PCT ORGANIZACION MUNDIAL DE LA PROPIEDAD INTELECTUAL SOLICITUD INTERNACIONAL PUBLICADA EN VIRTUD DEL TRATADO DE COOPERACION EN MATERIA DE PATENTES (PCT) (61) Clasfcaciin Internacional de Patentes7: [| (11) Namero de publicacin internacional: WO 00/06180 ee al (43) Fecha de publicaciin - imernacional: 10 de Febrero de 2000 (10.02.00) (21) Solicitud internacional: PCT/CU99/00003 | (81) Estados designados: BG, BR, CA, CN, HU, IN, JP, MX, RU, | UA, US, Patent europea (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, | (22) Fecha de ta presentacién internacional FF, FR, GB, GR, IE, TP, LU, MC, NL, PT, SE) | 28 de Julio de 1999 (28.07.99) | Pubiicada (G0) Datos relativos a Ia proridad: ‘Con informe de bisqueda internacional. | su vez no incrementan postriormente la intensidad de su coloracién. El producto cbtenido puede también ser empleado para el tratamiento 1108 28 de Julio de 1998 (28.07.98) CU (nh Soli unte (para todos los Estados designados salvo US): CENTRO DE HISTOTERAPIA PLACENTARIA [CUICUI, ‘Atopista Novia de Mediodia 1-173, Valle Grande, La Lisa, (Ciudad de ta Habana 17100 (CU), (22) Inventor; € (75) Inventorfsolicitante (s6lo US): MIYARES CAO, Carlos, | Manuel [CUICU}, Avenida 3ra, No. 03 ene Oy 2, Miramar, Playa, Ciudad de Ia Habana 11300 (CU). (74) Mandatario: MORENO SAMPER, Olga Lidia; Lex, S.A., ‘Avenida lra No. 1001 Esq. 10, Miramar, Playa, Ciudad de la Habana 11300 (CU). (G#) Tile: COMPOSITION FOR STIMULATING THE SYNTHESIS OF THE MELANIC PIGMENT AND PROCES ING IT FOR OB (64) Titulo; COMPOSICION PARA LA ESTIMULACION DE LA SINTESIS DEL PIGMENTO MELANICO Y PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCION ($7) Absteact ‘The present invention relates to the fel of human medicine and more specifically to dermatology, and in particular to composition developed for the stimulation of the synthesis of the melanic pigment of the skin, and consequently for the treatment of vitiligo. ‘The technical object ofthe present invention is to provide a composition of natural product useful in the treatment of vitiligo, whict has no toxie effects and no relapse. The composition Which has been obtained stimulates the synthesis ofthe melanic pigment ofthe skin and the reproduction of melanocytes as i¢ was demonstrated through pharmacological assays to which the composition was subjected, producing no Serious secondary reaction at al as demonstrated through toxicological, teratological and clinical assays which have been carted out; the resulting product ean be easly obtained and applied, the repigmentng effect starts rapidly aftr initiating the teatment, sad effect being | irreversible when stopping is application. The color acquited is identical to the color of areas of normal skin ofthe patient, bu said areas do not increase further the intensity oftheir coloration after the product has been applied. The product whic is obtained can also be used for the treatment of any depigmentation process of the skin, for example depigmentation caused by burs. (67) Resumen La presente invencién se relaciona con Ia rama de la Medicina Humana, y dentro de ella con ta Dermatologia, y en particular con ‘una composicidn desuroliada para Ia estimulacion de la sintesis del pigmento melinico de la piel, y por Io tanto util en el tratamiento del vitiligo. El objetivo ténico de le presente invencién es proporcionar una composicién de-un'producto de origen natural dtl en ef tratamiento del vitiligo, el cual no posee efectos téxicos y no recidiva de la enfermedad, La composicién obtenida estimla la sintsis de! pigmento melénico de la piel y la eprodueciGn de fos metancitos segin se demos en los ensayos farmacol6gicos a que fue sometido, tareciendo totalmente de reactiones secundaras severas como demuestran los enstyos toxcolépicos, teatolégicos yclinios realizados. [E producto obtenido es de fécil obtencién y aplicacién, el efecto repigmentante comienza répidamente después de inciar el tratamiento, siendo reversible al descontinuar su apicacion. El color adquirdo es idéntico al de las éeas de la piel normal del paciente, ls cuales a cualquier proceso de despiamentacién de la pel, por ejemplo aquel que se produce debido alas quemaduras.UNICAMENTE PARA INFORMACION Cédigos wilizados para identiicar a los Estados parte en el PCT en las piginas de portada de Ios follefos en los cuales se publican las soliitadesintemacionales en el marco del PCT. aia ‘meni ose ‘tal emi Heezorinn ate Beg Betis Fao Bela Bein ral Con Repblea Cnet Coren Cie ere Canerin com Repaien Checa ‘Alemania ois ks cA. Ga cE ou oN oR aU ® 8 i 2 KG KR Kz Le u uk wR Beas ‘ibn Reo Unido ‘orn ‘Ohms ‘alee Grecia Hong ince el ‘wai Te Sa Kens pine Reps Pople Donets de Coren Repbiea de Caen Kenna enn SiLanin er 1s un w W Me MD MG MK a MN sw Mx Ne No Ne vr RO. RU =» st so Leetio amin Lente ania ina Replica de Mo\owe Masse [Be Repiica Yogi Macedonia at Moneta Meo Ngee ibe Dae onees Nera Zalaia Peli Port! mania Fence Raia susie Suen Sapir S8EgSizgesgeaese Ww ona Biowsie Seep ‘Sandia Togo Tyke “Trg ‘Tal y Tago rane dor Unidos de Adin ates Vier Nam ego10 15 20 25 30 ‘Wo 00/06180 J PCTICU99/00003 COMPOSICION PARA LA ESTIMULACION DE LA SiNTESIS DEL PIGMENTO MELANICO Y PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCION. Sector Técnico La presente invencién se relaciona con la rama de la Medicina Humana, y dentro de ella con la Dermatologia, y en particular con una composicién desarrollada para la estimulacién de la sintesis del pigmento melanico de la piel, y por lo tanto util en el tratamiento del vitiligo, asi como con el procedimiento de obtencién de dicha composicién. Técnica Anterior EI vitiligo 0 leucoderma es una enfermedad dentro de las mas antiguas conocidas por la humanidad que se caracteriza por la pérdida de las células productoras del pigmento melanico en la piel. Esta enfermedad afecta aproximadamente al 1% de la poblacién mundial, sin distinguir edad, sexo, ni raza. Es de etiologia desconocida y sin una terapéutica definida hasta el momento, manifesténdose por una gradual despigmentacién de la piel de los pacientes sometidos a situaciones de tension nerviosa extrema, lo cual afecta desfavorablemente su psiquismo y conducta social una vez que se inician sus sintomas externos, bajo el aspecto de Areas de piel blanca rodeadas por un halo de hiperpigmentacién, manifestandose fundamentalmente en la cara, tronco o regiones articulares. Es conocido del estado, de 1a técnica que ciertas sustancias quimicas de origen vegetal o producidas semi-sintéticamente denominadas psoralenos, pueden ser empleadas para el tratamiento del vitiligo. Estas sustancias, al ser administradas por via oral o tépica, se concentran en los melanocitos 0 células productoras del pigmento dérmico, absorbiendo la energia proveniente de la radiacién ultravioleta ¥ promoviendo la produccién de dicho pigmento, la melanina (Arnold, M. J. Jr. “Psoralens and Suntan” Hawaii Med. J. 1987-16391); (Becker, S.W. Jr. “Methods of increasing skin pigmentation” J. Sec. Cosmetic HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 Wo 00/0610 PCTICU99/00003 Ehem, 1958-9-80); (Fitzpatrick, T.B. “Pigmentary Diseases” Current Therapy 1958-314); (Becker, S.W. Jr. “Effects of 8-Methoxy Psoralen and ultraviolet light in human skin”. Science 1958-127-878); (Sidi, E. Planat, P. “Practical considerations on actual treatment of vitiligo" Revue of Medicins, 1968-23 Dec). Sin embargo, los psoralenos no estan exentos de efectos téxicos secundarios, siendo capaces de producir dermatitis y necrosis de la piel al ser aplicadas por via topica. Ademés, su efecto es lento y reversible en la mayoria de los casos al descontinuar la medicacién Por otra parte estas sustancias presentan dificultades para su aplicacién, la cual requiere el incremento gradual del tiempo de exposicién diario del paciente a la radiacién ultravioleta, provocando en ocasiones reacciones toxicas severas como quemaduras debido a su administracién tépica o insuficiencia hepatica, trastornos digestivos, renales y nerviosos con su administracién por via oral. La solucién técnica andloga més cercana conocida a la presente invencion es la Melagenina Locién®, Patente No. FR 8220746. La Melagenina Locién® es un extracto alcohélico al 50% de placenta humana, la cual se obtiene de mujeres gestantes sanas en condiciones asépticas luego de partos normales. Este extracto contiene una lipoproteina de peso molecular entre 1500 - 4000 Daltons, la cual constituye su principio activo. Esta sustancia estimula la reproduccién de los melanocitos y la sintesis del pigmento melinico, acelerando ademas la oxidacién del aminodcido L-Dopa en presencia de luz solar, lo que favorece su transformacién en melanina luego de procesos quimicos internos. La Melagenina Locién® ha sido utilizada exitosamente hasta el momento para el tratamiento del vitiligo. De acuerdo a los ensayos clinicos realizados, su uso ha alcanzado una efectividad notable en todos los pacientes donde se ha aplicado (Miyares Cao C., Taboas M. y Lopez H. "Informe preliminar sobre el empleo de extracto placentario humano en la terapéutica del Vitiligo". Revista Cubana de Farmacia 10 HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WO 00/06180 3 PCT/CU99/00003 (1). 1976; Miyares Cao C. y colaboradores. Estudio experimental y clinico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano". Revista Cubana de Farmacia. Volumen 20, No. 6, Noviembre-Diciembre 1981; Sharma S. K.,. Jain R. K and Sharma A. K. Topical human placental extract for the treatment of Vitiligo, A preliminary study; Miyares C. Y colaboradores: Estudio experimental y clinico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano. Annais Brasileiros de Dermatologia. 1986: 61: 3 (suplemento); Miyares Cao C. Melagenina Producto Cubano. Nuevo y Eficaz medicamento para el tratamiento del Vitiligo. Serie de Resefias Nacionales, Ed. Palacio de las Convenciones. La Habana, Pag. 15. 1986), La Melagenina Locién®, aunque carece de efectos nocivos colaterales, es un producto que tiene que ser utilizado en tres aplicaciones diarias con intervalo entre ellas de 8 horas, y acompafiada de exposicién solar o infrarroja en una de las aplicaciones, lo cual dificulta el cumplimiento del tratamiento por una gran parte de los pacientes. Igualmente es conocido del estado de la técnica que el calcio tiene una participacion activa en le proceso de pigmentacién de la piel, mediante la estimulacién de la actividad secretora de los melanocitos, en relacién con la concentracién de este ién (Meyer, A. 1986. Influence of calcium on the melanocytes in the inner éar. Abst; 13% International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USA; Negishi, S. 1986. The role of calcium in. light response of onyzias melonophores. Abst; 13% International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USA) Divulgacién de la invencién La novedad de la presente invencién consiste en una nueva composicién conteniendo el mismo principio activo de la Melagenina Locién®, en este caso una alfalipoproteina obtenida a partir de los cotiledones placentarios humanos, mediante el procesamiento de éstos HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WO 00/06180 PCT/CU99/00003 con solventes organicos, y su posterior redisolucién en una solucién de etanol con cloruro de calcio, lo cual permite que se obtenga un producto que muestra un efecto sinérgico entre ambos componentes en su efecto pigmentante, reduciéndose asi el mimero de aplicaciones de dicho producto de 1 cada 8 horas por pacientes, a 1 cada 24 horas, climinandose ademas la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares 0 infrarrojas luego de alguna de las aplicaciones. El nuevo producto asi obtenido, denominado en Io adelante “Melagenina Plus”, puede ser empleado mediante una sola aplicacién diaria, lo que constituye la practica actual en la terapéutica mundial. Dicho producto estimula la sintesis del pigmento melanico de la piel y la reproduccién de los melanocitos como demuestran los ensayos farmacologicos a que fue sometido, careciendo totalmente de reacciones secundarias severas como demuestran los ensayos toxicolégicos, teratologicos y clinicos realizados. Es de facil obtencién y aplicacién, y el efecto repigmentante comienza rapidamente (15 a 20 dias) despues de iniciar el tratamiento, siendo irreversible al descontinuar la aplicacién del producto. El color adquirido por la piel donde se aplica es idéntico al de las areas de Ia piel normal del paciente, las cuales a su vez no incrementan la intensidad de su coloracién posteriormente. Como la materia prima de donde se extrae el principio activo del producto es un tejido humano, tampoco se producen reacciones inmunolégicas que temer, no existiendo contraindicaciones referentes a edad, sexo 0 raza para su uso. Obtencién del principio activo de la composicién Melagenina Plu: Para la obtencién del principio activo de la presente invencién se llevo a cabo el siguiente procedimiento: Se utilizé un kilogramo de cotiledones placentarios que se dejaron congelar durante 7 a 10 dias, después de lo cual fueron triturados y macerados con etanol de 90 a 96° a partes iguales peso/volumen. Se HOJA DE SUSTITUGION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WO 00/06180 PCT/CU99/00003 filtré este macerado a través de gasa tupida, dejandose reposar durante 24 horas. Al sobrenadante se le determiné su actividad pigmentante, la que fue positiva de 20 a 50 dias después de ser utilizado en forma tépica sobre orejas de ratén Balb/C 57 BL 6. ‘A 200 ml de este extracto con el factor pigmentante se le afiaden mediante una aguja hipodérmica 10 ml de una solucién saturada de Acido benzoico en etanol de 90 a 96° confeccionada disolviendo de 2 a 8 g de dcido benzoico en 5 a 12 ml de etanol de 90 a 96° La mezcla se agité de 10 a 50 minutos y se filtré con papel de filtro Whatman No. 2 a 5. A continuacién se realizé un lavado del precipitado obtenido con 200 a 500 mi de una solucién saturada de Acido benzoico en agua destilada confeccionada disolviendo de 2 a 10 g de Acido benzoico en 300 a 1000 ml de agua destilada. Después se removio el precipitado del papel de filtro y se le afiadio a éste de 100 a 500 ml de acetona pura al 30 %, se centrifugd a 1500 rpm durante 10 a 30 minutos, descartandose el sobrenadante. Se volvi6 a lavar de 2 a 10 veces mas el precipitado con 100 a 500 ml de acetona, secandose al vacio y a temperatura ambiente. El producto fue redisuelto en alcohol de 90 a 96° que contiene cloruro de calcio 0.2 a 4.0 mg/ml. 7 Cinco ml del anterior prosiucto con actividad biolégica se filtraron a través de Sephadex G-30 6 100 equilibrando con buffer fosfato de sodio 5 x 10! a 5 x 10 moles, pH = 4 a 8, el cual fue empaquetado en una columna de 1 a 3 cm de ancho y de 18 a 40 cm de altura. El flujo fue de 10 a 30 gotas por minuto y las fracciones recolectadas de 5 a 10 ml cada una. Se obtuvieron dos picos proteicos, el primero de 100 a 300 pg/ml y el segundo de 20 a 150 ug/ml. La actividad pigmentante fue positiva para el segundo pico, apareciendo a los 10 6 20 dias después de ser utilizada topicamente la mezcla liofilizada en el curiel. HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 Wo 00/06180 6 PCT/CU99/00003 Las mezclas liofilizadas de ambos picos proteicos se corrieron en electroforesis con gel de poliacrilamida y en agarosa, tiféndose la primera con un colorante para proteinas (amido black) y la segunda para detectar lipidos (sudan). En la electroforesis de proteinas se observo una banda pequefia coloreada seguida de otra sin colorear, ambas migraron poco; también se noté una banda bien visible en la region de la albtimina. En la electroforesis de lipidos solo se observé una banda en la regién en que migran las alfalipoproteinas. Efecto pigmentante sinérgico de la Melagenina y el Calcio. La evaluacién de la actividad melanocitopoyética del producto resultante se realiz6 mediante la aplicacion tépica de la Melagenina Plus durante un periodo de tiempo de 5 dias consecutivos en una ocasién diaria sobre la epidermis de las orejas de ratones negros de la cepa B6 D2. Para el ensayo se utilizaron 60 ratones negros separados en 4 grupos denominados A, B, C y D e integrados por 5 ratones cada uno, a los cuales se les aplicaron ios siguientes tratamientos. Grupo ‘Tratamiento tépico diario A Alcohol 70 %, como vehiculo de la Melagenina® (Control) B Solucién alcohélica al 70 % con adicién de cloruro de calcio en concentracién 1 mg/ml c Melagenina Locién® D Melagenina Locién con adicién de cloruro de calcio en concentracién de 1 mg/ml (Melagenina Plus) El alcohol al 70 %, la solucién alcohélica al 70 % con cloruro de calcio, 1 mg/ml, asi como la Melagenina Locién® y la Melagenina Plus fueron aplicados froténdolos con los dedos del operador sobre las orejas de los animales. Concluido el tiempo de tratamiento se dejan transcurrir 48 horas y se sacrifican los animales para posteriormente extraerles la epidermis de las orejas y someterlos a la técnica histoquimica de la L-Dopa oxidasa, HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WO 00/06180 PCTICU99/00003 que permite, mediante la observacién microscépica, el conteo de melanocitos por mm?en dicha estructura histolégica Para determinar el numero de melanocitos por mm? se seleccionan 5 areas diferentes de la zona mas densamente poblada de cada oreja y utilizando un programa particular elaborado para este fin (seccion especifica para conteo de células) se determin6 el numero de células por mm?en cada una de las 5 zonas de manera que se obtienen 150 valores de melanocitos por mm? para cada grupo (15 animales por grupo y 10 conteos por cada animal) Los valores obtenidos en el conteo de melanocitos por mm? fueron sometidos a anilisis de varianza de clasificacién simple y con posterioridad a un test de Kruskal-Wallis y test Student Newman-Keuls (SNK), a fin de determinar entre cuales grupos existian diferencias significativas. Los resultados obtenidos mediante la experiencia se pueden observar en la Tabla I, y quedando graficamente mostrados en la Figura 1. Tabla I ‘Test de Kruskal-Wallis Cantidad de melanocitos/ mm? x N 180.66 a 150 111.29 b 150 66.83 ¢ 150 62.79 ¢ 150 para p< 0.001 a= Melagenina Plus b= Melagenina Locién c= Alcohol al 70 % + Calcio 1 mg/ml d= alcohol al 70 % Se observé que para p < 0.001 existié un incremento significative del numero de melanocitos/mm? en la epidermis de las orejas de los HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WoO 00/06180 PCT/CU99/00003 ratones negros tratados con Melagenina Locién® y Melagenina Plus, respecto a los grupos tratados con alcohol y sin tratar. El incremento del mimero de melanocitos fue mayor en los animales tratados con Melagenina Plus. Otras diferencias encontradas fueron: * Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando Melagenina Locién® solamente. + Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol mas calcio solamente © Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol solamente. + Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Locién® y empleando alcohol mas calcio. + Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Locién® y el grupo Control tratado con alcohol solamente. + No existen diferencias significativas entre el grupo Control y el grupo tratado con alcohol mas calcio. Adicionalmente se comprobo que cuando se aplican indistintamente la Melagenina Locién® y la Melagenina Plus en ensayos biolgicos, se observé que en el caso de la Melagenina Plus el efecto pigmentante en pezones de curieles machos es visible en s6lo 13 dias, mientras que con la Melagenina Locién® esto ocurre a los 18 dias. De igual forma en la cola de los ratones negros se observa mayor concentracién de melanina al utilizar Melagenina Plus cuando los cortes son tratados por el método histoquimico, donde se observé a un mayor incremento de los melanocitos en la regién basal de la epidermis. Estudios de irritacién en piel de animales. Se aplicé el producto Melagenina Plus a un grupo de animales en un Area de 42 cm? con una dosis de 20 mg/cm? y en ese mismo animal HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 Wo 00/06180 PCTICU99/00003 se aplicé el solvente. Durante las dos semanas del experimento no se observé ningun tipo de irritacién o afectacién en la piel. Los estudios histopatolégicos no reflejan dafio. Como conclusién se puede sefialar que el producto Melagenina Plus no produce irritacién en la piel. Ensayos clinicos en humanos. Para llevar a cabo estos ensayos, se seleccionaron aleatoriamente, 30 pacientes enfermos de vitiligo. Los pacientes fueron separados en dos grupos de forma alterna denominados I y Il, ¢ integrados por 15 pacientes cada uno A los pertenecientes al grupo I se les indicé utilizar Melagenina Locién® (Extrato Alcohélico de Placenta Humana al 50 %) aplicandola tépicamente mediante frotacién con los dedos sobre las areas de piel despigmentadas por la enfermedad, en tres ocasiones diarias con intervalos de 8 horas (6.00 am, 2.00 pm y 10.00 pm). En una de estas ocasiones las areas tratadas debian exponerse @ lamparas de luz infrarroja de 250 watts de intensidad, colocadas a 40 cm de distancia, durante 15 minutos. La aplicacion del medicamento debe repetirse cada 5 minutos en ese intervalo de tiempo. A su vez los integrantes del grupo Il utilizarian Melagenina Plus (Extracto Alcohélico de Placenta Humana al 50% conteniendo Cloruro de Calcio) aplicandola de igual’forma pero en una sola ocasién diaria, sin la exposicién a la radiacién infrarroja y con intervalos de 24 horas. Los participantes en el ensayo debieron permanecer antes de su inicio sin tratamiento especifico alguno. Los pacientes objeto de la experiencia fueron evaluados mensuaimente durante un periodo de tiempo de 6 meses, fijado para comparar en ambos grupos el grado de repigmentacién obtenido con cada producto asi como la aparicion de reacciones secundarias. Se practicaron biopsias de areas de piel despigmentadas al inicio y final de la experiencia en 5 pacientes de cada grupo seleccionados HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)‘wo 00/06180 PCT/CU99/00003, 10 15 20 10 aleatoriamente. La técnica histolégica de L-Dopa oxidasa fue utilizada para identificar los melanocitos en las mismas. Conjuntamente se determinaron las diferencias en el consumo de frascos del medicamento en cada grupo. Para el procedimiento del andlisis estadistico del porcentaje de reduccién de la superficie corporal despigmentada en cada grupo, asi como para la determinacién de la misma por paciente, se utilizé un programa elaborado con tal objetivo (Coyula, R. Automatizacién de la Creacién de Historia Clinica de los enfermos de Vitiligo. 1ra Conferencia Latinoamericana de Aplicaciones de Ja Matematica y la Computacion a la Biologia, CENIC, 31 Oct. - 30 Nov. 1991, La Habana, Cuba). Los resultados obtenidos mediante dicho ensayo clinico se resumen en las Tablas If, Ill, IV y V., en las cuales se han considerado como datos de los pacientes el mimero de su historia clinica para su identificacién, la edad, el sexo, la raza y los afios que llevan padeciendo de la enfermedad. Entre los parametros que se han evaluado se encuentran el % de despigmentacién al inicio y al finalizar el tratamiento, el % de pigmentacién alcanzado y los frascos del medicamento consumidos durante dicho tratamiento. Asi mismo, las areas analizadas correspondientes a cada uno de dichos pacientes tratados (cara, cuello, tronco, extremidades o genitales) se muestran en la tabla relativa a cada tipo de tratamiento.‘Wo 00/06180 " PCT/CU99/00003, Tabla Il: Resultados aleanzados empleando la Melagenina Locion® PACIENTE | EDAD | SEXO] RAZA] ANOS DE % | FRASCOS No. He | (@tios) ENFERMO [INIC | FIN | PIGM 258 13 ™ | N 12 2% | 16 | 10 16 268 4 F |B 3 3 5 6 27 12 F B 2 3 6 286 5 F | 8 26 6 | 0 6 6 22 10 F | 8 3 4 | 21 3 16 253 36 F | 5 12 Th 2 12 Bar| a4 F B 10 a | ie | 7 18 591 2 F | M i 39 | 39 | 20 98 oF 5 ™ | M 3 38 | 30 | 28 8 77 4 apse 02 é é ae |e F | _N 10 13 12 we | 5 F [8 06 8 6 a2 YS ™ {N a5 a | 32 | 48 tou | 2 F | M 3 + 1044 27 ™ | B 3 6 HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)‘Wo 00/06180 Tabla UI: 12 Melagenina Locién ® PCTICU99/00003 Areas analizadas en pacientes tratados con "AREAS AFECTADAS POR VITILIGO PAGIENTE CARA | CUBLLO FRONCO EXTREMIDADES | GENITAL ANT. POST. | SUP. INF. 255 x x x 268 * a7 ¥ x x 286 eax x 292 ¥ ¥ 293 x | ¥ x Br ¥ * * * x wi x x alee ore 5a 53 x Ti x x * B49 x x xm 338 ¥ * | B52 ¥ % ¥ x 1021 x x 1044 x x HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)‘WO 00/06180 PCT/CU99/00003 13 ‘Tabla IV: Resultados alcanzados empleando la Melagenina Plus. PACIENTE | EDAD | SEXO ] RAZA] ANOSDE | % DESPIG | % | FRASCOS No. HC {afios) ENFERMO Loa] IGM 2 720 Mi M T Tae T 3 T F B 5 6 >a) 4 2 126 3 F WN O2 T [os | 05 T 134 3 F 5 O58 3 | 7 | 2 & 219 3 F B 3 0 |? | 3 3s 231 3 F B 3 aps | 8 4 sar 3 Mf 5 T 2 | 2 2 486 5 F W 2 aes: 2 ar 3 ¥ wt 4 a fa | 3 6 738 5 F B 3 T33| On aes 7 779 3 F W 06 2 | 2 2 7ei 3 we B 23 aie 2 388 7 MW B on im | 6 | 6 4 1096 6 F B TF im poy 4 7 Tie a Wt B T aap oe ei0) 6 HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)‘wo 0006180 PCT/CU99/00003 14 ‘Tabla V: Areas analizadas en pacientes tratados con Melagenina Plus "AREAS AFECTADAS POR VITILIGO PACIENTE | CARA | CUELLO TRONCO EXTREMIDADES | GENITALES No. HC TNC. FIN” |_ SUP, INF. z x T aI T x x 126 , x 154 ® * * x x 319 zr 3 3 3 X 723i x * * x 341 x 486 ¥ wr os lox x | * 733 53 1 * 779 ¥ ¥ 781 x x 388 x x |) 1096 x ¥ x X Tii6 ¥ x HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 WO 00/06180 15 PCT/CU99/00003 A partir de las tablas anteriores puede observarse que luego de concluidos los 6 meses de tratamiento, se aprecia un valor promedio de disminucién de la superficie corporal despigmentada por la enfermedad de 59.11% en el grupo tratado con Melagenina Locién® y del 50.79% en el tratado con Melagenina Plus, sin apreciarse diferencia significativa alguna entre ambos resultados para un valor p < 0.05 No se registraron reacciones secundarias locales o sistémicas en los pacientes de los grupos sometidos al ensayo. Las biopsias practicadas en los 5 pacientes cada grupo mostraron la reaparicién de los melanocitos en las areas de vitiligo seleccionadas para el estudio histolégico pre y post tratamiento. Finalmente se observé un mayor consumo de frascos de medicamento en el grupo tratado con Melagenina Locién® con un total de 264 y un promedio de 17,6 frascos por pacientes en los 6 meses que duré la experiencia, respecto al grupo tratado con Melagenina Plus, en el cual solo se utilizaron 56 frascos, con un promedio de 3.7 frascos por pacientes en igual tiempo. El estudio histolégico realizado demostré que el efecto repigmentante de ambos productos sobre las areas afectadas por vitiligo se debe a que los mismos inducen la reproduccién de los melanocitos en dichos sitios de nuevo. La ausencia de reacciones secundarias locales sistematicas reafirma la inocuidad de ambos productos. La accién sinérgica de} Calcio y la Melagenina facilita el cumplimiento del tratamiento por parte de las pacientes de vitiligo, reduciéndose el mimero de aplicaciones diarias del producto y por consiguiente el consumo de frascos en cada tratamiento. Asimismo la nueva formulacién permite que se climine la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares o infrarrojas luego de la aplicacién Breve descripcién de las Figuras. La Figura 1 muestra la accién melanocitopoyética obtenida mediante un ensayo en oreja de ratén negro, empleando grupos de HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)WO 00/06180 PCT/CU99/00003 16 animales a los cuales se les aplicaron diferentes tratamientos: ‘A= Melagenina Plus B= Melagenina Locion C= Alcohol al 70 % + Calcio 1 mg/ml D = Alcohol al 70% HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)10 15 20 25 30 ‘WO 0006180 PCT/CU99/00003 7 REIVINDICACIONES Procedimiento para la obtencién de una composicién para la estimulacién de la sintesis del pigmento melanico caracterizado porque comprende los siguientes pasos un kilogramo de cotiledones placentarios congelados es triturado y macerado con etanol de 90 a 96° a partes iguales peso/volumen, el macerado se filtra dejandose reposar durante 24 horas, 200 mi del extracto conteniendo el factor pigmentante se le afladen una solucién saturada de dcido benzoico en etanol de 90 a 96°, la mezcla se agita de 10 a 50 minutos y se filtra, lavado del precipitado obtenido con una solucién saturada de Acido benzoico en agua destilada, se remueve el precipitado y se le afiade acetona al 30%, se centrifuga el extracto a 1500 rpm durante 10 a 30 minutos descartandose el sobrenadante, lavado nuevamente del precipitado con acetona, secandose al vacio y a temperatura ambiente, redisolucién del producto en alcohol de 90 a 96° conteniendo cloruro de calcio 0.2 a 4.0 mg/ml, filtracion del producto obtenido mediante Sephadex equilibrando con buffer fosfato de sodio pH = 4 a 8. Composicion para la e’timulacién de Ia sintesis del_pigmento melénico caracterizada porque est constituida por una mezcla de extracto alcohélico de placenta humana al 50% conteniendo cloruro de calcio a una concentracién entre 0.2 y 4.0 mg/ml Uso de una mezcla de extracto alcohélico de placenta humana al 50% conteniendo cloruro de calcio a una concentracién entre 0.2 y 4.0 mg/ml para la fabricacién de un medicamento litil en el tratamiento del vitiligo caracterizado porque dicha HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)‘wo 00706180 PCTICU99/00003 18 mezcla se aplica tOpicamente a los pacientes mediante frotacion con los dedos en las areas afectadas como una tinica aplicacién diaria, sin necesidad de exposicin a la radi iodo de tratamiento infrarroja y topicamente durante un per entre 6 meses y un afio, en dependencia de la afectacion de la enfermedad. HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)WO 00/06180 PCTICU99/00003 1/i Figura 1 200 1807] 160 120. EINo. de es Melanocitos/mm? 607] 40. 20: HOJA DE SUSTITUCION (REGLA 26)INTERNATIONAL SEARCH REPORT International Appiation No f/cU_99/00003 TH SLASSOATION DE SURIECT UATE TPC 7” AGIK35/50 AGIK7/48 ‘Accarangto rtematonal ten Cason IP ort both aor asesson a1 2, FIELDS SEARCHED IPC 7 AGIK Tien Sa ta TAURI TSTAAT BNT AT ST {DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT ‘category *] Clsten cl cocanane wn deton, wren appreprae otha lear passages A FR 2 537 585 A (EMPRESA CUBANA IMPORTADORA Y EXPORTADORA DE PRODUCTOS NEDICOS ) 15 June 1984 (1984-06-15) cited in the application the whole document A Us 4 507 277 A (CARLOS M.M. CAO ET AL.) 26 March 1985 (1985-03-26) the whole document A EP 0 839 535 A (COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH) 6 May 1998 (1998-05-06) abstract page 2, line 31 -page 3, line & J] Fete documans ae bitin ne contmuaton ot Box DK] Par ty member a nea annex ‘peal caagresootegaoasrars © “tin Ste 12 November 1999 Tae and mang ares re Sa Euroesn PateeOten PS 50 Ne TBERD Reem fo (91-20) 6-200. Te 31 651 e900, Foe enh? 340-2086 Sakata aneanane saree rine eng he [_carenangatme mentee 26/11/1999 Alvarez Alvarez, C page 1 of 2INTERNATIONAL SEARCH REPORT -i/cU 99/0003, ‘iGantnantiony COGUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT Taegan] Graton a Goran wih RECHT ATE APSA, Oe NET FEEAIRE A JIMBOW K.: "Vitiligo. Therapeutic advances." DERMATOLOGIC CLINICS, vol. 16, no. 2, Aprii 1998 (1998-04), pages 399-407, XP002122297 page 403 A K. U, SCHALLREUTER ET AL.: “Treatment of vitiligo with a topical application of..." DERMATOLOGY , vol. 190, no. 3, 1995, pages 223-229 xP002122298 page 224, "Patients and Nethods" y “Results” A C. d. CARSBERG ET AL: “Intracellular calcium modulates the responses... JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE, vol. 9, no. 3, May 1995 (1995-05), pages 157-164, xP002122299 the whole document. page 2 of 2INTERNATIONAL SEARCH REPORT ‘formation on patent tami members Hee, CU_99/00003 Patent aoounent Pubicaton Patent arty Pusleaton ened in earch report ‘ate members) ate FR 2537585 A 15-06-1984 DE 3229738 A 16-02-1984 GB 2124900 A,B 29-02-1984 oP 1490517 ¢ 07-04-1989 JP 59044317 A 12-03-1984 JP 63038323 8 29-07-1988 SE 454745 8 30-05-1988 SE 8204625 A 10-02-1984 us 4507277 A 26-03-1985 NONE EP 839535 A 06-05-1998 us 5690966 A 25-11-1997INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL ‘Solicitud internacional N* Pericu9900003 ‘A. CLASIFICACION DE LA INVENCION IPC 7 A61K35/50 AGIK7/48 Segin Ia Clasificacion Internacional de Patents (IPC) ola clasificacin nacional y ta PC 'B__SECTORES COMPRENDIDOS POR LA BUSQUEDA Documentasién minima consutada (sistema de clasifiacin seyuido de los simbolos de clasicacion) ‘za dovumentacion consultada ademas de la docomentacin minima, en ln medida en que les documentos formen parte de ls setores comprendidos po i bisqueda ‘Bave de datos eecriva consultada darante a bisquda intemacional (nombre dela base de datos, cuando sea aplcable,ténminos de bisqueda utlizados) (C. DOCUMENTOS CONSIDERADOS PERTINENTES comes TWenificacion del documento, con indicaciOn, cuando sea alecuado, W de las revindicaciones 2 “____ de los pasajes pertinentes perinenes | A FR 2 537 585 A (EMPRESA CUBANA IMPORTADORA Y EXPORTADORA | DE PRODUCTOS MEDICOS) 15 de Junio de 1984 (15.06.84) Citede en ls demands Todo el documento A u ‘A (CARLOS MM. CAO ET AL) 2G de Marzo de 1985 (26.03.85) Todd el documento A | eP.839 535.4 (COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH) | 5 de Mayo de 1998 ((05 05.98) | Resumen vagina 2 linea 31. piping 3. linea 8 Ta contnuacton del Resto Cs elaconan ae anaes dccumentos adicionaen [2K] ease et Anexo dee fitn de pte > Gaeeisepscides de duende =F dosmanio lar puleds oa poaatonlad Ta de het pay gue eaten otis "4° deco ger deine’ ado que aca que nose ein ecard fo en ie cass como purSeennecio prtets ‘St que soniye as mente Scent pblenoenl ca dopants, on Ben A nls oe ee ee ‘puede considerarse nueva o no puede considerarse que implique “1 Shem ge te pone un te inning) Ee acm melee ane oad o qs ita para determina Ia fecha de publicacéa 4 yo documento de eapecialimportancs,o puede considera que Ik ‘i o por wa ean eopecial (coo la eepciina) Vrain rehgulcade apie acid ova coats “0 dasa gue eet nama deta crak sun ican UI, RC Toca Cae eee Se SS le SCORERS SSR pate es -P* donno plo an du ia pec emacoal, are Gn priordd a foc So pend evindcade 8" documento que forma prs dels misma fala de patenes Fecha cn Ta que se fa concluido efectivamente la bisqueda | Fecha de expedicion del informe de bisqueda intemacional ‘intemacional 12 de Noviembre de 1999 (12.11.99) 26 de Noviembre 1999 (26.11.99) Tombrey dreccion postal de la Administracion encargada de a | Funcionaro aitorizado ‘bisqueda internacional OFFICINA EUROPEAN PATENTES Fosimil Nt ‘Teléfono N* Formulario PCTASA/210 (sezunda hoja) (iio de 1992)INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Solicitud internacional Nv PCTICUI9/00003 ‘© (Continuacién), DOCUMENTOS CONSIDERADOS PERTINENTES Categoria* Tentifiacion del document, con indicacion, cuando sea aleeuado, ‘de los pasajes pertinentes W de ls eivindicaciones JIMBOW K, “Vitiligo, Therapeutic advances.” DERMATOLOGIC CLINICS, ‘ol 16, no, 2, Abril de 1998 (04:98) Paginas 399-407, XP 002122297 Piginas 403 KUL SCHALLREUTER ETAL. “Treatment of vitiligo with topics! upplivation of DERMATOLOGY. Vol 190, No.3. 1995, paginas 223-229. XPOO: Pagina 224."Paients and Methods” y “Results C.J. CARSBERG ET AL. “Intracellular ealeium modulates the responses JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE, Vol. 9. no, 3, Mayo de 1995 (05.1995), piginas 157-164, XPO902122299 Todo el documento ‘Formblarie PCT/ISA/210 (continuacion de la segunda hoja) Gulio de 1992)INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Informaciénrelativa a miembros de familias de patentes Solicitud internacional n° cu 99/00003 ‘Documento de patente citado Fecha de Miembro(s) de la Fecha de en el informe de biisqueda publicacién familia de patentes publicacién FR 2537585 A 15-06-1984 DE 3229738 A 16-02-1984 GB 2124900 A,B 29-02-1984 JP 1490517 ¢ 07-04-1989 JP 59044317 A 12-03-1984 JP 63038323 B 29-07-1988 SE 454745 8 30-05-1988 SE a204625 A 10-02-1984 Us 4507277 A EP 930535 A 26-03-1985 06-05-1998 NINGUNO Us 5690966 A 25-11-1997 ‘ormalario PCTASAI0 (enero familie de patones Guo 198)