TALLER 1 PCR

Reacción en cadena de la polimerasa.

Retrotranscripción. Se realiza con la retrotranscriptasa. Usa un molde de ARN para formar un

cADN.

Se usa cuando queremos amplificar un ADN viral, formado por un ARN.

ARN es más lábil que el ADN.

1er paso de la PCR:

desnaturalización= ruptura de los puentes de hidrógenos.

Hebras complementarias. 1= 5´-- 3´.2= 3´ a 5´.

Se eleva la temperatura (95°) para romper dichas uniones.

2do paso:

Annealing (hibridación de los primers)

Primers diseñados sintéticamente dependiendo de la sección de la muestra que se quiere

amplificar, lo que permite la polimerización.

La diferencia con los primers in vivo (ARN) es que los primers in vitro son de ADN.

Estos primers son ubicados por la primasa.

Especificidad de la técnica de PCR es dada por los primers. Así también la temperatura de
annealing da especificidad, ya que, si la temperatura es incorrecta, los primers se pegarán en la
zona que deseo y en otras.

3er paso: elongación

Se utiliza la taq polimerasa.

Polimerazas de 5´a 3´polimerizan.

Proofreading 3´a 5.

En el PCR se puede prescindir de las topoisomerasas.

Como se analizan los productos de la reacción.

Con una ADN polimerasa común puedo amplificar hasta 1000 pares de bases.

Para mas debo pedir una ADN polimerasa long distance.

ADN carga negativa. Corre en función del tamaño, mientras mas grande menos corre.

PCR de punto final, no puedo comparar pares iniciales con amplificación final.

Sondas Taqman (son 2 moleculas, reporter 5´ y quencher en 3´)(para detección del covid)

Fluorecencia. La ADN polimerasa hidroliza el par taqman y el reporter libera fluorecencia que
es lo que se detecta formando una curva.

RT-qPCR para el diagnóstico de Covid-19.

Covid-19 virus ARN

Intensidad de fluorescencia en función del número de ciclos.

Tenemos un numero basal de fluorecencia que pertenece a la mezcla de todos los

componentes.

Nos importa conocer el valor en el cual la fluorecencia aumenta por encima del valor basal.

Al principio empezamos a correr ciclos, al principio la amplificación es mínima. Poco a poco

empieza a aumentar exponencialmente hasta que se agotan los sustratos, dNTPs, primers, etc.

El ct nos da una idea de con que cantidad de muestra nosotros comenzamos a trabajar.

Hay que informar valor positivo o negativo, de ser positivo el informar el ct.

Falso negativo: negativo a persona infectada.

Puede ser por mala toma de muestra, algo en la pcr incorrecto, mal tratamiento.

Para que esto no pase se tiene un control positivo (si todo funciona bien), amplificación de gen
humano en rango de ciclos pequeño (<40 ciclos).

Además de el primer para la carga viral se usa otro par de primers para identificar gen
humano.