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PRÁCTICA VI (parte 2)

MORFOLOGÍA CELULAR.
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD METABÓLICA DE MICROORGANISMOS
AMBIENTALES
Dany Daniel Cordero Vega 1

1. Ingeniería Agroindustrial, Facultad de Ingeniería, Universidad de Antioquia

Septiembre 25 de 2015
Carepa-Antioquia
Correo: ddaniel.cordero@udea.edu.co

Palabras claves: Medios de Cultivos, hongos, bacterias, gran positiva gran negativa, colorantes, morfología.

RESUMEN

El 25 de Septiembre del presente año se dio inicio a la segunda parte de la práctica numero V o bien
llamada VI en la cual se observaron los cultivos hechos en la clase anterior, al sacarse de
incubación las respectivos cultivos se visualizó que varias muestras estaban en mal estado debido a
que no se realizó de buena manera la recolección dichas muestras, debido a esto la práctica se
delimito y se procedió a hacer el análisis respectivo de la practica con los cultivos que estaban en
buen estado, estas fueron observadas en el estereoscopio para determinar sus respectiva morfología
para así identificar a que familia o tipo de microorganismo pertenecían.

Después de identificados los microorganismos, se procedió a llevar dichas muestras al microscopio

por medio de preparación de para ser analizados y tener una mejor observación de sus
comportamientos y en que se diferenciaban unos de los otros, luego de ello se dio por culminada la
práctica.

INTRODUCCIÓN

Para el estudio de la biología se hace crecimiento explosivo de las bacterias permite

fundamental reconocer los microorganismos
que habitan en nuestro entorno y los cuales no
podemos ver a simple vista. Para ellos se
hacen muestras de diferentes maneras las que
se pueden estudiar de manera definida y a
fondo en el laboratorio.
El aislamiento de bacterias a partir de
muestras naturales se realiza, en la mayoría
de los casos, mediante la producción de
colonias aisladas en cultivos sólidos. El
producir un gran número de ellas a partir de
una única célula inicial de forma que, tras un
periodo de incubación en las condiciones
ambientales adecuadas, se produce una
colonia observable a simple vista y formada
por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin
embargo, no todos los microorganismos
presentes en las muestras ambientales son
cultivables (microorganismos no cultivables).
Esto es debido a dificultades intrínsecas en el
cultivo (microorganismos parásitos de otros), al
desconocimiento de los requerimientos
específicos de cultivo, y a la existencia de
grupos de microorganismos que deben
mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir
(casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que
en sólo en torno al 1% de las bacterias del
suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas
son cultivables (1). El metabolismo microbiano
es el conjunto de procesos por los cuales un
microorganismo obtiene la energía y los
nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita
para vivir y reproducirse. Los microorganismos
MATERIALES Y EQUIPOS
 Cajas Petri con agar nutritivo con
colonias.
 Colorantes Gram.
 Mecheros.
 Microscopio. Estereoscopio.
 Porta objetos.
MÉTODO:
En esta práctica se utilizaron dos sesiones
fundamentales, pero por motivo de tiempo solo
se realizó el primero el cual se mencionara
detalladamente a continuación.
SESION 1.
1. Caracterización macroscópica y sacó si fue del baño, de la mesa de trabajo, del
microscópica
En la caracterización macroscópica se realizó
una primera descripción de las colonias
formadas en la caja Petri y posteriormente,
utilizando el estereoscopio realizamos una
segunda descripción de las colonias teniendo
en cuenta la morfología de las colonias de los
microorganismos: Notación, esquema, forma,
utilizan numerosos tipos de estrategias
metabólicas distintas y las especies pueden a
menudo distinguirse en función de estas
estrategias (2).
1. Bibliografía recomendada: Cap. 1 de la
8ª edición de Brock: Biología de los
microorganismos
2. https://es.wikipedia.org/wiki/Metabolism
o_microbiano
 Cubre objetos.
 Aceite de inmersión.
 Cajas Petri con medios de cultivo
específicos incubadas.
 Lugol.
 Ácido clorhídrico al 1%
borde, elevación, superficie, color, olor y tipo
de microorganismo.
A. Preparación del frotis (Para prueba de
Gram)
1. Tomar un portaobjetos limpio y etiquetarlo
con el nombre del medio del cultivo del cual se
aire, de la piel, etc.
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la
flama del mechero hasta que se ponga al rojo
vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar
la muestra los microorganismos sean
destruidos. Después acercar la caja Petri al
mechero, introducir el asa en la caja y tomar
cuidadosamente la muestra.
4. Tomar el asa con la muestra y mezclarla con
el agua que previamente se había depositado
en el portaobjeto. Extenderla suavemente y
dejarla unos minutos secar al aire.
5. Fijar la muestra con calor. Para esto se pasa
el frotis rápidamente de 2 a 3 veces en el
interior de la parte amarilla de la flama del
mechero.
6. Palpar la parte inferior del portaobjeto con el
dorso de la mano para enfriar y comprobar que
no hubo sobrecalentamiento.
B. Tinción en fresco:
Se utiliza para hongos y levaduras (con cristal
violeta, azul de metileno), micro algas (lugol),
células vegetales, o bacterias coloreadas.
Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar
con un asa una muestra de la colonia, y
esparcirla en el portaobjetos, previamente
humedecido con una gota de agua, realizando
movimientos horizontales. Se adiciona una
gota de colorante a la muestra fresca.
C. Tinción de Gram
Luego de la fijación de la muestra se procede
con los siguientes pasos:
1. Teñir con cristal violeta durante 30
segundos.
RESULTADOS:
1. Primero que todo se hizo el
reconocimiento de todos los
implementos requeridos para el
laboratorio próximo a realizar.
Distinguiendo las diferentes partes que
conforman el estereoscopio.
2. Luego se procedió a tomar una placa
fija con la letra E mayúscula para ser
montada en la platina del estereoscopio,
2. Retirar el colorante con agua
3. Cubrir con Lugol durante 1 minuto
4. Lavar con agua
5. Decolorar con alcohol cetona
6. Contrastar con safranina durante 20
segundos
7. Lavar con agua
8. Secar el exceso de agua
D. Observación al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el
ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo
de observación, siguiendo las indicaciones del
profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y
empezar a localizar la preparación con el
objetivo de 10X, posteriormente pasar al de
40X. Para la observación con el objetivo de
100X, colocar previamente una pequeña gota
de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar
cuidadosamente el objetivo con papel seda
para eliminar el exceso de aceite y evitar
incrustaciones que dañan estos sistemas.
la cual se observó en los diferentes
objetivos (0.7; 0.8; 1; 1.5; 2; 3).
3. Las muestras fueron tomadas con la luz
inferior; la última muestra en el objetivo
3 fue tomada con la luz superior;
moviendo la perilla macrometrica para
poder enfocar bien lo que se quería
observar.
4. Lo siguiente para ser observado fue la
hormiga roja bañada en etanol, la cual
fue depositada en la caja de Petri por
parte del profesor con unas pinzas, la
 caja de Petri fue puesta en la platina del
estereoscopio; seguido a esto se
observó por el binocular con los
diferentes objetivos y los diafragmas
correspondientes a cada uno.
5. Se limpiaron los portaobjetos y la caja
de Petri, se organizó el estereoscopio y
se procedió a verificar y organizar el
microscopio.
6. Luego, se tomó una muestra en fresco
del centímetro cuadrado del papel
milimetrado observado en todos los
objetivos del microscopio, esto se hizo
para determinar el diámetro en cuadros
de los objetivos oculares en milímetros.
7. Se limpió el portaobjetos y se tomó otra
muestra en fresco, pero esta vez fue de
un centímetro de revista de colores
oscuros, esta muestra también se hizo
con el propósito de tomar una medida
más exacta del diámetro de los
objetivos oculares.

RESULTADOS: Para el análisis de estos microorganismos realizamos un esquema el cual

demuestra la todas las cualidades por decirlo así de cada uno de estos microorganismos, como su
forma, borde, elevación, superficie, color, olor y tipo para su mayor comprensión.

TABLA N°1 caracterización macroscópica y microscópica.

Para el análisis de estos microorganismos realizamos un esquema el cual demuestra la todas las cualidades.
TABLA Nº2 muestra de lodo.

Muestra: lodo Objetivo: 100x Aumento total: 1000x

Notación Esquema Forma Borde Elevación Superficie Color Olor Tipo Justificación
Descripción
Al lado de la estructura
principal se observan hongos
blancos en crecimiento, se
Mesa de
circular entero elevada rugosa negro hongo observa también un hongo
trabajo Bacilococos Estafilococos Se observan varios tipos por
formado de los
bacterias
extremos
(Gram Positivas) (Gram negativas) las cuales se color
pueden identificar
blanco y su interior
claramente como color
se ve en la
negro imagen
especie de flor.
Observemos en este cultivo
varios puntos blancos
separados uno de otro.
Manos sin
puntiforme entero elevada rugosa blanco bacteria
lavar

Vemos en esta una figura

plana de forma circular,
inferimos entonces que es un
cultivo rico en bacterias.
café
mucosa circular entero plana rugosa fetido bacteria Se observan relieves en esta
oscuro
además se denota que tiene
la forma en la cual fue
frotada para obtener la
muestra.

Aire puntiforme entero acuminada lisa blanco bacteria

TABLA Nº3 Muestra de manos sin lavar

Muestra: manos sin lavar Objetivo: 100x Aumento total: 1000x

Descripción

Utilizamos tres tipos de reactivos

para esta muestra de las cuales
obtuvimos los siguientes resultados
 Cristal de violeta: con este
método se sufre una tinción
Gram, además se adhiere a
las membranas de las
bacterias y entra a la célula
 Lugol: este no sufre tinción
Gram, pero cumple con las
mismas características al
utilizar el cristal violeta
 Alcohol cetona: en esta se
destiñe a las células Gram
negativas.

TABLA Nº4 muestra de mucosa bucal

Muestra: mucosa bucal Objetivo: 100x Aumento total: 1000x

Descripción

Se observan en esta muestra hongos

y bacterias como se ve en la imagen,
utilizamos tres tipos de reactivos para
esta muestra de las cuales obtuvimos
los siguientes resultados
 Cristal de violeta:
 Lugol:
 Alcohol cetona:
Estafilococos Estas cumplen las mismas
(Gram positivas y características de la muestra descrita
Gram egativas) anteriormente se observa que las
células Gram positivas son violetas y
las Gram negativas se ven rosadas

TABLA Nº5 muestra mesa de trabajo

 Muestra: mesa de trabajo Objetivo: 100x Aumento total: 1000x
Descripción

Vemos como el agente de tinción

actúan en esta muestra se observa
como una tintas de lapicero regada o
de pintura.

TABLA Nº6 muestra de aire

Muestra: aire Objetivo: 100x Aumento total: 1000x

Descripción

Utilizamos los mismos reactivos que

en los procesos anteriores y
denotamos similitud en las
característica en esta muestra

PREGUNTAS

 ¿Cómo actúan cada uno de los reactivos utilizados en la tinción de Gram?

R// La tinción de Gram es una técnica diferencial comúnmente empleada en el diagnóstico
microbiológico, el cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana
con ayuda del Lugol que refuerza la unión del colorante, las bacterias Gram positivas retienen el
complejo cristal violeta-Lugol por lo que se observan de color purpura o violeta al microscopio.

Las bacterias Gram negativas pierden el color del cristal violeta cuando son tratadas con alcohol ya
que este disuelve el contenido lipídico de la pared celular y captan el colorante de contraste razón
por la cual toman color rojo al microscopio.

 ¿Qué relación existe entre la morfología macroscópica y la microscópica?

R// La relación que existe es que ambas se refiere a la estructura, forma y apariencia de un
organismo.

 ¿Cuáles son los tipos de tinción y para que se utilizan?

R//

 Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).Se
utiliza para ver hongos, levaduras y leucocitos.

 Tinción diferencial: Se utilizan varios colorantes combinados (cristal violeta 1m, Yodo 1m,
lavado con alcohol, Safranina 30 seg) Las estructuras celulares se diferencian en función de
los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Los
ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM. Se utiliza para mirar, bacterias, levaduras.

 La tinción GRAM: clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: Gram Positivas y Gram
Negativas. Esta tinción diferencial depende de la estructura de la pared celular de las
bacterias.Se utiliza para mirar (cocos, bacterias, bacilos, positivos, negativos, etc.)

 rodamina-auramina: Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micro-bacterias

poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las
bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. usada
para visualizar bacilos ácido rápidos.

 El naranja de acridina: ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia
verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante
se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la
tinción. Se usa para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos.

 ziehl-neelsen (baar): Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos
grasos que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, y la
 coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la
pared bacteriana que contiene ceras. se usa para visualizar parásitos y bacterias.

 Blanco de calcoflúor: Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de
calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. se
emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se
emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de
los hongos.

 tinción de esporas (wirtz-conklin): permite diferenciar las esporas de las células

vegetativas. Se usa para visualizar las esporas.

 ¿Por qué es importante la observación microscópica en un proceso biotecnológico?

R// Es importante porque medio de ella se estudia el aislamiento, selección y conservación de

microorganismos, y los factores que modifican su crecimiento

 Defina sustrato, enzima, producto y revelador en el contexto de pruebas bioquímicas.

R//

 Sustrato: (contenido en el medio de cultivo)

 Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo)

 Producto:

 Revelador :

Ejemplo:

 Producto: Glucosa.
 Revelador: Lugol.
 Agar Almidón
 Sustrato: Almidón (polímero de glucosa).
 Enzima: Amilasa (exo-enzima).

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://bibliotecadigital.usbcali.edu.co/jspui/bitstream/10819/184/1/PracticaLaboratorioB.pdf

http://200.21.199.181/ciencias/images/Asignaturas/Biologia/Manual_Lab_Biologia.pdf

http://www.fundacionbios.org/files/MANUAL%20TOMA%20DE%20MUESTRAS%20BIOLOGICAS.pdf

http://es.slideshare.net/libiamadere/trabajo-de-laboratorio-de-biologia-i