Comparación de los niveles de la hormona anti-Mülleriana entre hembras

bovinas donadoras de oocitos de razas Brahman y Blanco orejinegro y su

relación con la reserva ovárica y producción de embriones in vitro en
condiciones del trópico bajo colombiano.

Andrés Castillo, Wilson Muños Estudiantes de MVZ X semestre

Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Directores: Diego Riveros MVZ, MsC; Diana Barajas MV, MsC, PhD
XX de Noviembre de 2020
 Contenido
 Introducción
 Justificación
 Problema de investigación
 Objetivo general y específicos
 Hipótesis

 Marco referencial
 Metodología
 Validación de la técnica de AMH
 Determinación de AMH en hembras
Brahman
 Análisis estadístico

 Discusión y Resultados
 Agradecimientos
 Justificación

600.000 familias se dedican a Genera empleo para 300.000 0.6 cabezas/Ha actual
la producción ganadera personas 4 ó 5 cabezas/Ha y se sugiere

- Mayor población bovina para

la población humana creciente

- Cubrimiento de la demanda
comercial

(ENA-DANE, 2018)
 Justificación

Biotecnologías en
reproducción bovina

Transferencia de Producción de
embriones embriones in vitro
Seleccionar animales
con alto potencial
reproductivo bovino

Población de folículos Desarrollo de métodos

antrales del ovario (PFA) predictivos de PFA,
Características Reserva ovárica y
fisiológicas embriones
reproductivas
individuales
(Ireland et al., 2010; Pontes et al., 2011)
 Problema de investigación

Resultados variables en la eficiencia de PIV-TE

Batista et al., Batista et al., Guerreiro et Guerreiro et

2016 2016 al., 2016 al., 2016
Folículos
aspirados (n) 47.1 ± 6.3 24.9 ± 3.6 54.3 ± 6.1 20.9 ± 1.5
CCOs
cultivados 18.1 ± 4.0 4.7 ± 1.3 23.0 ± 2.7 12.3 ± 1.3
(n)

Blastocistos
9.3 ± 2.0 0.5 ± 0.3 7.0 ± 1.7 3.0 ± 0.7
(n)
 Problema de investigación

 El éxito de la producción y transferencia de embriones (TE) es altamente dependiente de las

características fisiológicas individuales del animal, tal como la calidad oocitaria y la población de folículos
antrales (PFA) en los ovarios (Ireland et al., 2007; Pontes et al., 2011; Baldrighi et al., 2014; Batista et al.,
2014).

 Los profesionales especializados en esta área aún no poseen métodos o herramientas diagnósticas
para predecir con gran certeza, las hembras donadoras de embriones con alto potencial reproductivo
 Objetivo general

Comparar los niveles de la Hormona Anti-Mülleriana (AMH) entre hembras

bovinas donadoras de oocitos de razas Brahman y BON y su relación con la
reserva ovárica y producción de embriones in vitro en condiciones del
trópico bajo colombiano.
 Objetivos específicos

 Evaluar los niveles séricos de la AMH y la reserva ovárica en hembras bovinas

donadoras de oocitos de raza Brahman y BON en condiciones del trópico bajo
colombiano.

 Comparar entre las hembras bovinas de raza Brahman y BON asociaciones entre los
niveles séricos de la AMH y la población de folículos antrales.

 Comparar entre las hembras bovinas de raza Brahman y BON asociaciones entre los
niveles séricos de la AMH y producción de embriones in vitro.
 Hipótesis

Las hembras bovinas de razas

Brahman y BON con alta reserva
ovárica y producción de embriones in
vitro presentan entre ellas niveles
séricos de la AMH similares, en
contraste con las que presentan las
hembras bovinas de razas Brahman y
BON con baja reserva ovárica y
producción de embriones in vitro.
 Marco referencial

Las hembras bovinas Bos indicus

poseen mayor PFA que las Bos AMH es una medida indirecta de la reserva del
taurus. número de folículos en los ovarios (Ireland et al.,
(Batista et al., 2014; Baldrighi et 2010).
al., 2013; Rico et al., 2012)
Mejora la producción de Glicoproteína producida
E2 dependiente de FSH en las células de la
por las células de la granulosa de folículos
granulosa. preantrales y antrales
pequeños
 AMH y su Biofisiología
AMH en la vida prenatal AMH en animales ciclando

(Alward & Bohlen, 2019)

 Estudios de AMH asociados a fertilidad en hembras bovinas

 Ireland et al. (2008): La AMH podría ser un marcador fiable para predecir el número relativo de
folículos morfoligamente sanos en Bos taurus.

 Jimenez-Krassel et al. (2015): La AMH en novillas de levante para producción de leche puede ser un
método de diagnóstico para predecir la longevidad del hato y un marcador fisiológico útil para mejorar
los sistemas de crianza.

 Pfeiffer et al. (2014): En vacas la determinación de la AMH durante el ciclo estral no se vio
influenciada por la sincronización hormonal y señalaron la posibilidad de medir AMH en cualquier
momento del ciclo estral sin realizar un protocolo de IATF.
 Estudios de AMH asociados a fertilidad en hembras bovinas

Alta asociación en la PIV los Producción de embriones in vivo y Vacas con baja concentración de
niveles séricos de la AMH con un respuesta superovulatoria en de AMH presentaron menor % de
con un r=0.65. vacas primíparas y multíparas. % de preñez después del primer
servicio y mayor incidencia de la
perdida de gestación entre los 30 y
30 y 65 días.
AMH ≠ IATF.

(Souza et al., 2015; Gamarra et al., (Monniaux et al., 2010; Rico et al., (Ribeiro et al., 2014)
Gamarra et al., 2014; Guerrero et al., 2012; Souza et al., 2015)
Guerrero et al., 2015; Vernunf et
 Metodología

 1. Determinación de la AMH en hembras donantes  2. Determinación de la AMH en hembras donantes

Brahman BON
 Animales:  Animales:
42 Hembras Brahman 38 Hembras bon
Criterios de inclusión Criterios de inclusión
Criterios de exclusión Criterios de exclusión
 Metodología

 Localización del área de estudio

Las pruebas de laboratorio

El presente estudio se desarrolló en la central de
reproducción y genética EMBRIOVET SAS ubicada en la
se realizaron en las
Hacienda La Marina, en el municipio de San Martin, Meta. instalaciones del laboratorio
de serología de la
A una altitud de 372 msnm, temperatura anual promedio Universidad de Cooperativa
de 26.9 ± 3.0 °C y una precipitación pluviométrica anual de Colombia, campus
de 2832 mm. Villavicencio.

(IDEAM, 2020).
 Metodología
Determinación técnica AMH
Venopunción de la vena coccígea antes de iniciar la sesión comercial
de OPU
Muestreo Separación del plasma sanguíneo.
sanguíneo Transporte muestras (4 °C)
Almacenamiento (-70 °C)

Tabulación y análisis
de resultados. OPU
ANOVA

Análisis de laboratorio
Estandarización (Bovine AMH
ELISA, ref: AL-114, Ansh
Labs®).
 Metodología

Hembra bovina de raza Brahman de la hacienda La

Marina utilizada en el proceso de investigación
(Fuente: Elaboración propia).
 Metodología

Realización de evaluación ecográfica y tomas de muestras sanguíneas de las

hembras en el proceso de selección de animales para la investigación
(Fuente: Elaboración propia).
 Metodología

Ejecución de la técnica ELISA para la medición de AMH desarrollada en

laboratorios de la Universidad Cooperativa de Colombia
(Fuente: Elaboración propia).
 Análisis estadístico

 Prueba de Kolmogorov-Smirnov para distribución normal.

 Estadística descriptiva expresada como media ± error estándar de la media (SEM) a excepción de la
correlación.
 Las concentraciones séricas de AMH de las 80 donantes de oocitos de raza Brahman y BON fueron
clasificadas en 3 grupos como AMH baja, intermedia y alta.
 Las diferencias estadísticas para las variables concentración de AMH, número de folículos y número de
blastocistos fueron dilucidadas por medio de ANOVA seguido por prueba de Kruskall-Wallis (p < 0.001).
 Software Epidat 4.1.
 Resultados y discusión
Población de folículos y AMH en donantes Brahman

Concentración Total de folículos presentes

AMH categorizada Valor p
ng/mL en la sesión de OPU ± DE

Alta 1.52 (1.14 – 1.89) 36.40 ± 5.94 0.001

Intermedia 0.81 (0.46 y 1.13) 21.20 ± 4.30

Baja 0.23 (0.09 a 0.45) 4.20 ± 3.30

La media general: 0.78 ± 0.34 ng/mL

La mediana general: 0.72 ng/mL
 Resultados y discusión
Población de folículos y AMH en donantes BON

Concentración Total de folículos presentes

AMH categorizada Valor p
ng/mL en la sesión de OPU ± DE

Alta 1.04 (0.92 – 1.19) 18.3 ± 4.94 0.001

Intermedia 0.76 (0.42 y 0.91) 11.6 ± 4.60

Baja 0.31 (0.13 a 0.49) 5.25 ± 3.30

La media general: 0.72 ± 0.32 ng/mL

La mediana general: 0.75 ng/mL
 Relación entre los niveles de AMH
y población de folículos antrales en Brahman

50
Número de folículos

40

30

20

10 r= 0.77
0 p < 0.001
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
Concentración de AMH ng/mL
 Relación entre los niveles de AMH
y población de folículos antrales en BON

50

40
Número de folículos

30

20

10 r = 0.74
p < 0.001
0
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
-10
Concentración de AMH ng/mL
Concentración AMH Medición de la Relación AMH con
Nº folículos Raza Referencia bibliográfica
(ng/ml) AMH PFA

0.81 ± 0.44 ELISA 21.2 ± 4.3 r = 0.77

Brahman Presente estudio
P < 0.001 AMH AL-114 P < 0.0001 P < 0.0001

0.76 ± 0.39 ELISA 11.6 ± 3.2 r = 0.74

BON Presente estudio
P < 0.001 AMH AL-114 P < 0.0001 P < 0.0001

0.13 ± 0.02 24.1 ± 1.3 Baldrighi et al., 2014

Kit de ELISA DSL-10 - r = 0.82
0.54 ± 0.11 68.5 ± 17.5 Novillas Holstein
1444 P < 0.001
P < 0.001 P < 0.001
0.41 ± 0.05 44.3 ± 10.2
Kit de ELISA DSL-10 - r = 0.78
1.06 ± 0.18 96.7 ± 23.1 Novillas Gyr Baldrighi et al., 2014
1444 P < 0.001
P < 0.001 P < 0.001
0.8 Kit de ELISA 17.8 ± 3.8 r = 0.64 Vacas Nabenishi
P < 0.05 AMH Gen II P < 0.05 P ≤ 0.004 Japonés negro et al., 2017
Batista
1.1 ± 0.2 Kit de ELISA 47.1 ± 6.3 r = 0.86 Novillas
et al., 2016
P = 0.01 AMH AL-114 P = 0.003 P < 0.0001 Nelore

0.6 ± 0.07 Kit de ELISA 24.9 ± 3.6 r = 0.78 Novillas Batista

P = 0.03 AMH AL-114 P = 0.01 P < 0.0001 Holstein et al., 2016
0.2 ± 0.01 13.6 ± 0.9
Kit de ELISA r = 0.61 Vacas Guerreiro
0.4 ± 0.02 20.9 ± 1.5
AMH AL-114 P < 0.0001 Holstein et al., 2014
P < 0.0001 P < 0.0001
0.5 ± 0.05 18.6 ± 2.1
Kit de ELISA r = 0.84 Vacas Guerreiro
2.0 ± 0.3 54.3 ± 6.1
AMH AL-114 P < 0.0001 Nelore et al., 2014
P < 0.0001 P < 0.0001
 Relación entre las concentraciones AMH
y el número de blastocistos en Brahman

18
16
Número de blastocistos

14
12
10
8
6
4
2
r= 0.55
0 p < 0.001
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
Concentración de AMH ng/mL
 Relación entre las concentraciones AMH
y el número de blastocistos en BON

12
10
Número de blastocistos

8
6
4
2 r= 0.62
0
p< 0.001
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
-2
Concentración de AMH ng/mL
 Discusión de la relación entre las concentraciones AMH
y el número de blastocistos

 En este estudio se encontró una correlación positiva moderada entre las concentraciones sanguíneas de
AMH y el número de embriones, estos resultados coinciden parcialmente con los obtenidos en el trabajo
de Monniaux et al. (2010), quienes encontraron una correlación positiva entre la concentración de AMH de
las vacas donantes y el número de embriones por vaca (r=0.49 p<0.0001).

 La asignación de las vacas donantes a diferentes grupos según la concentración de AMH puso en
evidencia que las vacas con concentraciones plasmáticas de AMH entre 0.10 a 0.20 ng/mL y mayores a
0.20 ng/mL produjeron mayor cantidad de embriones transferibles que las vacas con valores menores a
0.01 ng/mL de AMH.
 Discusión de la relación entre las concentraciones AMH
y el número de blastocistos

Hasta donde sabemos, este es el primer informe comparativo de concentraciones séricas

de AMH en Bos indicus (Brahman) y Bos taurus (BON) y aporta nuevas información sobre las
diferencias en la foliculogénesis y fisiología reproductiva de estos dos grupos genéticos. Los
datos han demostrado que AMH podría ser un marcador endocrino satisfactorio de reserva
ovárica tanto en bovinos Bos indicus (Brahman) y Bos taurus (BON).
 Discusión de la relación entre las concentraciones AMH
y el número de blastocistos

 Los resultados de este estudio también son similares con los de Batista et al. (2016), en los que se
observó una correlación positiva entre la concentración plasmática y el número de blastocistos
producidos de terneras donantes de raza Nelore (r=0.62) y Holstein (r=0.58).

 En otro estudio realizado por Guerreiro et al. (2014), las donantes clasificadas con niveles altos de AMH
produjeron un número significativamente mayor de embriones (Holstein: 3.0 ng/mL; Nelore: 7.0 ng/mL)
en comparación con aquellas de bajos niveles de AMH (Holstein: 1.2 ng/mL; Nelore: 2.2 ng/mL).
 Conclusión

La prueba comercial de ELISA para análisis de AMH en bovinos es una metodología
confiable para hembras de la raza Brahman y BON. A través de este estudio es posible
afirmar que las donantes de raza Brahman poseen una mayor concentración de AMH y a
la vez una mayor reserva ovárica comparada a la concentración de AMH y a la reserva
ovárica de donantes de la raza BON en condiciones del trópico bajo colombiano, sin
embargo una mayor correlación entre la concentración de AMH y embriones en las
donantes BON que en las donantes Brahman.
 Conclusión

A pesar de que se apoya la tendencia de que las concentraciones de la AMH es una

herramienta que permite medir la reserva ovárica en donadoras de oocitos, siendo en
este estudio tanto para la raza Brahman y BON, se sugiere realizar estudios que
permitan determinar no solo la reserva ovárica en cuanto a cantidad sino también a
calidad, para aumentar la confiabilidad en la predicción de seleccionar animales con alto
potencial reproductivo y de esta manera aumentar la eficiencia de las biotecnologías
reproductivas en bovinos en condiciones del trópico bajo colombiano.
 Agradecimientos

Título del proyecto: Comparación de los niveles de la hormona anti-Mülleriana entre

hembras bovinas donadoras de oocitos de razas Brahman y Blanco orejinegro y su relación
con la reserva ovárica y producción de embriones in vitro en condiciones del trópico bajo
colombiano.

Doctores: Diego Riveros, Diana Barajas y Alberto Rocha.

 Citas referenciadas en la presentación

1. Alvarez, P., Spicer, L. J., Chase, C. C., Payton, M. E., Hamilton T. D., Stewart, R.E., Hammond, A.C., Olson, T.A., Wettemann, R.P. (2000). Ovarian and
endocrine characteristics during an estrous cycle in Angus, Brahman, and Senepol cows in a subtropical environment. J Anim Sci, 78:1291-1302.
2. Baruselli, P. S., Batista, E. O. S., Vieira, L. M., & Souza, A. H. (2015). Relationship between follicle population, AMH concentration and fertility in
cattle. Anim. Reprod, 12(3), 487-497
3. Batista, E.O.S., Macedo G.G., Sala R.V., Ortolan M., Sá Filho M.F., Del Valle T.A., Jesus E.F., Lopes R., Rennó F.P., Baruselli P.S. (2014). Plasma anti-
mullerian hormone as a predictor of ovarian antral follicular population in Bos indicus (Nelore) and Bos taurus (Holstein) heifers. Reprod Domest Anim,
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4. Block, E. 1952. Quantitative morphological investigation of the follicular system in women: Variations at different ages. Acta Anat. (Basel) 14:108–123.
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6. Chalabi S.S., Wattar Y., Algalili I. 2012. Anti-Mullerian Hormone is a significant Marker for Male infertility. Tikrit Journal of Pharmaceutical Sciences. 8: 1-5.
7. Cushman, R.A., De Souza J.C., Hedgpeth V.S., Britt J.H. 1999. Superovulatory response of one ovary is related to the micro- and macroscopic
population of follicles in the contralateral ovary of the cow. Biol Reprod, 60:349-354.
8. Durlinger ALL, Visser JA, Themmen APN. 2002a. Regulation of ovarian function: the role of anti-mullerian hormone. Reproduction; 124: 601-609.
9. Durlinger ALL, Kramer P, Karels B, Jong FH, et al. 1999. Control of primordial follicle recruitment by anti-mullerian hormone in the mouse ovary.
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10. Durlinger ALL, Gruijters MJ, Kramer P, Karels B, et al. 2001. Anti-mullerian hormone attenuates the effects of FSH on follicle development in the mouse
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11. Guerreiro, B. M., Batista, E. O. S., Vieira, L. M., Sá Filho, M. F., Rodrigues, C. A., Netto, A. C., ... & Accorsi, M. (2014). Plasma anti-mullerian hormone:
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12. Jimenez Krassel, F., Scheetz, D. M., Neuder, L. M., Ireland, J. L. H., Pursley, J. R., Smith, G. W., ... & Lonergan, P. (2015). Concentration of anti-Müllerian
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13. Pfeiffer, K. E., Jury, L. J., & Larson, J. E. (2014). Determination of anti-Müllerian hormone at estrus during a synchronized and a natural bovine estrous
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