Ciencias de las plantas 287 (2019) 110184

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La β-amilasa PbrBAM3 de la peraPyrus betulaefolia) regula la acumulación de

azúcar soluble y la homeostasis de ROS en respuesta al estrés por frío
Liangyi Zhaoa,1, Tianyuan Yanga,B,1, Caihua Xinga,1, Huizheng Donga, Kaijie Qia, Junzhi Gaoa,
Shutian Taoa, Juyou Wua, Jun Wua, Shaoling Zhanga,⁎, Xiaosan Huanga,⁎
a Facultad de Horticultura, Laboratorio Estatal Clave de Genética de Cultivos y Mejora del Germoplasma, Universidad Agrícola de Nanjing, Nanjing 210095, China
B Laboratorio estatal clave de biología y utilización de plantas de té, Universidad Agrícola de Anhui, Hefei 230036, China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: β-La amilasa (BAM) participa en el metabolismo del azúcar, pero el papel de BAM Los genes de la tolerancia al frío siguen
Estrés por frío siendo poco conocidos. Aquí, informamos el identifiCaracterización catiónica y funcional del gen codificador BAM localizado
β-amilasa (BAM) en el cloroplasto PbrBAM3 aislado de Pyrus betulaefolia. Los niveles de transcripción de PbrBAM3 fueron regulados al alza
Osmolito
bajo frío, deshidratación y ABA, pero reprimidos por maltosa. Sobreexpresión dePbrBAM3 en el tabacoNicotiana tabacum) y
Degradación del almidón
peraP. ussuriensis) confirió una mayor actividad de BAM, promovió la degradación del almidón después de los tratamientos
Enzima antioxidante
de enfriamiento y mejoró la tolerancia al frío. Bajo el escalofriante estrés, el tabaco transgénico yP. ussuriensis
Especies reactivas de oxígeno (ROS)
exhibieron una menor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), niveles más altos de actividad de enzimas antioxidantes y una
mayor acumulación de azúcares solubles (especialmente maltosa) que las plantas de tipo silvestre correspondientes. En conjunto, estos
resultados demuestran quePbrBAM3 juega un papel importante en la tolerancia al frío, al menos en parte, al elevar los niveles de
azúcares solubles capaces de actuar como osmolitos o antioxidantes.

1. Introducción scientific interés.

Como organismos sésiles, las plantas están inevitablemente expuestas a tensiones
ambientales. De estos, el estrés por frío es uno de los estreses abióticos más
devastadores: perjudica el crecimiento y el desarrollo de las plantas, reduce la
productividad y limita la distribución geográfica. Durante un largo período evolutivo, las
plantas han desarrollado un conjunto de mecanismos sofisticados para hacer frente y
adaptarse al estrés por frío. Durante las últimas décadas, signifiSe han realizado avances
importantes en la revelación de los mecanismos subyacentes a las respuestas defensivas
de las plantas al estrés abiótico [1-6]. Estas respuestas defensivas de las plantas son
procesos considerablemente complejos regulados a través de múltiples vías de
señalización. Una vía de transducción de señales de estrés general comienza con una
percepción de señales, transducción a mensajeros secundarios y ampli de señalficatión
(Ca2+, especies reactivas de oxígeno (ROS)), que a su vez conduce a una serie de
modificaciones bioquímicas y fisiológicasficationes que permiten a la planta tolerar el
estrés [7-9]. En comparación con la cría tradicional, la ingeniería genética se ha
demostrado como un método más effenfoque eficaz y que ahorra tiempo para generar
nuevos germoplasmas con una mejor tolerancia al estrés [17]. Con este objetivo en
mente, la explotación de una gran reserva de genes con funciones deseables en la
tolerancia al frío es de suma importancia.
Las plantas se enfrentan al estrés por frío regulando una gran cantidad de genes a
nivel transcripcional [31]. Estos genes sensibles al frío pueden clasificarsefied de acuerdo
con su tiempo de respuesta en genes de respuesta temprana y genes de respuesta
retardada. El primer grupo codifica proteínas reguladoras, como los factores de
transcripción (TF) y las proteínas quinasas, que funcionan en la transducción de señales
de estrés y la regulación de la expresión génica. El último grupo está formado por genes
cuyos productos protegen a las células vegetales contra el daño derivado del estrés y
mantienen la viabilidad celular [10-12].
Bajo estrés por frío, las ROS se acumulan debido a un equilibrio interrumpido
entre la producción de ROS y la eliminación de ROS mediante enzimas
eliminadoras y antioxidantes no enzimáticos [13,14]. Oxidan lípidos, proteínas y
ácidos nucleicos, lo que a su vez activa un estrés adicional (posiblemente
conduciendo al daño de la membrana celular y al desequilibrio del potencial
osmótico [15-17], sino también vías de defensa que actúan contrariamente.
Contribuyendo a esto último, los genes relacionados con el metabolismo
modulado conducen a la producción y acumulación de"solutos compatibles", es
decir, osmolitos u osmoprotectores como prolina y azúcares solubles. Cada vez
está más claro que los azúcares solubles juegan un papel clave en la eliminación
de ROS y en la mediación de la tolerancia al frío [18-20].

⁎ Autores correspondientes.

Correos electrónicos: 2016104019@njau.edu.cn (L. Zhao), yangtianyuan2008@163.com (T. Yang), 2015104018@njau.edu.cn (C. Xing),
2017104017@njau.edu.cn (H. Dong), qikaijie@njau.edu.cn (K. Qi), 2017804152@njau.edu.cn (J. Gao), toast@njau.edu.cn (S. Tao), juyouwu@njau.edu.cn (J. Wu),
wujun@njau.edu.cn (J. Wu), slzhang@njau.edu.cn (S. Zhang), huangxs@njau.edu.cn (X. Huang).
1 Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2019.110184
Recibido el 29 de diciembre de 2018; Recibido en forma revisada el 3 de julio de 2019; Aceptado el 6 de julio de 2019
On-line el 09 de julio de 2019
0168-9452 / © 2019 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
L. Zhao y col.
Figura 1. Análisis filogenético de β-amilasas de five diffplantas diferentes. Se construyó un árbol filogenético basado en las secuencias de aminoácidos deducidas deβ-amilasas en
Arabidopsis thaliana, Malus x domestica, Populus trichocarpa, Poncirus trifoliata, Oryza sativa y Pyrus betulaefolia.
Un gran número de genes codifican enzimas implicadas en la síntesis o
degradación de azúcares solubles en plantas [21]. β-amilasa (BAM) es una
exohidrolasa que hidroliza α-Cadenas de glucanos con enlaces 1,4 y funciones
para convertir el almidón en maltosa [22]. La maltosa se puede exportar del
cloroplasto al citosol y luego se convierte en glucosa a través de
glucosiltransferasas desproporcionadas [23-26]. BAM es el mediador de la
degradación del almidón en los azúcares posteriores y su papel en el estrés por
frío se ha caracterizado en una variedad de especies de plantas. Por ejemplo, el
estrés por frío aumentó la actividad BAM de la papa más de 4 veces [27]. Nueve
homólogos de BAM han sido identified en el Arabidopsis genoma [25]. Derribar de
AtBAM3 por inferencia de ARN (ARNi) condujo a la disminución de los niveles de
azúcares solubles [28] y silenciar AtBAM3 resultó en la acumulación de almidón [
29]. Por el contrario, el silenciamiento deAtBAM1 no dio lugar a la acumulación de
almidón [30], y AtBAM4 no codificó una enzima BAM activa [26]. Otros dos genes
BAM,AtBAM7 y AtBAM8,
también se han asociado con el crecimiento y desarrollo de las plantas, a través de una
diafonía con la señalización de brasinoesteroides [22], un camino diffdiferente de la de
AtBAM3. Colectivamente, estos fihallazgos sugieren que AtBAM3 es la hidrolasa
dominante involucrada en la descomposición del almidón.
Habiéndose originado en el norte de China, Pyrus betulaefolia es extremadamente
resistente al frío [32], lo que la convierte en una fuente ideal de genes de importancia
agronómica con uso potencial para la ingeniería genética de tolerancia al frío. Aunque
las BAM deArabidopsis se han caracterizado, los roles de
BAM3 Los ortólogos en tolerancia al estrés siguen estando mal caracterizados en
plantas no modelo, especialmente en árboles frutales perennes. En este estudio,
reportamos el aislamiento y caracterización funcional dePbrBAM3 de Pyrus
betulaefolia. Sobreexpresión transgénica de PbrBAM3 en tabaco y pag.
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ussuriensis confiere tolerancia al frío, concurrente con una mayor actividad de
BAM y una mayor acumulación de maltosa y otros azúcares solubles. En general,
nuestros datos sugieren quePbrBAM3 mejora la tolerancia al frío, al menos en
parte, al mejorar el metabolismo del azúcar.
2. Materiales y métodos
2.1. Material vegetal, condiciones de crecimiento y tratamientos de estrés.
Pyrus betulaefolia las plántulas se cultivaron en la base experimental del
Centro Nacional de Investigación Tecnológica en Ingeniería de la Pera de la
Universidad Agrícola de Nanjing. ExaminarPbrBAM3 patrón de expresión, brotes
uniformes y sanos de Pyrus betulaefolia de plántulas de 45 días crecidas se
sometieron a diversos tratamientos de estrés. Para el tratamiento en frío, las
plántulas se mantuvieron en la cámara de crecimiento a 4 ° C durante 0, 6, 24, 72
y 144 h. Para el tratamiento de deshidratación, las plántulas se colocaron en secofi
ltrar papel encima de un banco de trabajo y secar a 25 ° C (en otoño, con una
humedad relativa de 60-70%) durante 0, 0,5, 1, 3 y 6 h. Para el tratamiento ABA se
realizó en base a un método previo [33,34]. Las plántulas se incubaron con sus
raíces sumergidas en una solución que contenía 100μM ABA durante 0, 1, 3, 6, 12,
24 y 72 h. Además, el tratamiento con maltosa se realizó incubando las plántulas
en una solución de maltosa 200 mM durante 0, 6, 12, 24, 48 y 72 h. Para cada
tratamiento, se recolectaron al menos 40 brotes de plántulas en los puntos de
tiempo indicados, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior.
L. Zhao y col.
2.2. Análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real de la expresión de PbrBAM3
Se extrajo el ARN total de las muestras de brotes utilizando reactivo TRIZOL
(Invitrogen, Estados Unidos). Aproximadamente 1μg de ARN total se transcribió
inversamente en ADNc utilizando PrimeScript™ Kit de reactivos RT (Takara, China)
según fabricante's instrucciones. La QRT-PCR se realizó en un sistema en tiempo
real BioRad CFX96 utilizando un SYBR® Kit Green Master Mix (Takara) según el
fabricante's instrucciones como se describe anteriormente [35]. Los cebadores
utilizados se enumeran en la Tabla complementaria S1. Cada muestra se analizó
en cuatro repeticiones, y las 2-ΔΔConnecticut método [36] se aplicó para calcular los
niveles de expresión relativa de cada gen. Expresión deUbiquitinaDQ830978) se
utilizó como referencia interna para el tabaco, mientras que Tubulina (AB239681)
se utilizó para
Pyrus betulaefolia. El análisis de expresión en cada punto de tiempo se repitió al
menos tres veces, y los datos se muestran como valores medios ± EE.
2.3. Aislamiento y análisis de secuencia de PbrBAM3
Basado en la secuencia, se diseñó un par de cebadores para RT-PCR para
amplificar el ORF del gen BAM3 en Pyrus betulaefolia. Los ensayos de RT-PCR se
realizaron como se describió anteriormente [37]. Los múltiples alineamientos de
la secuencia de aminoácidos deducida se realizaron utilizando el programa
ClustalW. Se construyó un árbol filogenético de PbrBAM3 y otras especies de
plantas mediante el método de máxima verosimilitud (ML) utilizando el software
MEGA (versión 6.0) [38]. El análisis del punto isoeléctrico teórico y del peso
molecular de PbrBAM3 se realizó utilizando el sitio web en línea ExPASy (http://
www.align.genome.jp/). Además, se identificaron múltiples alineaciones de las
secuencias BAM que contienen los dominios centrales de glucosil hidrolasa.fi
editado por el programa ClustalX con la configuración predeterminada y
presentado por Jalview (http://www.jalview.org/).
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Figura 2. Alineación de los dominios centrales de
glucosil hidrolasa de PbrBAM3 (línea 3) y sus nueve
ortólogos de Arabidopsis, AtBAM1-9. Los residuos
de aminoácidos idénticos y similares entre las
secuencias alineadas se indican mediante
sombreado negro y gris, respectivamente. Los sitios
de unión del sustrato y dos sitios catalíticos (Glu186
y Glu380) están marcados con grandes puntas de
flecha negras. Los residuos que se formanflEl bucle
flexible y el bucle interno se indican con líneas
continuas sobre las secuencias.
2.4. Localización sub-sótano de PbrBAM3
El ORF completo de PbrBAM3 fue amplified por RT-PCR usando cebadores
(GSP3; Tabla S1), luego clonado en el vector pCAMBIA1302 y fusionado en marco
al N-terminal de GFP (proteína fluorescente verde), bajo el control del promotor
CaMV 35S. Después de la validación por secuenciación, las construcciones de
fusión 35S pro: PbrBAM3 :: GFP o 35S pro: GFP (como control) se utilizaron para la
expresión transitoria enA. thaliana
células de protoplasto (alrededor de 1 μg de plásmidos de cada uno) según el
método del polietilenglicol [35,39]. Para la localización subcelular de la proteína
PbrBAM3 enA. thaliana células protoplásticas, utilizamos un microscopio de
barrido láser confocal (LSM410; Carl Zeiss) para observar el verde GFP y RFP fl
fluorescencia (a una longitud de onda de excitación (Ex) de 488 nm y una longitud
de onda de emisión (Em) de 525 nm) y el rojo automáticoflfluorescencia de
cloroplastos (en Ex = 488 y Em = 587-610 nm), como se describió anteriormente [
33].
2.5. Generación e identificatión de plantas transgénicas
Para generar plantas de tabaco transgénicas que sobreexpresen PbrBAM3,
todo el ORF de PbrBAM3 fue PCR-amplified con cebadores especiales GSP4 (Tabla
S1) e insertado en el vector binario pCMABIA1301 linealizado con BamH yo y Xba
Yo bajo el control del CaMV Promotor 35S. Los vectores de sobreexpresión se
movilizaron enAgrobacterium tumefaciens cepa EHA105 y luego se utiliza para
transformar tabaco o P. ussuriensis
según informes anteriores [40,41]. Los vectores de sobreexpresión se movilizaron
ena transformantes positivos e identified por PCR genómica utilizando cebadores
específicosfic para secuencias del gen de higromicina y
PbrBAM3 en tabaco o P. ussuriensis. La PbrBAM3 Los niveles de ARNm se
examinaron mediante RT-PCR, como se describe [33], utilizando Tubulina y
Ubiquitina como controles internos para P. ussuriensis y tabaco, respectivamente.
T2 Plantas homocigotas de tabaco y plantas propagadas deP. ussuriensis [40,41]
se utilizaron para los siguientes experimentos.
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Fig. 3. Expresión de PbrBAM3 en Pyrus betulaefolia en respuesta a diversos tratamientos. Los ciclos temporales de los niveles de expresión en el brote se analizaron mediante qPCR en respuesta a las
tensiones indicadas. Las barras de error son SE Note el diffdiferentes duraciones de los tratamientos de estrés (Materiales y Métodos).

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Figura 4. Localización subcelular de PbrBAM3-GFP. La construcción de fusión (35S: PbrBAM3-GFP, A-D) y un vector de control con 35S: GFP (E-F) se transformaron en protoplastos de
Arabidopsis mediante transformación con PEG. Imagenes deflfluorescencia (A, B; ver Materiales y métodos) y luz transmitida (C y F), e imágenes fusionadas (D y
GRAMO). La barra de escala horizontal = 20μmetro.

Figura 5. Análisis morfológicos, estructurales y bioquímicos de PbrBAM3 miffect sobre el metabolismo del almidón en las plantas de tabaco. (A, B) Tinción con yodo de almidón de hojas
de tabaco de una planta de tipo salvaje (WT) y tres líneas (indicadas por #s) dePbrBAM3-plantas que sobreexpresan, cultivadas en la oscuridad (A) y bajo la luz (B). Tenga en cuenta que
solo en la hoja WT la iluminación causó la acumulación de almidón. (C) Vista parcial ultraestructural de las células de la hoja de tabaco de plantas cultivadas con luz (WT y las tres líneas
transgénicas). CW, pared celular; SG, grano de almidón. Nótese la relativa escasez de granos de almidón en las hojas de los trangenes. (D)β-Actividad de amilasa, (E) contenido de
maltosa y (F) contenido de azúcar soluble total en el WT y las plantas de tabaco transgénicas. ** y *** indican signifino puedo diffdiferencias entre el WT y las tres líneas transgénicas (en
P <0,01 y P <0,001, respectivamente).

2.6. Análisis de acumulación de almidón y observación de ultraestructura
Para analizar la acumulación de almidón, el tabaco y P. ussuriensis
las plantas se mantuvieron a 25 ° C en oscuridad durante 12 h y luego bajo luz
constante durante 12 h (P. ussuriensis) o 48 h (tabaco). Se realizó tinción con yodo
para examinar elen el lugar acumulación de almidón en plantas WT y
transgénicas, recolectada de tratamientos oscuros y claros como se describe
previamente [26]. Además, observamos la ultraestructura de las hojas de WT y
plantas transgénicas mediante un método ya descrito [43] con un modi menorfi
catión. queso Briefly, las hojas se cortaron en secciones ultrafinas y se recogieron
en PELCO de malla 200® rejillas de cobre (TED PELLA, Inc., Redding, CA, EE. UU.).
Después de teñir con acetato de uranilo y citrato de plomo, las rejillas secadas al
aire se visualizaron bajo el microscopio electrónico de transmisión HT7700
(Hitachi, Tokio, Japón).

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Figura 6. Análisis morfológicos, estructurales y bioquímicos de PbrBAM3 miffect sobre el metabolismo del almidón en P. ussuriensis plantas. (A, B) Tinción con yodo de almidón deP.
ussuriensis hojas de una planta de tipo silvestre (WT) y tres líneas (numeradas) de PbrBAM3-plantas que sobreexpresan (OE), cultivadas en la oscuridad (A) y bajo luz (B). Tenga en
cuenta que solo en la hoja WT la iluminación causó la acumulación de almidón. (C) Vista parcial ultraestructural delP. ussuriensis células foliares en plantas cultivadas con luz (WT y las
tres líneas transgénicas). CW, pared celular; SG, grano de almidón. Nótese la relativa escasez de granos de almidón en las hojas de los trangenes. (D)β-Actividad de amilasa, (E)
contenido de maltosa y (F) contenido total de azúcar soluble en el WT y el transgénico P. ussuriensis plantas. *, ** y *** indican signifino puedo diffdiferencias entre el WT y el
tres líneas transgénicas (a P <0,05; P <0,01 y P <0,001, respectivamente).

2.7. Evaluación de frío effects y sellos de tolerancia al frío
Para el ensayo de tolerancia al enfriamiento, se enfriaron (a 0 ° C) plantas de
tabaco de 15 días de tipo salvaje (WT) y tres líneas transgénicas (Fig. S1F, en lo
sucesivo designadas como # 3, # 7 y # 11). sin aclimatación al frío, durante 24 h
seguido de recuperación a temperatura ambiente (25 ° C) para un mayor
crecimiento. La tasa de supervivencia se registró después de 10 días de
crecimiento de recuperación. Además, se fotografiaron las plantas WT y
transgénicas de 60 días (nº 3, nº 7 y nº 11) antes y después del tratamiento de
enfriamiento en cada punto de tiempo. En paralelo, se midieron la fuga de
electrolitos (EL) y el contenido de malondialdehído (MDA) y prolina en las hojas de
tabaco WT y plantas transgénicas (# 3, # 7 y # 11) como en informes anteriores [40
,42,44,45]. La muerte celular se evaluó con tinción con azul tripán de hojas en las
líneas WT y transgénicas como se describe [46]. En otro experimento,P.
ussuriensis Las plantas WT y tres líneas transgénicas (OE2, OE3 y OE19; Fig. S2F),
se enfriaron (a 0ºC) durante 8 h; al final del tratamiento, se recolectaron sus hojas
para medir los niveles de EL, MDA y prolina, así como para evaluar la muerte
celular mediante tinción con azul tripán. El ensayo de enfriamiento se repitió al
menos tres veces, con tres réplicas biológicas para cada muestra Enzimas
antioxidantes (SOD,
POD y CAT) actividad, H2O2 y la actividad del anión anti-superóxido en plantas WT
y transgénicas, se determinaron mediante los kits correspondientes.
(Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng) según el fabricante's
instrucciones. Tinción histoquímica con 3,3′ -Se realizó diaminobencidina (DAB) y
cloruro de tetrazolio azul nitro (NBT) para
detectar el en el lugar acumulación de H2O2 y O - 2 de
acuerdo a [44] y
[45], respectivamente. La determinación en las hojas deβ-La actividad amilasa, el
contenido de maltosa y otros azúcares solubles fue como se describió
anteriormente [46] y [47]. Las enzimas antioxidantes (SOD, POD y CAT) actúan
actividad, H2O2 y la actividad del anión anti-superóxido en plantas WT y
transgénicas, fueron determinadas por los kits correspondientes (Nanjing Jian-
Cheng Bioengineering Institute) según el fabricante.'s instrucciones. Tinción
histoquímica con 3,3′ -diaminobencidina (DAB)
y cloruro de tetrazolio azul nitro (NBT) para detectar la
en el lugar acumulación de H2O2 y O - de acuerdo
2 a [47] y [48], respectivamente.
La determinación en las hojas deβ-actividad amilasa, mal
tose contenido y otros azúcares solubles fue como se describe anteriormente [49]
y [50].
2.8. análisis estadístico
Cada tratamiento se repitió al menos tres veces con resultados consistentes.
Los datos se presentan como la media de tres réplicas biológicas ± SE de un
experimento representativo. Los datos fueron analizados por Duncan's pruebas
de rango múltiple en el programa ANOVA de SPSS (IBM SPSS 17), tomando P
<0.05, P <0.01, P <0.001 como signifiligeramente diferente.
3. Resultados
3.1. Clonación y análisis de secuencia de PbrBAM3
En un trabajo anterior, obtuvimos y analizamos un β-
gen de amilasa (Pbr014538.1) de un transcriptoma de Pyrus betulaefolia
[51]. Contenía un ORF completo de 1638 pb,flanked por un 80 bp 5'-
región no traducida (UTR) y 168 pb 3'-UTR. El cDNA, designado comoPbrBAM3,
contiene un ORF intacto y codifica un polipéptido de 541 aminoácidos con una
masa molecular calculada de 60,88 kDa y un punto isoeléctrico de 6,58. Se
construyó un árbol filogenético utilizando un total de 43 secuencias de proteínas
BAM, 8 deP. trifoliata, 9 de Arabidopsis, 12 de manzana, 6 de arroz y 9 de chopo.
LaBAM de diffLas diferentes especies de plantas se clasificanfidividido en cuatro
grupos principales, I a IV.
PbrBAM3 fue agrupado en el mismo grupo que BAM3 de Arabidopsis thaliana (
Figura 1). Múltiples alineaciones entre PbrBAM3 y otras nueve proteínas BAM
revelaron un dominio de glucosil hidrolasa altamente conservado (Figura 2). En el
dominio, hay 18 enlaces de sustrato (amilopectina)

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Figura 7. El effect de PbrBAM3 sobreexpresión sobre la tolerancia al frío de las plantas de tabaco. (A, B y C), fenotipos de plántulas transgénicas y WT de 15 días de edad (líneas # 3, # 7 y
# 11) antes (A) y después de un tratamiento de enfriamiento (12 ha 0 ° C) (B), seguido de recuperación a temperatura ambiente durante 10 d (C). (D), tinción con azul tripán de las plántulas de B.
(E) Tasas de supervivencia de las plantas transgénicas y de tipo salvaje evaluadas después de la recuperación del tratamiento de enfriamiento. (F), Fenotipos de plantas WT y transgénicas de 60 días
antes y después del tratamiento de enfriamiento. (G, H e I), características bioquímicas del estrés por frío effefectos medidos en WT y plantas transgénicas; fuga de electrolitos (G), malondialdehído
(MDA) (H) y contenido de prolina (I). ** y *** indican que los valores medidos en las tres líneas transgénicas fueron significamente diffdiferente de aquellos
en WT (a P <0,01 y P <0,001, respectivamente).

residuos (puntas de flecha pequeñas negras y azules) y 2 residuos catalíticos (puntas de que PbrBAM3 se localizó en el cloroplasto. Por el contrario, el verde GFPaloneflSe
flecha azules grandes). encontró fluorescencia en toda la región del citoplasma (Figura 4mi-GRAMO).

3.2. Expresión temporal de PbrBAM3 en hojas de Pyrus betulaefolia en

respuesta a tensiones abióticas
Tras la exposición al frío, el nivel de transcripción de PbrBAM3 se incrementó
gradualmente en 6 h, aumentó progresivamente hasta alcanzar el nivel más alto
a las 72 h (más de 25 veces el nivel inicial), y disminuyó a la mitad de este valor a
las 144 h (Fig. 3A). Tras la exposición a la deshidratación, el nivel de transcripción
dePbrBAM3 exhibió una regulación ascendente constante durante un período de
6 h, con un aumento> 12 veces mayor en relación con el inicio del tratamiento (
Fig. 3B). La aplicación ABA resultó en una lenta regulación de
PbrBAM3 nivel de expresión, a menos de 5 veces el valor inicial a las 6 h, alcanzando un
máximo de más de 25 veces el valor inicial a las 24 h, seguido de una disminución a 15
veces del nivel inicial a las 72 h (Fig. 3C). En contraste con estos,
PbrBAM3 La expresión fue reprimida por el tratamiento con maltosa por debajo del 20%
del valor inicial a las 6 h y luego fluctuado permaneciendo por debajo del 80% del valor
inicial hasta 72 h (Fig. 3D).
3.3. Localización subcelular de PbrBAM3
La microscopía confocal de las células del protoplasto de Arabidopsis mostró
una superposición perfecta entre el verde flfluorescencia de la GFP fusionada con
PbrBAM3 y el rojo auto-flfluorescencia de cloroplastosFigura 4A-D), indicando
3.4. Análisis de la actividad amilasa, almidón y contenido de azúcares solubles en las
plantas transgénicas.
La fuerte inducción por frío de PbrBAM3 expresión en Pyrus betulaefolia (Fig.
3) sugirió que un papel fundamental para PbrBAM3 en la regulación de la
respuesta fría. Para probar esta hipótesis, analizamos tres líneas independientes
de sobreexpresión de tabaco con los niveles de transcripción más altos de
PbrBAM3 (líneas # 3, # 7 y # 11; Fig. S1), junto con el tipo salvaje no transformado
correspondiente (WT).
Ni las líneas de tabaco WT ni las transgénicas (de 60 días) cultivadas en la oscuridad
durante 12 h acumularon almidón, como lo revela la ausencia de tinción con yodo (
Figura 5A), mientras que solo las hojas de plantas transgénicas mostraron ausencia de
almidón bajo luz constante durante 48 h en contraste con la hoja WT (Figura 5B). Para
seguir confirm este resultado, la acumulación de almidón de todas las plantas probadas
después de la exposición a la luz se examinó mediante un microscopio electrónico de
transmisión. Hojas de 60 días fueronfifijado en glutaraldehído al 2,5% (v / v) en
cacodilato de sodio 50 mM buffer ajustado a pH 7,3 durante 16 ha 25 ° C. Se cortaron
secciones transversales de oro ultrafinas de 90 nm y se recogieron en rejillas de cobre de
malla 200 que se prefilmed con 4% (v /
v) piroxilina en acetato de amilo y recubierto de carbono. Las secciones se tiñeron con
acetato de uranilo al 2% (p / v) durante 1 hora y citrato de plomo al 1% (p / v).

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Figura 8. Ensayo de tolerancia al frío de transgénicos P. ussuriensis plantas que sobreexpresan PbrBAM3. (A, B) Fenotipos vegetales de WT y líneas transgénicas (OE2, OE3 y OE19) antes
(A) y después (B) de un estrés por frío (Materiales y métodos). (CD-F) Muerte celular (C), contenido de prolina (D), fuga de electrolitos (E) y MDA (E) determinados en WT y líneas
transgénicas después del tratamiento de enfriamiento (Materiales y métodos). ** y *** indican valores que differ signifientre el WT y los tres transgénicos
líneas (en P <0.01 y P <0.001, respectivamente).
durante 1 min. Las rejillas lavadas con agua y secadas al aire se observaron en el
microscopio electrónico de transmisión HT7700 (Hitachi, Tokio, Japón).
De acuerdo con el resultado anterior, las líneas transgénicas exhibieron menos
granos de almidón en comparación con el WT (Figura 5C). Como se puede ver en
Figura 5D, la actividad de BAM en tres líneas transgénicas fue del 60%-160% más
alto que en el WT. De acuerdo con la mayor actividad de BAM, las hojas de
PbrBAM3-las plantas de tabaco que sobreexpresaban contenían más maltosa (
Figura 5E) y más azúcares solubles totales (Figura 5F) en comparación con WT.
PbrBAM3 también fue transferido a P. ussuriensis para caracterizar aún más
su función (Fig. S2). Tres transgénicosP. ussuriensis líneas (OE2, OE3 y OE19; 21
días de edad) que exhiben una mayor abundancia de PbrBAM3
El ARNm, junto con las plantas no transformadas (WT), se sometieron a tratamientos de
luz y oscuridad (Materiales y métodos). Los resultados se parecieron a los del tabaco: no
se observó acumulación de almidón en las hojas de todas las plantas probadas
cultivadas en la oscuridad (Figura 6A). Sin embargo, se visualizó una tinción mucho más
profunda en el WT después de la exposición a la luz en comparación con las plantas
transgénicas (Figura 6B) Los SG (gránulos de almidón) eran muy abundantes en los
cloroplastos WT, mientras que en los cloroplastos de las tres plantas transgénicas su
número se redujo drásticamente (Figura 6C), indicando nuevamente que PbrBAM3 la
sobreexpresión condujo a una reducción de la acumulación de almidón. La actividad de
BAM en las tres líneas transgénicas fue significativafiligeramente más alto que en el WT (
Figura 6D). Paralelamente, el
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Ciencias de las plantas 287 (2019) 110184
líneas transgénicas almacenaron niveles más bajos de maltosa (Figura 6E) y azúcares
solubles totales (Figura 6F) en comparación con WT.
3.5. La sobreexpresión de PbrBAM3 aumentó la tolerancia al frío de las plantas
transgénicas
En condiciones normales de crecimiento (materiales y métodos), no hubo diff
diferencia en la morfología de las plantas entre las plantas transgénicas y el tipo
salvaje (Figura 7A). Cuando las plántulas de 15 d de edad se sometieron a una
temperatura de congelación (0 ° C) durante 12 h, las plantas de WT suffsufrió
daños por frío más graves en comparación con las plantas transgénicas (Figura 7
B), y todas estaban muertas al final del período de recuperación, mientras que la
mayoría de las tres plantas transgénicas se recuperaron y crecieron bien (Figura 7
C). El mismo resultado contrastante en otro experimento fue confirmed por
tinción con azul tripán directamente después del tratamiento de enfriamiento
(sorprendentemente oscuro en los tejidos muertos y casi ausente en las plántulas
vivas; Figura 7D). Al final del período de recuperación, las plántulas transgénicas
exhibieron signifitasas de supervivencia significativamente más altas (3 # (50%), #
7 (41,6%) y # 11 (66,7%)) plantas que las de las plántulas WT (0%;
Figura 7MI). También se observó una mayor tolerancia al frío en relación con el WT en plantas de
tabaco transgénicas de 60 días de edad (Figura 7F).
Después del estrés por frío, los niveles de EL y MDA en las líneas transgénicas
fueron significativosfiligeramente más bajo en relación con el WT después del estrés por
frío (Figura 7G y H). Proline (Pro) se considera como"un soluto compatible" que ayuda
L. Zhao y col. Ciencias de las plantas 287 (2019) 110184

Figura 9. Estado de estrés oxidativo en plantas WT y transgénicas después de un tratamiento de enfriamiento. Imágenes representativas de hojas teñidasen el lugar por la H2O2 y O - 2 respectivo

sondas DAB y NBT en: (A), plántulas de tabaco WT y transgénicos de 15 días de edad (líneas # 3, # 7 y # 11), (B), tabaco de 60 días WT y transgénicos (líneas # 3 , # 7 y
-
# 11), (C), P. ussuriensis WT y transgénicos (líneas OE2, OE3 y OE19). (D, E), Niveles de H2O2 (D) y O2 (E) cuantified (Materiales y métodos) en tabaco refrigerado
plántulas; (F, G), Niveles de H2O2 (F) y O - 2 (G) cuantified en frío P. ussuriensis. **y *** indican que los valores medidos en las tres líneas transgénicas en
tabaco y P. ussuriensis fueron significamente diffdiferente de aquellos en su respectivo WT (en P <0.01 y P <0.001, respectivamente).

plantas para superar el estrés abiótico. Por lo tanto, se midieron los contenidos de Pro
en las plantas probadas. Después del escalofriante estrés, el contenido de Pro en tres
líneas transgénicas fue significativofiligeramente más alto que en el WT (Figura 7I).
El rendimiento de crecimiento de las plantas de pera y pera WT que sobreexpresan
PbrBAM3 no differ antes del tratamiento de enfriamientoFigura 8A). Sin embargo,
un tratamiento de enfriamiento (Materiales y métodos) provocó una caída de
hojas más pronunciada en el WT que en las líneas transgénicas (Figura 8B). La
tinción con azul tripán fue considerablemente más intensa en las hojas de WT en
relación con las líneas transgénicas, lo que atestigua un estrés por frío más
severo debido al daño celular en el WT (Figura 8C). Después del tratamiento de
enfriamiento, el contenido Pro de las líneas transgénicas fue signifiligeramente
más alto que el del WT (Figura 8D) y el EL de las plantas OE2 (36.5%), OE3 (31.4%)
y OE19 (43.5%) fue notablemente más bajo que el de WT (87.7%) (Figura 8MI).
Además, las líneas transgénicas mostraron significontenido de MDA
significativamente más bajo en comparación con el WT (Figura 8F).
3.6. Análisis de la acumulación de ROS mediante tinción histoquímica
Debajo tratamientos de enfriamiento, las hojas de las plantas WT acumuladas
H2O2 y O 2- en mayor medida que las hojas del transgénico
plantas, según lo revelado por en el lugar histoquímica utilizando las respectivas
sondas, DAB y NBT (Materiales y métodos) que muestran tinciones más intensas
en las hojas de las plantas WT (Figura 9A-C). Este resultado fue consistente en todos los
tipos de ensayos de enfriamiento: en las plántulas de 15 días enfriadas durante 12 h (
Figura 9A), en las plantas de tabaco de 60 días refrigeradas durante 24 h (Figura 9B), y en
las hojas de pera refrigeradas (Figura 9C). En estafafirmación de los ojos cerrados en el
lugar los resultados de la tinción histoquímica, la cuantificación de
H2O2 y O - (Materiales
2 y métodos), también mostró que después de un tratamiento
de enfriamiento, los niveles de estos ROS fueron signifiligeramente más bajo en
las plantas transgénicas, que en WT, tanto en las plántulas de tabaco (Figura 9D y
E) y en P. ussuriensis (Figura 9F y G).
3.7. La sobreexpresión de PbrBAM3 aumentó las actividades de las enzimas antioxidantes en
plantas transgénicas
Dado que, después del tratamiento de enfriamiento, las líneas transgénicas
contenían niveles de ROS más bajos en relación con el WT, esperábamos que hubiera
mayores actividades de los tres significados.fino contiene enzimas antioxidantes (SOD,
CAT y POD). De hecho, las actividades de las tres enzimas fueron significativasfi
significativamente mayor en las plantas transgénicas que en las WT, tanto en el tabaco (
Figura 10A-C) y en P. ussuriensis plantasFigura 10D y E).

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L. Zhao y col.
Figura 10. Análisis de las actividades enzimáticas en plántulas de tabaco refrigeradas y en P. ussuriensis (Materiales y métodos). (A, B y C), actividad de CAT (A), POD (B) y SOD
(C) en tabaco WT y líneas transgénicas (# 3, # 7 y # 11). (D, E y F), actividad de CAT (D), POD (E) y SOD (F) enP. ussuriensis Líneas WT y transgénicas (OE2, OE3 y OE19). ** y
*** indican que los valores medidos en las tres líneas transgénicas de tabaco yP. ussuriensis fueron significamente diffdiferente de los de su
respectivos WT (a P <0,01 y P <0,001, respectivamente).
3.8. La sobreexpresión de PbrBAM3 promovió la acumulación de azúcares solubles
Para obtener más información sobre el mecanismo fisiológico subyacente a la
mayor tolerancia al frío del PbrBAM3 sobreexpresores, el β-
La actividad amilasa y el contenido de azúcares solubles se determinaron en líneas
transgénicas y plantas WT. Como se muestra enFigura 11A, el β-Las actividades de la
amilasa en las tres líneas de tabaco transgénicas fueron mucho más altas que las de WT
después del tratamiento con frío. Los niveles de maltosa en las tres líneas de tabaco
transgénico fueron significativosfiligeramente más alto que el de WT (Figura 11B) que
van de 1,6 a 1,8 pliegues. Consistente con la acumulación de maltosa, sobreexigencia
PbrBAM3 acumulación inducida de niveles de azúcar soluble bajo tratamiento de
enfriamiento (Figura 11C). Del mismo modo, después de un estrés escalofriante,β-
actividad amilasa en los tres P. ussuriensis líneas transgénicas (OE2, OE3 y OE19)
fueron signifiligeramente más alto que el del WT (Figura 11D). Mientras tanto, los
niveles de maltosa y azúcar soluble fueron más altos en las líneas transgénicas
que en WT (Figura 11E y F). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión
PbrBAM3 podría potenciar la acumulación de solutos compatibles como maltosa y
azúcar soluble en plantas transgénicas.
4. Discusión
A lo largo de un largo período evolutivo, las plantas han desarrollado una serie de
mecanismos complejos para tolerar tensiones ambientales severas [52]. Por ejemplo, el
metabolismo del azúcar y la partición del carbono son dos effFormas efectivas de
mantener el equilibrio necesario para el crecimiento y el suministro de energía en la
aclimatación al frío [53]. Debido a los carbohidratos producidos principalmente por
10
Ciencias de las plantas 287 (2019) 110184
degradación del almidón, los genes que codifican las enzimas que conducen a la
degradación del almidón son cruciales para el metabolismo del azúcar [54].
Estudios anteriores sugirieron que al principio la SG está catalizada
principalmente por enzimas BAM [55], por lo tanto, BAM Los genes pueden tener
un gran potencial para modular la homeostasis del azúcar bajo estrés abiótico.
Según su relación y estructura genética, las PbrBAM pueden clasificarsefied en la
categoría del Grupo IIII, lo que sugiere que los BAM se conservan evolutivamente entre
diffEn las plantas actuales, es razonable el hecho de que las plantas comparten aspectos
comunes en el metabolismo del azúcar por proporcionar una variedad de azúcares
necesarios para el desarrollo del crecimiento y la respuesta al estrés. Cabe señalar que
no todas las BAM responden a la degradación del almidón. En
Arabidopsis, solo AtBAM3 la supresión causó signifidisminuyó significativamente la
degradación del almidón mientras que la regulación a la baja de la otra familia no lo hizo
[56,57]. Múltiples alineamientos revelaron que PbrBAM3 compartía el mismo conjunto
de aminoácidos relacionados con la unión de SG y la catálisis hidrolítica en el dominio
central de glucosil hidrolasa con AtBAM3, lo que indica que PbrBAM3 es un supuesto
homólogo de BAM3Pyrus betulaefolia. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que
PbrBAM3 funciones en Pyrus betulaefolia al igual que AtBAM3
en Arabidopsis, es decir, degrada el almidón en los SG. En efecto,PbrBAM3-
sobreexpresando líneas tabaco y P. ussuriensis las plantas exhibieron una actividad BAM
más alta, una acumulación reducida de almidón y un nivel elevado de maltosa. Estos
resultados confirmed el papel crucial de PbrBAM3 en la degradación del almidón, lo que
lo convierte en un objetivo de interés deseable para la modulación de los niveles de
azúcar.
Dado que la mayor inducción de PbrBAM3 nivel de transcripción por
tratamiento de frío, lo que indica que PbrBAM3 juega un papel importante en
L. Zhao y col.
Figura 11. Análisis de β-amilasa actividad y azúcares solubles en tabaco transgénico y P. ussuriensis después del tratamiento de enfriamiento. Actividad deβ-amilasa actividad (A),
contenido de maltosa (B) y contenido de azúcar soluble (C) en las líneas de tabaco WT y transgénicas (# 3, # 7 y # 11) después del tratamiento de enfriamiento. (D, E y F) Actividad deβ-
amilasaD), contenido de maltosa (E) y contenido de azúcar soluble (F) en P. ussuriensis WT y líneas transgénicas (OE2, OE3 y OE19) después de estrés por frío. ** y *** indican que los
valores medidos en las tres líneas transgénicas de tabaco y P. ussuriensis fueron significamente diffdiferente de los de sus respectivos WT (en P <0.01 y
P <0,001, respectivamente).
respuesta a la tolerancia al frío. Con este fin, se produjeron plantas transgénicas
de tabaco (pera) a través deAgrobacterium-transformación mediada de PbrBAM3
bajo el control del promotor CaMV 35S. Las tres líneas transgénicas seleccionadas
(líneas de pera OE2, OE3 y OE19, y líneas de tabaco # 3, # 7 y # 11) exhibieron una
mejor morfología fenotípica, concomitante con niveles más altos de azúcares
solubles que el tipo salvaje bajo estrés por frío, lo que sugiere que el significáncer
de azúcares derivados de PbrBAM3
- hidrólisis del almidón mediada en la tolerancia al estrés. Estrés por fríofldaño
helado - dependiendo de su severidad y duración - consiste en alteración de la
membrana, disfunción del metabolismo, pérdida de turgencia o incluso muerte
celular [57]. Dado que el estrés por frío está mediado con frecuencia por estrés
osmótico, su daño effLos efectos pueden ser contrarrestados por la acumulación
de osmolitos, como azúcares solubles, restaurando el equilibrio osmótico [28,58,
59,61-sesenta y cinco]. El metabolismo del azúcar es un proceso enzimático
complejo, en el que pueden estar implicados varios azúcares solubles, como
sacarosa, glucosa, fructosa, etc.60]. Los niveles más altos de azúcar soluble
(especialmente para maltosa) en las personas estresadas por fríoPbrBAM3-Los
sobreexpresores en nuestro estudio sugirieron que estas plantas transgénicas
son más capaces de ajuste osmótico que las plantas WT. Paralelamente, el
PbrBAM3 sobreexpresores (tanto tabaco como P. ussuriensis) tuvo un EL más
bajo y mostró un mejor recrecimiento durante el período de recuperación en
comparación con WT bajo estrés por frío (Higos. 7 y 8), que se correlacionó bien
con su mayor capacidad de ajustes osmóticos debido a los azúcares solubles
elevados. Por lo tanto, sobreexpresarPbrBAM3 las plantas producen azúcares
más solubles que funcionan como osmolitos o solutos compatibles, que es uno
de los mecanismos adaptados que contribuyen a una mayor tolerancia al frío en
las plantas transgénicas.
Se ha demostrado que los azúcares solubles actúan como antioxidantes que
mejoran el estrés oxidativo derivado de ROS [19,20,63]. Aquí, encontramos que la
acumulación de ROS se redujo obviamente enPbrBAM3 -líneas que sobreexpresan
en comparación con plantas de tipo salvaje bajo estrés por frío, consistente con
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Ciencias de las plantas 287 (2019) 110184
el nivel más alto de azúcares solubles, lo que implica que la producción de ROS en
estas líneas bajo estrés por frío puede eliminarse de una manera más poderosa.
Aunque ROS podría generarse en diffEn los diferentes compartimentos celulares,
el cloroplasto es el sitio principal de generación de ROS [66-68]. Curiosamente,
PbrBAM3 se localiza en el cloroplasto. Por lo tanto, especulamos que elPbrBAM3-
Los sobreexpresores de OE contenían más maltosa y sus metabolitos en el
cloroplasto, que actúan solos o en conjunto con otros antioxidantes que eliminan
las ROS producidas en este aparato. Además, los ROS producidos en el citosol
también pueden ser eliminados por los azúcares solubles [18]. Por lo tanto, la
propagación de ROS desde el sitio de producción a otros lugares de la celda
puede ser signifidisminuyó considerablemente, lo que resulta en una menor
acumulación de ROS, lo cual es consistente con la dramática reducción del nivel
de ROS en estas líneas. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que la
promoción de la eliminación de ROS debido a una mayor acumulación de
azúcares solubles es una estrategia factible para aumentar la tolerancia al frío de
las plantas transgénicas.
5. Resumen
En conclusión, nuestros datos demuestran que PbrBAM3 es una respuesta al
estrés β-amilasa y juega un papel positivo en la tolerancia al estrés oxidativo al
frío al participar en la degradación del almidón y la movilización de azúcar soluble
capaz de proteger la osmocelular y contrarrestar las ROS. Se necesita trabajo
adicional para descifrar los detalles de los vínculos entre los azúcares solubles y
las respuestas al frío, para permitir una comprensión más profunda de los
mecanismos moleculares subyacentes.PbrBAM3 Función en tolerancia al frío.
Contribuciones de autor
HX diseñó y concibió la investigación. ZL, XC, HS, DH, GJ realizaron los
experimentos y YT escribió y revisó el manuscrito con
L. Zhao y col.
ayuda de HX. HX, ZS, TS, WJ y QK contribuyeron a la corrección y revisión crítica de
este manuscrito. Todos los autores revisaron los resultados y aprobaron elfi
versión nal del manuscrito.
Expresiones de gratitud
Agradecemos sinceramente al profesor Nava Moran de la Universidad Hebrea
de Jerusalén por sus comentarios constructivos y la edición del lenguaje de este
trabajo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales para
Jóvenes Excelentes de la provincia de Jiangsu (Beca No. BK20170086 a HX),
parcialmente financiada por los fondos abiertos del Laboratorio Estatal Clave de
Genética de Cultivos y Mejora del Germoplasma (Beca No. ZW201908 a YT), el
Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (subvención No.
2018YFD1000300 a HX), la Fundación Nacional de Ciencias de China (subvención
No. 31872070 a HX), el Fondo de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de
Jiangsu (subvención No. CX (18) 3065 a HX), los Fondos de Investigación
Fundamental para las Universidades Centrales (Beca No. KYZ201607 a HX), y
también apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de
China (Beca No.
Apéndice A. Datos complementarios
Se puede encontrar material complementario relacionado con este artículo,
en la versión en línea, en doi:https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2019.110184.
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