado para la lectura y estudio del material para este TP: 7hs

1)El modelo de neurona como célula excitable, que Ud. ya conoce de Biología, Histología y Biología Celular, permite reconocer las principales características celulares y
moleculares vinculadas a los procesos funcionales de este tejido. Analice el modelo adjunto y posteriormente:
- identifique las estructuras señaladas con números
- señale en el modelo dónde se encuentran ubicados los siguientes tipos de canales:
- canales voltaje dependientes de sodio
- canales voltaje dependientes de potasio
- canales voltaje dependientes de calcio
- canales ligando dependientes
- canales de difusión pasiva de sodio
- canales de difusión pasiva de potasio
 - vinculando las estructuras celulares con los canales ubicados en sus membranas, identifique qué función cumple cada una de ellas (ej: dendritas y canales ligando-
dependientes: recepción de mensajeros)

2)En Biología ya estudió los cambios que se producen en el potencial de membrana de las células excitables al exponerlas a un estímulo. Analice el gráfico y:

-complete los nombres señalados con números

-señale con una flecha el inicio del potencial de acción

-qué tipo de canales están abiertos/cerrados/inactivados en cada fase/periodo del potencial de acción?
-el potencial de equilibrio de qué iones se relaciona con los momentos de inversión de potenciales en cada fase del potencial de acción?
3)Los cambios en el potencial de membrana, entre el potencial de reposo y el umbral, son del tipo despolarizante pero no son parte del potencial de acción, y se denominan
potenciales locales
- analice el gráfico y señale las diferencias entre los potenciales locales y los potenciales de acción

(Threshold: Umbral)

4) A partir de sus conocimientos de Biología, identifique en el modelo adjunto las partes que componen una sinapsis química. Estos componentes celulares y moleculares
participan del proceso de transmisión sináptica; que culmina con modificaciones postsinápticas cuando el neurotransmisor se une al receptor, los denominados Potenciales
Postsinápticos PPSExcitatorio(EPSP) y PPSInhibitorio(IPSP).

- analice el modelo
- describa el proceso siguiendo la secuencia de los gráficos que componen el modelo

Proceso:
conjunto de fases sucesivas
dispuesta con algún tipo de lógica
de un fenómeno o hecho complejo
5) Las sinapsis axo-dendríticas son las más comunes, y se multiplican por miles en cada neurona. El siguiente es un modelo simplificado de este fenómeno que permite
interpretar los procesos de integración sináptica generados por:
-facilitación presináptica
-sumación espacial
-sumación temporal
-inhibición presinática

Identifique cada uno de ellos y justifique su selección