Claves en el Desarrollo de Métodos LC

Consejos prácticos

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Métodos problemáticos
 Consecuencias de un método mal desarrollado
– Calidad
Un buen método le
o Datos no fiables, necesidad de re-analizar muestras
proporciona un
o Resultados fuera de especificaciones, investigaciones

o Dificultad para transferir métodos

buen resultado,

– Coste ¡siempre!

o Solicitudes de registro rechazadas, auditorías

o Retrasos en obtención de resultados/liberación de lote y complejidad adicional en el

proceso regulatorio

o Tiempo necesario para volver a desarrollar el método, para revalidarlo y volver a

solicitar el registro

o Desperdicio de recursos

• tiempo del analista, consumibles y tiempo de funcionamiento del instrumento

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Aspectos a considerar

Separación Detección
Evaluación
Transferencia
Método
de datos robusto

¿Mi sistema ¿Estoy viendo ¿Los picos

funciona todos los picos? son puros? ¿Obtendré
¿Mi sistema es resultados
correctamente?
suficientemente exactos?
flexible?
¿Estoy identificando ¿El método
¿Utilizo la correctamente los cumplirá los
columna picos? criterios? ¿El método
adecuada? ¿Fallará es robusto?
en QC?
¿Hay alguna forma
mejor de hacer el ¿Dónde están
¿Estoy separando los datos? ¿Es
seguimiento de los
todos los analitos? ¿Se podrá reproducible?
picos?
transferir
fácilmente?
¡Los lotes son
¡Estoy cansado muy largos!
¿La columna está
de inyectar patrones!
en buen estado?

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Esquema

Métodos
robustos

Transferencia Separación

Evaluación
de datos Detección

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Separar todos los analitos…
lo más rápido posible
Fl
CSH C18 P: 1-pyrenesulfonic acid
pH 3, ACN I Fe: fenoprofen
D D: diclofenac
A O I: Imipramine
P A: Amitriptyline
Fl: Flavone
Fe O: Octanophenone

Fl I
CSH Phenyl-Hexyl A
O
pH 10, MeOH No sabía que podía
P D trabajar con pH altos…
¡Solo tiene que usar
una columna de
Fe partícula híbrida!

0.00 1.20 2.40 3.60 4.80

Minutes

Maximice la selectividad combinando distintas

columnas, modificadores orgánicos y pH

©2014 Waters Corporation 5

Una columna C18 genérica no
es suficiente

311.1

313.1
295.1

328.1

355.1
370.1
0.05
AU

CSH C18

348.9
0.00

295.1
311.0

313.1
Mayor número de

355.1
328.1
328.1

370.2
picos resueltos
0.05
CORTECS™ C18+
AU

349.1
328.0
349.2
0.00
311.0

313.1
295.1

328.1

355.1
370.2
0.05 CSH Phenyl Hexyl
AU

311.1

0.00
311.1

328.1

370.1
295.1

313.1

Pruebe distintas
HSS PFP
355.1
0.05 columnas, ligandos y
AU

349.0

tecnologías de
312.7

0.00 partícula para

1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60
Minutes
identificar la mejor
separación más rápido
* Masa principal del pico

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¿Qué pasa si hay co-eluciones?
0.06

0.04
Detección UV
Desarrollé un método...
AU

0.02
Paroxetine + related compounds Había una coelución y
¡tuve que empezar de
0.00
nuevo!

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50

Minutes

312.0
8
Intensity

5x10
m/z 312.0

0
330.1

8
m/z 330.1
Intensity

5x10

Utilice detectores
0 complementarios: la
detección de masas
344.1

8 m/z 344.1 combinada con la

Intensity

5x10

detección UV premite
0 identificar coeluciones
1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 rápidamente
4.50 5.00
Minutes
* Masa principal del pico

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 Comprobar si la columna funciona
correctamente...
 Registrar el historial de la columna  e-Cord
Usar un patrón certificado para evaluar el rendimiento de las columnas usadas
0.04

Acenaphthene
Naphthalene
Acetone

Failing Column
AU

0.02

Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)

0.00
0.06

Acenaphthene
Acenaphthene
Naphthalene
Naphthalene

0.04
Normal Operation
Acetone

0.04
Acetone

Failing Column
AU
AU

0.02
0.02

0.00
0.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
Acenaphthene 3.00 3.50 4.00
0.06
Naphthalene

0.04 Minutes Acenaphthene

Naphthalene

Normal Operation El mejor procedimiento

Acetone
Acetone

0.04
Failing Column
AU
AU

0.02 es usar una columna

0.02
nueva caracterizada
0.00
0.00 en su propio sistema
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
0.06
Acenaphthene

Minutes
Naphthalene

Normal Operation
Acetone

0.04
AU

0.02

0.00
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Verificar la retención de los compuestos
Suplemento vitamínico con Glucosamina y Vitamina D3

200000

180000.0
Glucosamina Faseelreversa
150000
Altamente polar
Utilice modo de
Glucosamina HPLC
135000.0
Altamente polar
Modoadecuado
separación HILIC –
Intensity
Intensity

100000 HILIC para compuestos

90000.0
altamente polares
50000
45000.0 (in void)

0.0
0

0.28

Vitamina D3 Fase Reversa

0.21 Altamente apolar HPLC

0.14
AU

0.07

0.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

Minutes

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Esquema

Métodos
robustos

Transferencia Separación

Evaluación
de datos Detección

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 Detectar todos los analitos
0.48
0.48

311.00
Sulfadimethoxine--311.00
0.36
0.36 Detección UV

472.31
Terfenadine--472.31
609.29
Reserpine--609.29
Sulfadimethoxine
AU

0.24
AU

0.24

Terfenadine
Reserpine
0.12
0.12

0.00
0.00
8x1077
No se pierda nada –
8x10
utilice técnicas de

311.04
Sufadimethoxine--311.04
6x1077
6x10 detección

472.35
180.11

Terfenadine--472.35
Memantine--180.11
Intensity

609.27
Intensity

Reserpine--609.27
Detección de masas complementarias

Sufadimethoxine
4x1077
4x10
(UV y MS)

Terfenadine
Memantine

Reserpine
2x1077
2x10

00
0.00
0.00 1.00
1.00 2.00
2.00 3.00
3.00 4.00
4.00 5.00
5.00
Minutes * Masa principal del pico
Minutes

La memantina no tiene cromóforos y requiere

técnicas de detección alternativas a la UV

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 Patrones individuales para identificar
cada pico  secuencias de análisis
largas
11 patrones en 11 inyecciones distintas solo con detección UV (1hr 39 min)
Ahorro del 91%
vs.
de tiempo
11 patrones en una sola inyección con detección UV y MS (9 min)

paperavine - 340.2
0.032

clomipramine - 315.2
medazepam - 271.2
doxepin - 280.3
0.024

amitriptyline - 278.3

temazepam - 301.0

diazepam - 285.2
bromazepam - 316.0

0.016 Ahorre tiempo

AU

oxazepam - 287.0
obteniendo más
metoprolol - 268.3

información en una
0.008 loazepam - 321.0 inyección

0.000

1.90 2.28 2.66 3.04 3.42 3.80 4.18 4.56 4.94 5.32
Minutes

* Masa principal del pico

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Seguir cada compuesto a lo largo del
proceso de desarrollo

0.15

340.3
Los picos se
mueven y no
0.10 puedo

278.2
pH 3 indentificarlos

280.2

301.1

285.1
AU

271.1

315.2
318.0
0.05

0.00 296.2

0.14
340.3

0.12

0.10

0.08 pH 9.5 Realice el

278.2
AU

seguimiento de sus
280.2
0.06
285.1
301.1
268.3

271.1
picos de manera

315.2
287.1

0.04
fácil y rápida con
319.0

0.02
información MS
0.00

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Minutes

* Masa principal del pico

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Identificar correctamente los picos

Confirme la
* Masa principal del pico identidad de los
picos con
Empower®
analizando datos
MS y UV
conjuntamente

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Esquema

Métodos
robustos

Transferencia Separación

Evaluación
de los datos Detección

©2014 Waters Corporation 15

Evaluación consistente de los datos

Integración tradicional

Integración ApexTrack

La integración Apex Track de Empower permite realizar una integración

fácil y reproducible de picos coeluidos de manera automática.

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Verificar los criterios de calidad de la
separación

Observando los
cromatogramas creía
haber elegido las
mejores condiciones,
pero no lo eran…

¡No haga
suposiciones!

Utilice los campos

personalizados de
Empower para
identificar las mejores
condiciones

©2014 Waters Corporation 17

Verificar que no hay coeluciones
Apex
Los picos parecían
homogéneos pero en
QC detectaron que no lo
eran.

Verifique la
homogeneidad de los
picos utilizando los
datos UV y MS en
Empower Leading Trailing

©2014 Waters Corporation 18

Recuperar los datos
 Organice los datos por proyectos
 Consultas basadas en cualquier combinación de metadatos
– Comodines
– Rangos de datos
 Base de datos relacional

Realicé mis
experimentos la
semana pasada…
¿cuáles eran las
mejores condiciones?

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Esquema

Métodos
robustos

Transferencia Separación

Evaluación
de datos Detección

©2014 Waters Corporation 20

Transferir métodos:
Entre equipos - Entre laboratorios

La clave para una buena transferencia de métodos

son un método robusto y una validación hecha en
distintos instrumentos

 Pequeñas diferencias en la configuración o el rendimiento

entre sistemas puede provocar variaciones en los resultados
– El desgaste del instrumento o la columna
– Cambios en el tamaño y la longitud de la tubería
– Contaminación

©2014 Waters Corporation 21

Verificar el funcionamiento del
sistema

Neutrals Quality Control Reference Material (QCRM)

Posibles problemas:

Acenaphthene
Naphthalene
Minor Leak • Fugas
• Conexiones gastadas
Acetone

0.05
System Pressure: ~6400 psi
• Columnas envejecidas
AU

• Contaminación cruzada
0.00
• Celda sucia
• Errores en la fase móvil

Acenaphthene
0.06
Normal Operation • Burbujas de aire
Naphthalene

System Pressure: ~ 6600 psi • Otros

Acetone

0.04
AU

0.02

0.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Minutes

Desarrolle los métodos y transfiéralos en sistemas

que estén funcionando correctamente

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 Equipos flexibles  Evitar cambios en la
configuración del sistema
0.60
Caffeine metabolites
ACQUITY® H-Class (como HPLC)
0.40
4.6 x 100mm 3.5µm Xterra® MS Phenyl
AU

Flow rate: 1mL/min

0.20 Water/Acetonitrile/100mM amm. bicarb. pH 10
UV detection at 280 nm

0.00

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
Minutes

Tioconazole and
Related Compounds
ACQUITY H-Class (como UPLC)
2.1 x 75mm 1.7 µm ACQUITY UPLC CSH C18
Flow rate: 0.6 mL/min
ACN: MeOH: Water (44:40:28)
UV detection at 254nm

Reduzca la variabilidad – utilice un solo sistema tanto para métodos

HPLC como para métodos UPLC

©2014 Waters Corporation 23

Optimizar la robustez para una mejor
transferencia de métodos

Desarrollé un método
5 µm – 150 mm en HPLC, y ahora no puedo
L/dp = 30,000 transferirlo porque no hay una
Flow rate = 0.2 mL/min
columna UPLC equivalente
Rs (2,3) = 2.28

3.5 µm – 100 mm
L/dp = 28,571
Flow rate = 0.3 mL/min
Rs (2,3) = 2.32

1.7 µm – 50 mm
L/dp = 29,412
Desarrolle métodos con
Flow rate = 0.6 mL/min
Rs (2,3) = 2.29 químicas escalables
para facilitar las
transferencias de
Las químicas de columna BEH/CSH/HSS son directamente escalables métodos

©2014 Waters Corporation 24

Esquema

Métodos
robustos

Transferencia Separación

Evaluación
de datos Detección

©2014 Waters Corporation 25

Finalmente… un método robusto

ACQUITY UPLC H-Class

ACQUITY CSH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm
Column at 30°C
0.1% Formic acid, pH 2.5
0 – 87.5% ACN in Water over 5 min

Ziprasidone peroxide degradation

Utilice Empower
Method Validation
Manager (MVM) para
automatizar los
ensayos de validación

©2014 Waters Corporation 26

Validación: un trabajo tedioso

Adquisición y procesamiento
Creación de la de datos Cálculo de resultados Compilación de
secuencia de estadísticos informes
muestras

PNT deValidation
Method validación
Preparación de
patrones y muestras de métodos
Manager
Gestión de los datos
corporativo

©2014 Waters Corporation 27

 ¿Crear un método robusto es solo cuestión
de aplicar estos trucos y consejos?

©2014 Waters Corporation 28

Métodos robustos - Equipo fiable
ACQUITY® UPLC H-Class para desarrollos de método rápidos y fiables
 Sistema fiable y de calidad
 Métodos HPLC o UPLC
 Bomba cuaternaria
— Composiciones de fase móvil
constantes con la tecnología
Auto•Blend™
— Válvula selectora de solvente
opcional (hasta 9 líneas)
©2014 Waters Corporation
 Detectores ACQUITY
— PDA, TUV, FLR, ELSD, RI,
QDa™
— Flexibilidad modular
— Facilidad de uso
 Gestor de columnas
— Hasta 6 columnas
— Evite tener que montar y
desmontar columnas
— Químicas de 5µm a sub-2µm
— Diferentes modos de
calentamiento para minimizar
problemas de transferencia
29
Fiabilidad en el control de las
condiciones cromatográficas

340.3
0.025

280.2
271.1
0.020
Inyección #1

315.2
0.015

301.1

285.1
318.0

278.2
AU

0.010

268.2
0.005 pH 3.0
0.000

-0.005
0.030
340.3
0.025

280.2

315.2
278.2
271.1
0.020
Injección #2 pH 3.2

285.1
0.015 316.0
AU

287.1
0.010
268.2

0.005

0.000

-0.005
1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40
Minutes
* Masa en la base del pico

Pequeños cambios en la preparación de la fase móvil

pueden afectar a la robustez del método

©2014 Waters Corporation 30

El sistema debe controlar la
composición de la fase móvil de
manera exacta
 La tecnología Auto•Blend está integrada en el sistema ACQUITY H-Class

95% 0% 45% 50%

Agua Acetonitrilo Agua Acetonitrilo

5% 0% 5% 0%
1% FA 1% NH4OH 1% FA 1% NH4OH

100% Agua 50% Agua

0% Acetonitrilo 50% Acetonitrilo
0.05% Ácido Fórmico 0.05% Ácido Fórmico

©2014 Waters Corporation 31

Incorporar un detector de masas

Detector ACQUITY QDa

QDa
 Detección de masas
̶ m/z 30 a 1250
PDA
 Mantenimiento mínimo
̶ ESI ± Pre-optimizado
 Mínima intervención del usuario
̶ Pulsar el botón de encendido
̶ Rápida puesta a punto
̶ ¡Listo!
 Si puede usar un PDA, ¡puede usar un QDa!
 Modular, ocupa poco espacio

©2014 Waters Corporation 32

Evaluar la columna a elegir

 Waters es fabricante ACQUITY UPLC BEH C18 Coverage

3.5

primario de partículas de 3.4

3.3
UCL

sílice e híbridas – desde la

Ligand Density [µmol/m2]

3.2
3.1

materia prima hasta el 3

2.9

producto acabado 2.8

2.7
LCL

 Se fabrican lotes pequeños

2.6
2.5
0 10 20 30 40 50 60 70 80

de 1 - 2 Kg para monitorizar Batch

cuidadosamente los Gráfico del proceso de control de 85 lotes de columnas ACQUITY

UPLC BEH C18 Base/Neutral Selectivity
parámetros que tienen un 0.140

impacto en la variabilidad 0.135

Propranolol/acenaphthene [Alpha]

UCL

del proceso
0.130

0.125

0.120

0.115
¡Minimice el0.110riesgo de variabilidad de un método LCL

desarrollando
0.105 columnas de calidad!
0.100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Batch

©2014 Waters Corporation 33

Métodos válidos a largo plazo
Pruebe tres columnas con el mismo relleno, de lotes distintos,
utilizando los kits de validación de métodos para validar a fiabilidad
del método a largo plazo

0.010

Lote 101
AU

0.000

-0.010
0.010

Lote 103
AU

0.000

-0.010

0.010

Lote 109
AU

0.000

-0.010
1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20
Minutes

©2014 Waters Corporation 34

 Proceso: Optimizar el desarrollo de
métodos robustos

Protocolo clásico: Protocolo Quality by Design

Un factor cada vez sistemático (QbD)

- Columna arbitraria
- Configuración predefinida - Enfoque estadístico
- Para una separación rápida - Explorar/probar/optimizar - Para métodos rutinarios
y poco desarrollada

- Exhaustivo
Pros - Rápido - Proceso controlado - Conocimiento de la
- Fácil de configurar - Equilibrio rapidez / robustez robustez
- Gestión del riesgo

- Pueden no probarse las - Necesidad de software QbD

- Puede no ser robusto
Contras mejores condiciones - Más procesamiento
- Poca trazabilidad del
proceso - Puede necesitar más - Los resultados se tienen
optimización que confirmar

Mayor garantía sobre la robustez del método

©2014 Waters Corporation 35
¿Qué es un protocolo sistemático?

Defina la muestra y los Preparación de

criterios de separación muestras

Exploración
rápida pH pH
¿No se retienen?
CSH C18 ácido básico Utilizar método HILIC
Gradiente estándar
pH ácido/básico Procesar de datos en Empower
Elija el mejor resultado basado en los criterios

CORTECS CORTECS
Screening
HSS T3 HSS T3 HSS C18
C18+ C18+

CSH CSH
4-6 Columnas Phenyl- BEH C18 Phenyl- BEH C18 HSS PFP
Hexyl Hexyl
ACN y MeOH
(ACN) (MeOH) opcional

Procesar de datos en Empower

Elija el mejor resultado basado en los criterios

Optimización Gradiente Temperatura

Otros
parámetros

©2014 Waters Corporation 36

¿Qué hace Quality by Design?
Software Fusion Method Development
[1] Defina el experimento
 Enfoque estadístico en el diseño de
Seleccione las Pre-defina los
experimentos para el desarrollo de variables objetivos de
métodos experimentales separación

 Plantillas sencillas
 Automatiza la creación de sample sets y
[2] Desarrolla el espacio de
method sets en Empower conocimiento
 Facilita el análisis de los datos Identifica el
Genera el diseño del
rendimiento medio del
experimento
método
Beneficios:
– Identifique las áreas de cumplimiento
del rendimiento del método y las
limitaciones (riesgo) [3] Establece el espacio de diseño
– Robustez del modelo
Define las condiciones Identifica un espacio
– Descubra los parámetros de óptimas de operación robusto
variabilidad y los límites de
cumplimiento
©2014 Waters Corporation 37
COndiciones de máximo rendimiento
del método

El gráfico muestra las

regiones donde se
cumplen los criterios
especificados de
rendimiento del
método

El método
funciona en estas
dos regiones

©2014 Waters Corporation 38

Rendimiento y robustez del método
óptimos

Espacio de diseño
de la robustez del
método

©2014 Waters Corporation 39

El proceso de desarrollo de métodos
es muy largo…
0.070
HPLC
-10 columnas
0.060

- Gradientes
0.050

- Composiciones
0.040
de la fase móvil

AU
0.030
HPLC:
0.020
45 días
0.010

0.000

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
Minutes

0.040

API 1 - 5.189

API 2 - 5.661
ACQUITY UPLC con software Fusion
0.035
- 3 columnas
- Gradientes
0.030

- Composiciones
0.025 de la fase móvil
- pH 0.020

- Flujo 0.015
AU

Imp A - 4.738
UPLC: 0.010

Lastpeak - 6.128
Imp B - 4.947
0.005
2 días

4.310
4.125
2.833

3.286

4.482
4.594
0.000

3.733
2.229
1.591

-0.005

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