TÉCNICAS DE TINCIÓN MEDIOS DE CULTIVO TÉCNICAS DE SIEMBRA

Tinciones Fundamento Función de los Colorantes Protocolo Esquema

Tinción de Gram Se trata de un método de tinción diferencial, divide a las bacterias El cristal violeta es básico (se une a componentes celulares de 1. Prepara extendido
en dos clases: Gram negativas y Gram positivas. carga negativa). Atraviesa la envuelta celular y se acumula en el  Suspender en el tubo
Medios de cultivo Función
citoplasma. Para facilitar la diferenciación se mezcla lugol con  2 a 3 gotas
Fenilalanina agarEl fundamento
Empleado para la determinar
radica la presencia
en la diferente dede
estructura la la
enzima
paredfenilalanina desaminasa
celular cristal violeta: en
el las bacterias.
complejo cristal violeta - lugol precipita. Así el
KIAde ambos
Es un medio diferencial complejo  30por segglucosa
a 1 minal 0,1%, lactosa al 1 5, tiosulfato de sodio, citrato férrico y rojo fenol como indicador de pH.
grupos: las bacterias Gram(de color rojo),
positivas tienenpermite la determinación
una gruesa de varias
lugol dificulta características
la salida enzimáticas
del cristal violeta dedeambos
la bacteria.
tiposEstá
de compuesto
2. Fijar frotis
McConkey agarcapaMedio selectivo que contiene
de peptidoglicano sales biliares
en su pared, mientrasy crista violeta
que las que inhiben
bacterias el crecimiento
células, pero es más de bacterias
fácil no entéricas.
de extraerlo Es también
de las Gram un medio
negativas que diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH.
Manitol sal agarGramMedio selectivo parauna
el aislamiento de Staphylococcus. 
de NaCl (7,5%) inhibe el crecimiento del resto de microorganismos,2con
Flamear a 3excepción
veces
negativas tienen capa de peptidoglicano más finaLay elevada
una deconcentración
las Gram positivas.  Inactiva las enzimas
de las bacterias halotolerantes.
y fija la morfología
MoellercapaMedio semisólido que
lipopolisacarídica externa.sirve para detectar la actividad descarboxilasa de las Enterobacteriaceae sobre los aminoácidos arginina, lisina y ornitina. Además de los nutrientes proteicos, el medio contiene glucosa y purpura de bromocresol como indicador de pH.
3. Cristal violeta
Mueller-Hinton agar o caldo Medio preparado con infusión de carne vacuna, peptonas seleccionadas y almidón. Es un medio recomendado para la prueba de susceptibilidad a antibacterianos por medio de difusión en agar. Es un medio adecuado para esta técnica debido al bajo nivel de inhibidores de
 1 min
Lassulfamidas,
bacterias Gramcomo positivas
timidina yy PABA, y por el contenido
Gram negativas se tiñen deconiones
el disolventes (Ca++ y Mg++). 4. Lavar excesoextracto
con agua
Nutritivo agarcristal
Medio económico
violeta, al añadirparaelellugol
cultivosedeaumenta
microorganismos
la afinidadque denolassean muy exigentes en sus requerimientos nutritivos. Normalmente contiene peptonas, de levadura o carne y NaCl.
Peptona caldobacterias
MedioGramutilizado como diluyente habitual. Se prepara disolviendo 5. Lugol
positivas y por ende al decolorar el frotis con 1 g de peptona y 8,5 g de NaCl por cada litro de agua.
Sangre agaralcohol
Medio  1 min
acetona solo las bacterias Gram negativas se decoloraran;suplementado con sangre desfibrinada de animal (5 - 8 %), que favorece el crecimiento de muchos microorganismos exigentes. Se emplea para la observación de la producción de hemolisinas.
enriquecido preparado como un medio base como TSA
Simmonsse leEste medio
añade indica
fucsina la capacidad
básica para teñirdelaslasbacterias
bacteriasGram
de metabolizar
negativas. el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio  como
Mordiente
indicador de pH. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse
Gram +  enAzul esteomedió,
Violetaal hacerlo utilizaran
los fosfatos presentes liberando amonio.  Aumenta la afinidad
Tripticasa soja agarLasMedio paraGram
bacterias el crecimiento
positivas se de observan
microorganismos
de color fastidiosos (exigentes en sus requerimientos nutritivos) aeróbicos o anaeróbicos. Se puedeDecolorar
azul o violeta, 6. con alcohol
utilizar como acetona
medio base para el agar sangre o agar chocolate. Normalmente, contiene varias peptonas CocosoGrampositivo
triptonas, NaCl y dextrosa.
Triptona caldomientras
Este medio contiene triptona con NaCl al 0,5%.
que las bacterias Gram negativas se observan de colorSe utiliza para la observación de la presencia de la enzima triptofanasa.  10 a 30 seg Staphylococcus epidermidis
Urea de Chistensen agarrojoMedio utilizado para detectar la actividad ureasa. Este medio se utiliza normalmente en slant. Lleva en su composición urea y un indicador
o fucsia. 7. Lavar con(rojo
de pH aguafenol). Muchos microorganismos poseen ureasa. Enzima capaz de hidrolizar la urea.
Voges-Proskauer Permite observar la formación de acetona a partir de ácido pirúvico. 8. Fucsina básica
 1 min
Gram -  Rojo o Fucsia
 Coloración de contraste
9. Lavar con agua
10. Observar Diplococos Gramnegativo
Neisseria meningitidis

Tinción de Ziehl Neelsen
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teñidas de La fucsina fenicada es capaz de teñir las células en caliente. El 1. Prepara extendido
resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Esta propiedad de fenol facilita la penetración de la fucsina en la envoltura celular.  Suspender en el tubo
algunos actinomicetos se correlaciona con el alto contenido de  2 a 3 gotas
lípidos de su pared celular, que confiere un ambiente muy La coloración requiere calentamiento para que el colorante  30 seg a 1 min
hidrófobo. Además, puede poseer unos lípidos característicos atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el 2. Fijar frotis
llamados ácidos micólicos que aumentan este carácter hidrófobo y calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva  Flamear 2 a 3 veces
les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol- solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya  Inactiva las enzimas y fija la morfología
ácido, después de la tinción con colorantes básicos. no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento 3. Fucsina fenicada
aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual  5 min
Las bacterias se tiñen con fucsina fenicada, se decolora con también facilita su entrada a las bacterias.
 Calentar
alcohol acido, y se le agrega azul de metileno como colorante de
 3 veces
contraste.
 Mordiente
Las bacterias acido-alcohol resistentes, tras la unión de la fucsina,  Hasta la 1era emisión de vapores
resisten al descoloramiento y se verán teñidas de rosado. El resto 4. Lavar con agua
de las baterías se decoloraran y se contrastan con azul de metileno 5. Lavar con alcohol acido
MICROBIOTA
adquiriendo un color azul. CONTROL MICROBIANO  ANTIBIOGRAMA 30 seg
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CONCEPTOS DEFINICIÓN
Cultivo puro Contiene sólo un tipo de microorganismos.
Cultivos Técnicas de siembra
Consiste Medio
en proporcionarles las condiciones físicas, químicas Método Esquema
y nutritivas Picadura
adecuadas para que puedan multiplicarse de
forma controlada.
Repique Transferencia de cultivos microbianos de medio solido a
sólido. De medio solido a medio líquido, de medio líquido a
líquido y de medio líquido aLiquido
medio sólido. Siembra en medio liquido por método de punción
Resiembra Se trasladan los microorganismos a partir del primer
sembrado, hasta otros medios de cultivo. Conviene hacerlo
cada cierto tiempo para evitar el exceso envejecimiento del
cultivo.
Siembra Es el acto de colocar
Punciónel material bacteriológico en el medio
de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y
subsiguiente multiplicación.

Semisólido Siembra de medio líquido a solido por método de punción

Estría

Semisólido Siembra de medio líquido a solido por método de estría

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Punción y estría

Semisólido Siembra de medio líquido a solido por medio de punción y estría

Agotamiento, diseminación o estría

Agar Siembra en placa por método de diseminación/agotamiento/estría/aislamiento

Superficie

Agar Siembra en placa por método de superficie

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Interpretación Esquema
Prueba bioquímica Fundamento Medio de cultivo Técnica empleada Reactivo revelador Presencia de Negativo Positivo
Kliger El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las  
bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir
sulfuro de hidrógeno (SH2). Fermentación de Glucosa Fondo Rojo Fondo Amarillo

Fermentación de Lactosa Bisel Rojo Bisel Amarillo

Agar inclinado Punción y estría Rojo Fenol

 

Presencia de Gas No ruptura del agar Ruptura del agar

Precipitado
Producción de H2S No hay precipitado
Negro

RMVP El test se usa para determinar la presencia de iones  

hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa.
Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen
ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que
utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen Rojo de Metilo (RM)
Liquido RMVP Picadura Fermentación Acido-Mixta (RM) Amarillo Rojo
acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, KOH + a-naftol (VP)
rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8.

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El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la  
glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo
puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales ácidos láctico, acético o
fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del
butilenglicol para formar como productos finales acetoína
(acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El Fermentación Butilen Glicolica Rosa o Rojo
Amarillo o Cobrizo
ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos (VP) (Tiempo)
metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína
se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La
sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de a-
naftol antes del agregado de KOH.

Citrato Un microorganismo que puede utilizar el citrato como  

única fuente de carbono también utiliza las sales de
amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La
extracción de nitrógeno de las sales de amonio produce
amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al Agar Estría Azul de Bromotimol Citrato Amarillo Azul
alcalino.

Reacción de nitratos El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico y  

dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reacción de
color se debe a la formación de un –compuesto diazonio,
p-sulfobenceno-azo-α-aftilamina. A-naftilamina Acido
Liquido Picadura Nitrito No coloración Rojo
Sulfanilico

Licuefacción de gelatina La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de  

gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los
aminoácidos que la componen pierde su característica de
gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten Presencia de enzima Enzima gelatinasa
la visualización macroscópica como la gelatina adherida a Agar Semisólido Punción Medio solido Medio liquido
gelatinasa (licuefacción/hidrolisis)
carbón activado.

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Coagulasa La enzima producida por S. aureus es excretada al medio  
extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta Caldo nutritivo Picadura
enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el Coagulasa Libre No coagulación Coagulación
plasma y formar un coagulo visible.
Agar nutritivo Punción --

Lamina Gota de plasma Coagulasa Ligada Grumos no visibles Grumos visibles

Desaminación de En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los  

fenilalanina nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo
bacteriano. El aminoácido fenilalanina sufre la
Desaminación oxidativa catalizada por la enzima
fenilalanina deaminasa (es una flavoproteína), para
producir ácido fenilpirúvico y amoníaco. La presencia del
ácido fenilpirúvico se demuestra con el agregado de
cloruro férrico en medio ácido, con el cual se forma un Superficie verde
Agar inclinado Estría Cloruro Férrico Ácido Fenilpirúvico No hay cambio
quelato de color verdoso entre el ácido fenil pirúvico y los oscuro
iones Fe3+. Además, en este medio se suele poner en
evidencia la producción de pigmentos melánicos, como en
el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa,
etc.

Producción de indol El indol es uno de los productos del metabolismo del  

aminoácido triptófano. Con un medio rico en triptófano, el
indol se puede detectar por su habilidad para combinarse Caldo Triofano 0,1% Reactivo de Kovacks
con ciertos aldehídos para formar un compuesto
coloreado. El ensayo constituye un método rápido para
detectar organismos productores de indol. Como indicador
Indol + Para- Superficie anillo Superficie anillo
de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Picadura
dimetilaminobenzoaldeido amarillo rojo
Es especialmente útil en la identificación preliminar de
Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Tira de papel filtro
Agua Peptonda 1%
Salmonella (-). con ácido oxálico

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Malonato El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias  
de utilizar malonato como fuente de carbono. Las
cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el
desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o
sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden
mantener un pH alcalino. La producción de ácido por la No hay cambio o
fermentación de la glucosa impide una posible Cado Malonato Picadura Azul de Bromotimol Alcalinidad Azul
Verde
alcalinización. Solamente los microorganismos que
pueden usar simultáneamente malonato de sodio como
fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno son capaces de ejercer una acción buffer
produciendo hidróxido de sodio.

Ureasa La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya  

hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de
amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se
sintetiza independientemente de la presencia o no de la
urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de
desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del Urea Picadura Rojo Fenol Enzima Ureasa No hay cambio Violeta
medio. Es una actividad 37 característica de especies de
Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de
Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-);
Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)

B-galactosidasa La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas;  

mientras la permeasa facilita la penetración de la molécula
de lactosa dentro de la célula bacteriana, la b-galactosidasa
hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las
bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas
enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen b-
galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil-b-D-
galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro Caldo ONPG Picadura -- B-Galactosidasa Incoloro Amarillo
estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de b-
galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y onitrofenil,
un compuesto color amarillo. Como la familia
Enterobacteriaceae se agrupa de acuerdo a su habilidad de
fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de
fermentadores de lactosa.

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Dexcarboxilasa La descarboxilación es un proceso en el cual las  
decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los
aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres
aminoácidos que se ensayan en la identificación de
Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La Purpura de
descarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y Agar Punción Lisina, arginina o ornitina Amarillo claro Purpura turbio
Bromocresol
putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina
por acción de una dihidrolasa.

Lia La descarboxilación de la lisina a cadaverina produce una  

alcalinización del medio y un viraje al violeta del
Alcalinidad Amarillo Purpura
indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene
lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa Purpura de
de la glucosa. Agar inclinado Punción y estría
Bromocresol  
Precipitado
Producción de H2S No hay precipitado
Negro

Mio Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de  

flagelos, así como las enzimas descarboxilasa de ornitina y
triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la Producción de Indol Amarillo Purpura
movilidad, descarboxilación de la ornitina y producción de
Purpura de
indol. Agar Semisólido Punción
Bromocresol  
Precipitado
Motilidad No hay precipitado
Negro

Sim Es un medio que se usa para determinar la formación de  

sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la Precipitado
movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias. Producción de H2S No hay precipitado
Negro

Agar Semisólido Punción --

 

Indol + Reactivo de Kovack No hay cambio Rojo

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Turbidez en el sitio Turbidez en todo
Motilidad
de la punción en medio

Hemolisina Se usa para ver la capacidad hemolítica de los  

microorganismos patógenos (que es un factor de Superficie Halo
A-hemolisis
virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de Verde Parcial
las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee:
alfa – halos verdosos (reducción de la hemoglobina de los Rodeado Zona
glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio), beta – Agar sangre Estría -- B-hemolisis No hay cambio Blanca Total
halos incoloros (hemolisis total), gamma – inexistencia de
halos (sin hemolisis)
G-hemolisis No hay cambio

Catalasa La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de  

Hidrogeno (H2O2) en agua y oxígeno. El peróxido de
Hidrogeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se
permite que se acumule resulta letal para la célula
bacteriana. La prueba de la catalasa se usa con mucha Caldo Picadura -- Actividad catalasa No burbujas Burbujas
frecuencia para diferenciar miembros de la familia
Micrococaceae de miembros de la familia
Streptococcaceae.

Citocromo c oxidasa Los citocromos son Hemoproteinas que contienen hierro y  

actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria Tetrametil-p-
aerobia, transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxígeno, fenildiamonio
con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra
en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de Oxalato de N-N-
modo que la prueba de Oxidasa es importante para dimetil-p-
identificar aquellos organismos que carecen de esta Caldo Picadura fenilendiamina 1% Citocromo C Oxidado No hay cambio Azul
enzima (anaerobios obligados). La prueba es muy útil para
diferencia Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de
Clorhidrato de
otras especies como Pseudomonas o Neisserias oxidasa
dimetil-p-
positiva.
feliendiamina

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Agentes físicos y químicos
Esterilización
Tindalización
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TÉCNICAS DE SIEMBRA
Función Procedimiento Esquema
Destrucción o eliminación de cualquier forma de vida. Autoclave
1. Comprobar el nivel del agua
Autoclave: 2. Colocar el soporte con los materiales
ü Olla de presión especial 3. Cerrar la tapa y apretar los tornillos
ü El vapor húmedo destruye eficientemente al degradar los ácidos nucleicos y 4. Prender el equipo
destruir las enzimas y otras proteínas 5. Colocar el termostato en presión alta
ü Altera la membrana celular 6. Cerrar la válvula de escape
ü Destruye rápidamente virus, bacterias y hongos 7. Vigilar el manómetro y termómetro
ü Ebullición x 10 min  15 libras 121 ºC
ü Destruye células vegetativas y esporas =100 ºC 8. Contar el tiempo
ü >100 ºC destruye endoesporas  15 min
ü Se usa para desinfectar agua y objetos que no se dañen con el agua 9. Se apaga el equipo
 No esteriliza 10. Enfriar el autoclave
 Manómetro = 0
Estufa: 11. Abrir válvula de presión
ü Necesita corriente 12. Esperar a que salga el vapor
ü Regular el calor con el termostato 13. Abrir equipo
ü Se usa cinta indicadora o testigo
ü 160 a 180 ºC x 2 a 3 horas
ü Oxidación de constituyentes celulares y la desnaturalización de las proteínas
ü No corroe el metal
ü Estelariza medios deshidratados, aceites y materiales similares
ü Utiliza placa de Petri y pipeta de cristal
 Es lenta e inapropiada con materiales termosensibles
1. Temperatura
 80 a 100 ºC
2. Tiempo
 30 min/día x 3 días
 1er día
 Destrucción de los microorganismos
 Incubar a 37 ºC
 2do día
Es una esterilización fraccionaria por vapor. Se puede utilizar materiales termosensibles.
 Germinación de las endosporas
 Calentar e incubar
 3er día
 Germinación de las endoesporas restantes
 Calentar
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Pasteurización
ü Proceso con calor controlado
ü Bajo punto de ebullición
ü Destruye agentes patógenos
ü 63 ºC x 30 min
 No esteriliza

HTST
Pasteurización rápida
Calentar rápidamente
72 a ºC 15 años

UHT
Esterilización a temperatura ultra elevado
140 – 15 ºC x 1 a 3 seg

Filtración
Reduce la población microbiana en materiales termosensibles.

De profundidad:
1. Materiales fibrosos o granulados
2. Forma capa gruesa rellena de canales retorcidos de un diámetro pequeño
3. Solución se aspira a través de una capa en vacías y las células microbianas
4. Se eliminan por cribosa o retención
 Tierra de diámetros
 Filtro de Bakersfield
 Asbesto o materias similares

De membrana:
1. Sustituyen laos profundidad
2. Membrana porosa
3. Grosor > 0,1 mm
 Acetalato de celulosa
 Nitrato de celulosa
 Policarbonato
 Fluoruro de polivinilo
 Materiales sintéticos
4. Sujetados en soportes especiales

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Radiación Ultravioleta
ü 260 nm
ü Letal
ü No atraviesa cristal o vidrio, película de suciedad o agua
ü Se colocar en techos
ü Esterilización al aire y superficies expuestas
ü Quema piel y lesiona los ojos

ü Ionizante
ü Agentes esterilizantes excelentes
ü Penetra profundamente los objetos
ü Esteriliza en frio:
o Antibióticos
o Hormonas
o Suturas
o Dispositivos desechables
ü Se emplea para esterilizar y pasteurizar carne y otros alimentos

Acción antiséptica de los colorantes

ü Lesionar las bacterias
ü Colorantes básicos (cristal violeta) reaccionan con los ácidos nucleicos de las
nucleoproteínas bacterianas por formación de sales
ü Las Gram positivas son más sensibles que las Gram negativas

Acción de agentes reductores

ü El formol es un gas fácilmente soluble en agua
ü Formalina es muy activa frente a bacterias, esporas y virus
ü Desinfección de secreciones, excreciones de enfermos y esterilización
hospitalarias.
ü Se emplea para inactivación de sesiones bactericida y en la papa ración de
toxoides

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Método Procedimiento Esquema
De dilución 1. Prepara en caldo esterilizado 20 ul/ mg de solución antibiótico
2. Preparar serie de tubos
 1 al 10
 Identificar
3. Colocar 0,5 mL de caldo
 2 al 10
4. Agregar 0,5 mL de solución antibiótica
 Tubos 1 y 2
 Mezclar
5. Transferir 0,5 mL del tubo 1 al 2
 Diluciones seriadas
 Hasta el tubo 9
6. El tubo 10 queda con la solución antibiótica
 Control
7. Agregar 0,5 de la dilución del cultivo
 1 al 10
8. Incubar
 35 ºC x 24 a 48 horas

De difusión Método de Kirby - Bauer

1. Sembrar el cultivo
 Hisopo estéril
 Placa de Petri
 Agar Muoller-Hinton
2. Secar al aire
 5 a 10 min
3. Colocar discos
 Separación 10mm x 7 a 8 discos
 Placa de 100 mm
4. Presionar levemente los discos
5. Incubar
 35 ºC x 24 a 48 horas
6. Medir diámetros de las zonas de inhibición
7. Comparar las medidas con el manual

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