UN AVANCE CIENTÍFICO O NOTICIA RELACIONADO SOBRE EL RASTREO DE

GENOTECAS

En muchos programas biotecnológicos de nueva generación se pretende aislar algún gen que
determine una proteína de interés. En muchos casos, para lograr esto se suele recurrir a la
creación de una genoteca para rastrear luego en ella en busca de dicho gen.

Una genoteca (también llamada biblioteca génica) es una colección desordenada de clones de
un microorganismo huésped en el que hemos introducido (con un vector adecuado) todo el
genoma del organismo de interés en forma de trozos aleatorios. En teoría, una genoteca
genómica debería representar el genoma completo en forma de un conjunto de fragmentos
clonados parcialmente solapados, producidos de modo aleatorio y mantenidos de forma
estable en la que no haya una mala representación de secuencias. Los pasos principales para
producir una genoteca genómica son:

El ADN genómico del organismo de interés se rompe en trozos aleatorios de tamaño medio
adecuado a la capacidad del vector que luego vamos a usar. Es muy frecuente que para ello
ese ADN se trate con una enzima de restricción que reconoce una diana de 4 pares de bases
(pb), como la Sau3AI. Ahora bien, si dejáramos que dicha enzima digiriera totalmente el
ADN, produciría por término medio un corte cada 256 pb, lo que rendiría trozos demasiado
pequeños como para albergar genes completos (que suelen medir más de 1000 pb). Por lo
tanto, lo que se hace es proceder a una digestión parcial del ADN con la enzima,
controlando la dosis para que el tamaño medio de fragmentos esté dentro del margen que
nosotros deseamos (p. ej., 10 kb).
Se recuperan los fragmentos aleatorios de ADN del rango de tamaños deseado
Se mezclan los fragmentos con un vector genético tratado con un enzima de restricción que
produce extremos cohesivos del mismo tipo que los generados por la Sau3AI. Ahora se
añade la ligasa de ADN, de modo que cada trozo de ADN del organismo de interés se liga
covalentemente con una copia del vector. El resultado son miles de moléculas
recombinantes, cada una consistente en el vector unido a un trozo diferente del ADN
genómico original.
Dichas moléculas recombinantes se introducen (p. ej., por transformación) en un organismo
o agente huésped: una bacteria como E. coli, fagos, etc. De este modo hemos logrado la
genoteca genómica: disponemos de miles de clones independientes del huésped, cada clon
con una molécula recombinante portadora de un trozo de ADN genómico del organismo de
partida.

Una vez disponible la genoteca, lo que nos queda es rastrearla en busca del clon o clones que
porten el ADN con el gen o genes de interés. Esta operación, al igual que lo que ocurría con
el screening de microorganismos para buscar sustancias útiles, puede ser más o menos fácil o
directa, dependiendo de si disponemos o no de alguna estrategia racional de selección o de
rastreo. Los métodos más frecuentes de identificación de clones recombinantes de interés en
una genoteca son:
Hibridación de ADN usando alguna sonda marcada
Rastreo inmunológico (uso de anticuerpos frente al producto de interés)
Rastreo o selección de la actividad biológica de la proteína

Rastreo por hibridación de ADN

Su fundamento estriba en la posibilidad de formación de ADN de cadena doble entre cadenas
sencillas del ADN a sondear y cadenas sencillas de ADN marcado (ADN sonda). Un esquema
de cómo se rastrea una genoteca sería como sigue:
 Los miles de colonias de una genoteca se replican a filtros de nylon o de nitrocelulosa
situados sobre medio de cultivo sólido, y se incuban hasta que aparezcan las colonias de
réplica.
Las células de las colonias se lisan in situ con un tratamiento suave
El ADN de las colonias se desnaturaliza (se convierte a cadenas sencillas) y se fija a los
filtros mediante alta temperatura
Por otro lado, se ha preparado el ADN sonda marcado de alguna manera que luego sea fácil
de detectar (véase más abajo)
El ADN sonda se desnaturaliza para convertirlo a cadenas sencillas
Ahora mezclamos el ADN sonda desnaturalizado y marcado con los filtros que contienen el
ADN de la genoteca (igualmente desnaturalizado). Si el ADN sonda tiene cierto grado de
homología con el ADN de alguno de los clones, se emparejará con dicho ADN para generar
doble hélice. El ADN del resto de los clones no puede emparejarse con la sonda. En el
lavado ulterior eliminamos el exceso de sonda, quedando sólo aquella sonda unida por
dobles enlaces al ADN de los clones con los que tiene homología de secuencia.
Finalmente revelamos el resultado. Esto suele consistir en que encontraremos una mancha
peculiar correspondiente a la colonia o colonias que hayan dado la hibridación con la sonda.
Con esta información vamos a las placas matrices donde están las colonias originales de
células vivas, y recuperaramos los clones, que podemos seguir estudiando.
El ADN de la sonda se puede marcar de varias maneras, pero en general hay que disponer de
un cebador, un corto fragmento de ADN que aporte extremos 3’-OH para la actuación de la
ADN polimerasa. Últimamente se utiliza mucho la estrategia llamada de los cebadores
aleatorios: 
El ADN que queremos convertir en sonda se desnaturaliza
Se le añade una mezcla con todas las secuencias posibles de 6 nucleótidos. Algunos de los
hexanucleótidos encuentran su secuencia complementaria en el ADN de cadena sencilla de
la sonda, y se emparejan con ella por puentes de hidrógeno
Ahora añadimos los 4 desoxirribonucleósido-trifosfatos (dNTPs), de los que uno está
marcado, y la porción Klenow de la ADN-polimerasa I de Escherichia coli (este fragmento
posee la actividad polimerasa 5’  3’, pero carece de la exonucleasa en 5’). Los extremos
3’-OH de los cebadores aleatorios suministran el sitio para que la Klenow comience la
copia de la cadena molde, incorporando la marca portada por uno de los dNTPs. El
resultado es que se sintetiza una cadena de ADN marcada.

Fuente:
http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/IngGenet.htm#_Toc30851506
Regulación celular por protein fosfatasa 1 

Para identificar nuevos proteínas reguladoras de PP1, se han empleado diferentes

aproximaciones experimentales. Un buen número de subunidades reguladoras se han
identificado por rastreo de genotecas por el método de los dos híbridos. Utilizando este
método hemos aislado e identificado una nueva subunidad reguladora que se ha denominado
SIPP1(por splicing factor que interacciona con PQBP1 y PP1) . Se trata de una proteína
modular de 641 aminoácidos en la que se puede identificar una señal bipartita de localización
nuclear (NLS), una región coiled-coil, dos regiones ricas en prolina y una región rica en
residuos de ácido aspar tico 

Varias líneas de evidencia sugieren que SIPP1 es un activador del splicing de pre-mRNA.
Así, SIPP1 interacciona con RNA y se localiza en los speckles nucleares que funcionan como
depósito de factores de splicing. Mas recientemente, SIPP1 ha sido identificado por
espectrometria de masas como un componente de los spliceosomas los complejos de proteína
nuclear y RNA,que catalizan el splicing de pre-mRNA. Utilizando un sistema reportero de
splicing hemos encontrado que derivados de SIPP truncados inhiben el proceso de splicing.
La funcion precisa de SIPP1 y PP1 en el proceso de splicing es todavía desconocida. 
Otro de los objetivos de nuestro trabajo es un mejor conocimiento de la función de SIPP1 y de
su asociación con PP1 y para ello nos hemos enfocado en los ligandos de SIPP1. Asi uno de
los aspectos estudiados es la interacción con la proteina Npw40/PQBP1 otra proteina nuclear
con la que colocaliza en orgánulos nucleares de función desconocida. PQBP1 contiene un
dominio WW por el que interacciona con otras proteinas como la subunidad mayor de RNA
pol II. Asimismo el dominio central de PQBP1 contiene repeticiones de aminoácidos que se
unen a extensiones de poli glutamina presentes en el factor de transcripción Brn2, la proteína
Hungtintina y la proteina ataxina-1. Estas repeticiones de poli-glutamina se encuentran
amplificadas en mutaciones ligadas a enfermedades neurodegenerativas y en particular se las
considera responsables de la acumulación de proteína mutada característica de la ataxia
espinocerebelar 1 (SCA-1) o de la enfermedad de Huntington. Se han descrito asimismo
mutaciones de PQBP-1 en casos de enfermedad mental ligado al cromosoma X (XLMR) 
Nuestro objetivo es estudiar el significado funcional de las interacciones de SIPP1 y su
posible papel en las enfermedades citadas 

FUENTE:
http://personales.unican.es/ortizjm/page4/page4.html