Biología Celular

Practica 2
1

Ing. en Biotecnologia

Profesor: César Díaz Pérez

Equipo 1

• Josephine Itzel Laguna Sanchez

• Natali Joselyn Espinosa Delgado
• Jose Javier Garcia Olivares
• Juan Francisco Sandoval Ruiz

200A

13/12/2020

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO CAMPUS CELAYA-

SALVATIERRA
 INTRODUCCION
Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido
incrustado por parafina

La función de una proteína en una célula depende en

gran medida de su correcta localización dentro de la
célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un 2

método mediante el cual una proteína se puede

visualizar dentro de las células utilizando tintes
fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es
decir, una molécula que absorbe la energía de la luz a
una longitud de onda específica mediante un proceso
llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía en una longitud de onda diferente,
conocida como emisión.

Los colorantes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico del objetivo y se

introducen en las células o tejidos cultivados mediante inmunomanchas. Cuando este anticuerpo
primario se une a la proteína de interés, la proteína se etiqueta con el tinte fluorescente.
Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar
del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios
de proteína para etiquetar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de
montaje antidescolorpara para preservar el etiquetado de fluorescencia y luego está lista para la
toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa
primero a través de un filtro de excitación, que permite que sólo la luz en la longitud de onda de
excitación pase a través. La luz de excitación llega entonces a un espejo especializado, llamado
espejo dicroro o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de
onda de excitación hacia un lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña
región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita a los fluoróforos, que luego emiten la
energía de la luz a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la
lente objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la
longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite que la luz de emisión pase a través.
Luego, pasa a través de un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de
cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora
llegan al ocular o a la cámara, donde presentan una imagen magnificada creada a partir de la luz
emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de 3
interés dentro de la célula.

Los colorantes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunomancha
para etiquetar los núcleos como un punto de referencia dentro de las células. Múltiples
fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, se pueden
utilizar para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de
las proteínas.

Veremos el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una

muestra de tejido seguida de la toma de imágenes de la muestra en un microscopio de
fluorescencia.

Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de

Proteínas en Fibroblastos de Ratón

La microscopía de fluorescencia confocal es una

técnica de imagen especializada para la localización
de una proteína o antígeno de interés en una muestra
de células o tejidos etiquetando el antígeno con un
color fluorescente conjugado por anticuerpos y
detectando la señal fluorescente. Ofrece una mayor
resolución espacial que la microscopía de
fluorescencia de campo ancho, con la ayuda de dos agujeros colocados en los planos focales del
lente objetivo, dándole el nombre de confocal. Permite a los usuarios visualizar la tinción a un
nivel subcelular, como la diferenciación entre la tinción de membrana superficial de la tinción
intracelular.

Un microscopio confocal sigue un principio básico similar al de un microscopio de fluorescencia

clásico. El haz de una fuente de luz, generalmente un láser para confocal, se refleja en un espejo
dicroico y se centra en una lente objetiva en la muestra. Esta luz excita a los fluoróforos para
emitir una longitud de onda diferente, que viaja de vuelta a través del lente objetivo y el espejo
dicroico a una cámara u ocular. 4

La resolución mejorada de un microscopio confocal se debe principalmente a la presencia de dos

agujeros, que son agujeros muy pequeños para que la luz pase a través de las trayectorias de
excitación y emisión de luz. Los agujeros se colocan estratégicamente en el plano focal del lente
objetivo. Ahora, cambiemos a un esquema de vista lateral de la disposición del microscopio para
revisar la trayectoria de la luz. Después de pasar a través del agujero de excitación, el haz de luz
de excitación tiene el efecto de originarse desde un punto focal, lo que permite que el lente
objetivo para luego enfocar la luz a un punto en la muestra, así. El haz de emisión desde este
punto focal converge en el agujero de emisión, lo que le permite pasar. Ahora, durante la
excitación, los fluoróforos dentro del camino de luz, por encima y por debajo del punto focal,
también están ligeramente excitados. Mientras que la luz de emisión que se origina desde el
punto focal pasa a través del agujero, las emisiones de los puntos desenfocados convergen antes
o después del agujero de emisión, y por lo tanto se bloquean, lo que resulta en una fluorescencia
de fondo reducida.

En este protocolo se observará inmunomanchación de fibroblastos de ratón, seguido de

imágenes en un microscopio confocal para visualizar diferencialmente una proteína de superficie
celular y una proteína lisosomal.

Mitosis y citocinesis
 En las células eucariotas, el ciclo celular, el
ciclo de división, se divide en procesos
celulares coordinados distintos que incluyen
crecimiento celular, replicación de ADN /
duplicación de cromosomas, distribución de
cromosomas a las células hijas y, finalmente,
división celular. El ciclo celular está estrictamente regulado por sus sistemas reguladores, así 5
como por señales extracelulares que afectan la proliferación celular.

Los procesos del ciclo celular ocurren durante aproximadamente 24 horas (en células humanas
típicas) y en dos etapas principales distinguibles. La primera etapa es la replicación del ADN,
durante la fase S de la interfase. La segunda etapa es la fase mitótica (M), que implica la
separación de los cromosomas duplicados en dos nuevos núcleos (mitosis) y división citoplásmica
(citocinesis). Las dos fases están separadas por intervalos (espacios G 1 y G 2), durante los cuales
la célula se prepara para la replicación y división.

Citocinesis

Durante la citoquinesis en las células animales, los filamentos de actina forman un anillo
contráctil en la membrana plasmática para crear un surco de escote, que finalmente pellizca la
célula en dos. En las células vegetales, las vesículas del aparato Golgi que transportan glucosa,
enzimas y proteínas estructurales se unen para formar una nueva placa celular en la ubicación
de la antigua placa metafásica. La placa celular en crecimiento se fusiona con las membranas
plasmáticas de cada lado, formando finalmente una nueva pared celular que divide la célula en
dos.

La mitosis ahora está completa, generando dos células hijas que son idénticas a la célula madre.
En la mayoría de las células humanas, la mitosis representa aproximadamente una hora del ciclo
celular de aproximadamente 24 horas.

El proceso de la mitosis
La mitosis se puede dividir en cinco etapas distintas: profase, prometafase, metafase, anafase y
telofase. La citocinesis, que comienza durante la anafase o telofase (según la célula), es parte de
la fase M, pero no parte de la mitosis.

Imágenes de células vivas de Mitosis

Aquí presentaremos brevemente las fases de la mitosis, y luego discutiremos consideraciones

experimentales para la toma de imágenes de células vivas de este proceso celular. Se mostrará
6
un protocolo detallado de adquisición y análisis de datos, y terminaremos con algunas
aplicaciones de esta técnica.

Para entender mejor lo que los científicos están buscando en estos experimentos de imagen,
primero caminemos a través de las etapas de la mitosis.

El ciclo celular describe el proceso general de crecimiento y división celular. La fase mitótica
representa una parte corta de este ciclo, que se puede desglosar en seis fases: a saber, la profase,
la prometafase, la metafase, la anafase, la telofase y la citoquinesis.

Durante la profase, el ADN se condensa en cromátides hermanos unidos en el centrómero. En el

citoplasma, dos orgánulos clave conocidos como centroomantes comienzan a ensamblar
estructuras de microtúbulos, comúnmente conocidas como fibras de husillo, en un patrón similar
a una rueda.

La siguiente fase, la prometafase, ve la descomposición de la membrana nuclear, y el montaje de

un complejo de proteínas, conocido como el cinetocoro, en los centrómeros. Esta fase también
es testigo de la vinculación de las fibras del husillo con el cinetocoro.

En metafase, los cromosomas se alinean en la placa metafásica, un plano imaginario equidistante

de los dos centrómeros. Durante el anafase, los cromosomas se "rompen" en el centrómero, con
cromátides hermanos individuales migrando a los extremos opuestos de la célula. En la telofase,
el husillo mitótico se desmonta y la cromatina comienza a des condensarse. Finalmente, durante
la citoquinesis, a través de la contracción de un anillo de actina/miosina que forma el "surco de
escote", la célula madre se divide en dos células hijas.
Con esta comprensión de la progresión mitótica, echemos un vistazo a las consideraciones
prácticas para ver este proceso utilizando imágenes de células vivas.

La primera pregunta es: ¿cómo etiquetar las células para visualizar la mitosis? Las "etiquetas"
más comúnmente empleadas para este experimento son las moléculas fluorescentes, que
absorben la luz en una longitud de onda y emiten luz a otra longitud de onda.

Con el fin de etiquetar los ácidos nucleicos, se puede utilizar un tinte de unión de ADN permeable
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celular, como Hoechst. Para etiquetar proteínas como los microtúbulos, se pueden utilizar
anticuerpos con etiquetas fluorescentes. Estos son generalmente impermeables de membrana,
y por lo tanto se emplean técnicas de microinyección para insertarlas en muestras.

¿Qué es el ciclo celular?

El ciclo celular se refiere a la secuencia de eventos que ocurren a lo largo de la vida de una célula
típica. En las células eucariotas, el ciclo celular somático tiene dos etapas: interfase y la fase
mitótica.

Puntos de control del ciclo celular

Hay tres puntos de control principales en el ciclo celular eucariota. En cada punto de control, la
progresión a la siguiente etapa del ciclo celular se puede detener hasta que las condiciones sean
más favorables. La G1 punto de control es el primero de ellos, donde se evalúa el tamaño, la
energía, los nutrientes, la calidad del ADN y otros factores externos de una célula. Si la célula se
considera inadecuada, no continúa con la fase S de la interfase. La G2 punto de control es el
segundo punto de control. Aquí, la célula asegura que todo el ADN ha sido replicado y no está
dañado antes de entrar en la mitosis. Si se detecta algún daño en el ADN que no se puede reparar,
la célula puede sufrir apoptosis o muerte celular programada. El punto de control M, o husillo,
garantiza que todos los cromátides hermanos estén correctamente unidos a los microtúbulos del
husillo en la placa metafásica antes de que la célula entre en el anafase.
Resultados
1) Se usó DAPI y una línea celular que expresa la proteína de fusión GFP-Actina.

1. ¿Cuál es el fundamento de acción DAPI y a qué se une?

DAPI se une preferentemente a bases de adenina y timina en el surco menor del ADN. Cuando se
une, el complejo DAPI-DNA absorbe la luz ultravioleta y emite azul visible ligero.

2. ¿Qué organelo podemos detectar con DAPI?

DAPI no puede pasar a través de la membrana celular, debido a eso, se utiliza para teñir células
muertas. Otro uso para la microscopia de fluorescencia para DAPI es su popular uso el marcaje
de cultivos celulares con la finalidad de detectar el ADN contaminado con micoplasma o virus.
Las partículas de micoplasmas o virus marcados por DAPI en el medio de cultivo son más fáciles
de detectar. Cuerpos DAPI, que, dependiendo de la célula y su estado de ciclo, pueden
representar un solo cromosomas, pares de cromátidas hermanas o núcleos completos.
 3. ¿Qué organelo o estructura estamos viendo
en verde?

En azul podemos observar núcleos y en verde podemos

observar la proteína de fusión.

2) En este experimento se usó DAPI, un anticuerpo contra actina, y un anticuerpo contra una
proteína de mitocondrias.

1. Describe que organelos/estructuras puedes localizar.

Observamos el núcleo de la célula en azul, la red de proteínas del citoesqueleto en verde y en

rojo la proteína de mitocondrias.

2. ¿Las mitocondrias están aisladas o formando una red mitocondrial?

En este caso las mitocondrias están aisladas.

3) En este experimento se siguió el proceso de Mitosis en la amiba Naegleria pringsheimi. Se

detectan mediante inmunofluorencia a la proteína tubulina y a la proteína BN 46/51. Además, se
usó DAPI.
 1. El panel A representa células en interfase
¿En qué organelo crees que se localiza la

proteína BN 46/51 en esta fase celular?

Núcleo

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3. ¿Describe las fases de la mitosis que
se pudieron detectar en las imágenes?

Interfase, profase, metafase, anafase, telofase.

Discusión
La microscopia se ha empleado por muchos años en el estudio de la célula ya que se ha
comprendido un gran campo de enseñanza en esta materia.

La importancia de conocer los fundamentos básicos de esta técnica se basa en los conceptos
básicos de óptica y la descripción ordenada de los diferentes tipos de célula a observar
conjuntamente se llevan a cabo estas dos disciplinas que en conjunto llevan a la estudiante o al
profesionista a desarrollar la descripción del tejido o célula vista ante esta técnica de microscopia.

En la práctica realizada se pudo observar el manejo y el funcionamiento de la microscopia, así

como los fenómenos fisiológicos celulares que la célula lleva a cabo durante un periodo de
crecimiento, demostrando los diferentes mecanismos que esta lleva durante su desarrollo y el
funcionamiento que lleva acabo para cada tipo de órgano, tejido y función específica.

En las imágenes se pueden observar los diferente o algunos de los mecanismos fisiológicos que
la célula lleva a cabo durante su crecimiento celular, de aquí podemos inferir que la célula está
en constante cambio y que los diferentes tejidos, órganos y aparatos tiende a llevar a cabo un
proceso de reparación celular y esto lo podemos observar en las imágenes aquí mostradas.
Conclusión
Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido
incrustado por parafina

Este método diagnóstico poco conocido por los patólogos puede tener utilidades diagnósticas.
Es poco conocida la posibilidad que existe de realizar IF en tejido preservado en parafina, sin
embargo, hay que recordar que la hibridación fluorescente in situ (FISH) se realiza en tejido 11

preservado en parafina para la detección de alteraciones genéticas; de hecho, en la actualidad

se está combinando la FISH con otras técnicas citogenéticas. La IF-P tiene algunas ventajas y
desventajas, como lo mencionamos antes. Hay que considerar que la IF-P tiene las ventajas de
las dos técnicas (IF e IHQ), como lo son: mayor accesibilidad a la muestra, preservación de las
características estructurales, realizar una tinción multicolor con múltiples anticuerpos en un
mismo corte y en varios compartimentos de una misma célula de interés, asociados con una
mejor visualización ultraestructural. Sin embargo, es necesario estandarizar estas pruebas en
cada laboratorio de patología y realizar más estudios para conocer cuál es el contexto más
favorable para realizar la IF-P frente a la IHQ y la IF. Es conocido que la patología en los últimos
años ha cobrado ˜ una gran importancia en la patología personalizada, y por ende en la patología
molecular. Por lo tanto, el patólogo moderno debe tener la capacidad de realizar diagnósticos
con pruebas moleculares en el contexto de la morfología. Así, estas ayudas diagnósticas, como
las pruebas de inmunotinción (IHQ, IF, IF-P), tienen que ir en conjunto con las pruebas
moleculares para llegar a un diagnóstico adecuado con implicaciones pronósticas.

Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de

Proteínas en Fibroblastos de Ratón

Empleando esta técnica también se puede determinar si dos moléculas están interaccionando en
una localización subcelular concreta, mediante una técnica denominada FRET (Transferencia
resonante de energía entre moléculas fluorescentes), o si difunden de un compartimento
subcelular a otro (como en la técnica denominada FRAP (Recuperación de la fluorescencia
después de photobleaching).
Además, si el microscopio confocal está equipado con un sistema de detección espectral,
también se puede calcular en qué lugar del espectro de la luz emiten los fluorocromos, y
minimizar, o incluso eliminar, los problemas de cruce de señal entre distintos colorantes que
presenten una emisión muy cercana en el espectro.
Finalmente en algunos materiales opacos la microscopía confocal también permite la obtención
de imágenes de su superficie mediante reflexión del láser contra el material. En este caso, lo que
se detecta es la luz reflejada por la superficie, de idéntica longitud de onda a la de la radiación 12
incidente. Como los ángulos de incidencia y reflexión no coinciden, se puede hacer la medida sin
recurrir a la utilización de marcadores fluorescentes extrínsecos.

Bibliografía
Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de
tejido incrustado por parafina

https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/v/10500/immunofluorescence-
microscopy- immunofluorescence-staining-paraffin?language=Spanish

Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización

de Proteínas en Fibroblastos de Ratón
https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/v/10501/confocal-fluorescence-microscopy-
technique- to-determine-localization?language=Spanish

Mitosis and Cytokinesis

https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/science-education/10762/mitosis-and-cytokinesis

Imágenes de células vivas de la Mitosis

https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/v/5642/live-cell-imaging-of-mitosis

What is the Cell Cycle?

https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/science-education/10757/what-is-the-cell-cycle

Ethanol Fixation and DAPI Staining: A Method to Visualize DNA in C. elegans

https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/v/20136/ethanol-fixation-dapi-staining-
method-to- visualize-dna-c

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin
https://www-jove-com.e-revistas.ugto.mx/v/3187/study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-
cells- expressing-gfp