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Manual de biologia molecular: técnicas de laboratorio

Chapter · March 2011

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Tomas Koltai
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INTRODUCCION

A LAS

TECNICAS

EN BIOLOGIA

MOLECULAR

MEDICA
MAESTRIA EN BIOLOGIA MOLECULAR MEDICA 2011
INTRODUCCION

Consideraremos aquí las técnicas de Biología Molecular aplicables al

diagnóstico de patologías médicas. Excluimos, por ahora, aquellas de
uso forense que serán consideradas por separado.

El objetivo de estas técnicas apunta a realizar el diagnóstico de algún

cambio en la secuencia de bases del ADN de un genoma con relación
a una secuencia consenso esperada. O sea, son técnicas que nos
permiten determinar mutaciones o polimorfismos.

Definamos ambos términos.

POLIMORFISMOS: son cambios en la secuencia de bases del ADN en

relación a una secuencia consenso, que aparece en más del 1% de la
población y que no producen enfermedad.

MUTACION: son cambios en la secuencia de bases del ADN en

relación a una secuencia consenso, que se observan en menos del 1%
de la población y que pueden producir enfermedad (efecto negativo),
o ser silenciosas (efecto neutro) o tener carácter evolutivo (efecto
positivo).

Las técnicas utilizadas para la detección de polimorfismos y

mutaciones pueden tener un carácter identificatorio de la mutación, o
sea, que nos permiten conocer e identificar la base o bases mutadas,
o bien, nos permiten evidenciar que existe una mutación o un
polimorfismo, aunque no podamos identificar con exactitud la base o
bases modificadas.
Otras, que aquí denominaremos intermedias, nos permiten saber con
bastante certeza cual es la base mutada, aunque no podamos
identificar con exactitud cual es la base que reemplaza a la mutada.

2
TECNICAS
IDENTIFICATORIAS SECUENCIACIÓN DEL ADN

TECNICAS SCREENING: SSCP , HETERODUPLEX

QUE EVIDENCIAN PCR – ELECTROFORESIS
PCR EN TIEMPO REAL
HIGH RESOLUTION MELT (HRT)

TECNICAS QUE SOUTHERN BLOT

EVIDENCIAN Y PCR - ASO
CUASI IDENTIFICAN PCR – DOT BLOT ASO
PCR – RFLP
PCR – GAP
PCR MULTIPLEX

También pueden clasificarse los métodos mediante el tamaño de las

mutaciones buscadas.

DIAGNÓSTICO DIRECTO
MUTACIONES GRANDES: SOUTHERN BLOT

MUTACIONES PEQUEÑAS: PCR + TECNICAS COMPLEMENTARIAS

DIAGNOSTICO INDIRECTO
ANALISIS DE RFLP

IDENTIFICACION DE STR O VNTR

3
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus
siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de
biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de
ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una
única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es

que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una
muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre
el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han
hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Historia
En 1971, un artículo publicado por Kleppe et al. en Journal of
Molecular Biology describió por primera vez un método que usaba
enzimas para replicar una secuencia pequeña de ADN con cebadores
in vitro. Sin embargo, este temprano ejemplo del principio básico de
la PCR no recibió mucha atención, y la invención de la reacción en
cadena de la polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary
Mullis. Mullis ganó el Premio Nobel por su trabajo en PCR.

Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa que

se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90 °C
necesarias para la separación de las dos hebras de ADN de la doble
hélice tras cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas que se
utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a la
PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que
los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy
ineficientes, largos y requerían grandes cantidades de ADN
polimerasa.

4
El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, una polimerasa de
ADN extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita
medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los grandes
inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable
a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la
desnaturalización del ADN, eliminando la necesidad de añadir a la
reacción nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento
permitió automatizar el proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al
uso del termociclador.

Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba

en Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras empresas
biotecnológicas, Cetus Corporation, donde era responsable de
sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibió la idea
para la PCR una noche mientras cruzaba la Autopista de la Costa
Pacífica (EE UU) en su coche. Estaba imaginando una nueva forma de
analizar mutaciones en el ADN cuando se percató de que, en lugar de
eso, había inventado un método para amplificar regiones específicas
de ADN mediante ciclos de duplicación repetidos usando ADN
polimerasas.

En la revista Scientific American, Mullis resumió el procedimiento:

"Comenzando con una única molécula del material genético ADN, la
PCR puede generar 100 billones de moléculas iguales en una tarde. La
reacción es fácil de hacer, no requiere más que un tubo de pruebas,
unos pocos reactivos simples y una fuente de calor." Fue premiado
con el Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, y siete
años después, él y sus colegas del Cetus llevaron a la práctica su
propuesta. Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes
versiones sobre las contribuciones intelectuales y prácticas de otros
científicos al trabajo de Mullis, y sobre si él fue el inventor único del
principio de la PCR.

Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos
de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de

5
ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a
continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que
vuelvan a duplicarlas.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se

desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era
necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las
temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del
ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se
emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de
microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas
para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos,
generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq),
Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus
termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas
muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de
errores (Pfu, Vent).

Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un
aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los
tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada
etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso
del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para
PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena
conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el
equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema
que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación

6
sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que
carecían de este sistema, solucionaban el problema de la
condensación con una capa de aceite en la parte superior de la
mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente
indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica
para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la
clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN,
el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos
hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas
forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de
enfermedades infecciosas.

Para realizar la técnica se necesitan:

 Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para

polimerizar nuevo ADN.
 Dos cebadores o iniciadores (en primers),
inglés,
oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de
las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y
cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten
que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados
enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN
a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que
definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
 Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado
comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro
catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+),
para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas
concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante
la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
 Iones monovalentes, como el potasio.
 Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado
para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
 ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con
temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la
polimerasa Taq).

7
  ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a
amplificar.
 Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura
necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

REACTIVOS
1 Templado: ADNdc ng
2 Primers (sense-antisense)
3 Taq ADN polimerasa
4 Buffer
5 Cl2Mg
6 dNTPs (x4)
7 H2O csp

Ciclo de amplificación

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35

cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele
consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se
realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de
ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado
"hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final
del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje.
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen
de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para
la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP
en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como
la longitud del ADN que se desea amplificar. [2]

Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-

96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable
extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es
necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

8
Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras

de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la
forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C
que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros
métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la
adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.

Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el

cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40
segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los
puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-
ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar
a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la
cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a
ser amplificada.

Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la

cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial
necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una
nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los
dNTP complementarios en dirección 3'→ 5', uniendo el grupo 5'-
fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de
ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso
depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq,
la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente
72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa
usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a

9
amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura
óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C

durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura
que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente
ampliado.

100
Melting Melting
o
94 C Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC
TEM

0
Tiempo

Conservación

Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para

conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-

100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el
termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto,

se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor
medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño:
típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para
fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de
forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje

10
fluorescente, la electroforesis capilar.[3] El/los tamaño/s de los
productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño
conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

En el 2° ciclo se determina la longitud del producto. En el 3° ciclo se

completa la primera copia del producto

Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
 La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita
una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de
copias, así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a
cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan
a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a
analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación
con ADN extraños puede solucionarse con protocolos y
procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y
la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la
realización de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en
laboratorios de detección genética, se suele hacer una división
para la preparación de la muestra por un lado (donde se cierran
los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar
la PCR. Disponen también de cabinas de seguridad biológica
para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades,

11
 y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son también muy
recurridos para esta limpieza extensiva
 Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la
mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la
formación de productos falsos. Algunas consideraciones al
diseñar estos cebadores son:
o Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los
cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy
específica, y los que se excedan en longitud harán que
perdamos rendimiento en la reacción.
o La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1
(40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2
bases púricas.
o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones
que sean complementarias entre sí, o se formarán
dímeros entre ellos.
 Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo
elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo,
algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan
de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de
temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden
funcionalidad.
 Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a
las exigencias de nuestras enzimas.
 El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir
correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas
comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con
materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso
de las etapas, además de diversas facilidades de manejo.
Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación
será clave.

DNA polimerasas
Taq DNA polimerasa (Thermophilus aquaticus)
– Realiza 30-40 ciclos de PCR sin tener que abrir el tubo para agregar
más enzima
– Errores

12
- Adición de una A en el extremo del producto (“TA cloning”)
Pfu DNA polimerasa (Pyrococcus furiosus)
– Estabilidad y proofreading (corrección)
– Más lenta en polimerizar
– No adiciona A
Primer

Es el factor mas importante para la eficiencia y la

especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso
Requieren de un cuidadoso diseño

Reglas de diseño
a)Longitud: 18 a 25 pb
b) Contenido de G+C = entre 40-60%
c) Evitar las secuencias repetidas
d) Ancla G o C 3’

13
Tipos de PCR

PCR anidada (nested PCR)

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una

amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda
amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.

PCR in situ

La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones

histológicas o células, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se
realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección
mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN.
De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de
genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de
amplificar específicamente una población de secuencias de menor
representación.

PCR múltiplex

PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma

reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con
el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN.
Consiste en combinar en una única reacción todos pares de
cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente,
junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades
suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en
una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor
cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial

en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para

14
realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta
forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.

 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
 3er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite

cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra
original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras
de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también
denominado valor Tm, del inglés melting temperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no

específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada

su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR
Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador
apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia
por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para
su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas
específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a

dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador
directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta,
presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia
(FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los
dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3'
exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el
cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación
del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la

introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina

15
cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de
la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR
convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al
final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace
durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma
que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El
proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que
realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de
leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el
mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de
marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar
las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no
queda limitado a unos reactivos determinados.

La PCR en tiempo real puede generar amplicones muy pequeños

(desde 60 pb) lo que la hace ideal para la detección de cambios
cuantitativos en la expresión génica durante el curso de alteraciones
celulares patológicas o experimentales, así como para la
cuantificación de niveles de ARNm en muestras de tejidos con ARN
parcialmente degradado (Bustin, 2002).

Una característica importante de PCR en tiempo real es su amplio

rango dinámico. Esto implica que una amplia gama de ratios en los
genes a estudiarse y en los genes normalizadores puede analizarse
con similar sensibilidad y especificidad (Dorak, 2008).

En esta prueba el producto de la PCR se mide al final de cada ciclo.

Los datos pueden ser analizados mediante un software informático y
el número de copias de ARNm o la expresión génica relativa entre
varias muestras puede calcularse (Heid et al., 1996).

Transcripción reversa en la PCR en tiempo real

Una limitación de la PCR en tiempo real es que se debe utilizar ADN

como secuencia diana, ya que las ADN polimerasas no pueden
amplificar ARN de una manera similar. Este problema se puede
superar mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa para
generar ADNc a partir de una plantilla de ARN (Valasek & Repa, 2005).

16
Hay varias transcriptasas inversas utilizadas comúnmente, entre ellas
tenemos la transcriptasa inversa del virus aviar de mioblastosis la y la
transcriptasa inversa del virus de leucemia murina, siendo la primera
la más robusta de ellas. También es posible usar mezclas de
transcriptasas inversas, pudiendo estas dar lugar a una mejor
eficiencia de la transcripción inversa que las enzimas de componente
individual (Bustin, 2005b).

Por esta razón la PCR en tiempo real con transcriptasa inversa (RT-
PCR en tiempo real) se ha convertido en el método de elección para
realizar un examen rápido y cuantitativo de la expresión de genes
específicos, lo que no sería posible con anteriores metodologías
(Walker, 2002)

Por último, es importante mencionar que dado que la PCR en tiempo

real y la transcripción reversa se utilizan en combinación, la señal
final obtenida en RT-PCR en tiempo real dependerá de la eficiencia de
la reacción de la transcriptasa inversa (Bustin et al., 2005).

Marcadores Fluorescentes

Varios métodos se han desarrollado para cuantificar el producto de la

PCR. Sin embargo la PCR se ha aplicado principalmente como un
método cualitativo, ya que para llevar a cabo la cuantificación en los
productos de estas reacciones se necesita mucho tiempo y los
métodos para realizarla son relativamente difíciles de implementar.
Además debe tenerse en cuenta que en los últimos ciclos de la
reacción de la PCR, la cantidad de producto no guarda relación con la
cantidad inicial de ADN o ADNc en las muestras a analizarse (Lee et
al., 2004; Valasek & Repa, 2005).

Por el contrario y en contraste con los métodos anteriores en los que

se necesitan componentes adicionales, una de las más importantes
ventajas de la PCR en tiempo real es que el proceso completo se
realiza en el termociclador. Esta característica ayuda a disminuir el
riesgo de posterior contaminación en el laboratorio y permite
aumentar el rendimiento de la prueba en tiempo real (Valasek & Repa,
2005). Para obtener estos resultados, este sistema incluye dos

17
componentes: elementos ópticos integrados al termociclador (figura
1) y marcadores fluorescentes que proporcionan información acerca
de amplificación a lo largo de los ciclos de la PCR (Heid et al., 1996).

Figura 1

Componentes ópticos en el termociclador que permiten la identificación de

marcadores fluorescentes.

Hay dos clases principales de marcadores fluorescentes para la PCR

en tiempo real: genéricos y específicos. Las técnicas que usan
marcadores fluorescentes específicos emplean sondas de ácidos
nucleícos que se unen a amplicones específicos (producto de PCR).
Los métodos que utilizan sondas fluorescentes tienen la ventaja de
ser muy precisos y evitar posibles artefactos o secuencias
inespecíficas presentes en el producto de la PCR. Sin embargo, este
enfoque necesita de un diseño de secuencias específicas para su uso
como sondas y por consiguiente es más laborioso y costoso (Lee et
al., 2004).

La detección genérica se basa en la utilización de colorantes que se

unen a todas las secuencias de doble cadena de ADN en una reacción
de PCR (figura 2). Una vez que el colorante se une al ácido nucleído
formado en la reacción, este emite una señal fluorescente que se
procesa en tiempo real (Walker, 2002). Por lo tanto, un aumento del
producto de la PCR conduce a un aumento de la fluorescencia
detectada en cada ciclo de la PCR; esto permite que las
concentraciones de ADN o ADNc puedan ser cuantificadas (Ririe et al.,
1997).

18
Varios de estos marcadores se han descrito pero los más utilizados
son los colorantes SYBR ® Green y SYBR ® Gold (Lee et al., 2004).
Estos marcadores son populares para su uso en la PCR en tiempo real
porque no sólo son más baratos sino que también son distribuidos
por los proveedores de reactivos como cócteles listos para usar y no
requieren un diseño experimental adicional (Ririe et al., 1997; Giglio
et al., 2003).

La principal limitación de estos marcadores es que al unirse al total

de ácidos nucleídos en la reacción de la PCR, emiten una señal
luminosa tanto para productos específicos como para aquellos que no
lo son (primer-dimers). Para hacer frente a esta situación se debe
realizar un análisis de los resultados en la curva de fusión (Melt
Curve). Este análisis permite que los productos no específicos puedan
ser discriminados de los amplicones específicos (Ririe et al., 1997).

Los marcadores fluorescentes genéricos en la PCR en tiempo real

emiten una señal luminosa para todas las secuencias de doble
cadena. Esta señal luminosa puede ser medida posteriormente.

Análisis de la curva de fusión

Los datos que se obtienen con diferentes mezclas de SYBR ® Green

(cócteles comerciales o mezclas realizadas en laboratorio) pueden
variar. Sin embargo se observa constantemente que los amplicones
detectados con SYBR ® Green I son significativamente grandes y
tienen un alto contenido de GC (Giglio et al., 2003). En consecuencia
es posible identificar productos específicos de la PCR mediante el
análisis de la temperatura de fusión que se expresa en una curva cuya
forma se relaciona con el contenido de GC, tamaño de los amplicones
y la secuencia de los mismos (Ririe et al., 1997).

El análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo en la mayoría

de plataformas disponibles para la PCR en tiempo real, por lo general
al final de la reacción de amplificación. La medida de la fluorescencia
dependiente de la temperatura se realiza mientras la temperatura en
el termociclador aumenta de alrededor de 50°C a 95°C, siendo la

19
fluorescencia detectada dependiente de la presencia de secuencias de
doble cadena de ADN o ADNc (Giglio et al., 2003; Lee et al., 2004).

Cuando las dobles cadenas de ADN o ADNc se separan por efectos de

la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el colorante deja
de estar unido al producto de la PCR. La mayoría de los instrumentos
proporcionan un análisis de estos datos teniendo en cuenta el punto
en donde aparece el primer diferencial negativo de la señal de
fluorescencia con respecto a la temperatura y la temperatura de
fusión (figura 3). Este punto aparece como uno o más picos que
representan las temperaturas a las que los máximos niveles de
cambio de la fluorescencia se producen, correspondiendo estos a un
producto particular en la PCR (Lee et al., 2004).

Para discriminar los productos específicos de la PCR es necesario

saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los
artefactos como primers dimers (Ririe et al., 1997).

Análisis de la curva de fusión. Los picos de las curvas muestran que

los productos específicos de la PCR en tiempo real tienen una
temperatura de fusión mayor a la de productos inespecíficos.

Vale la pena tener en cuenta que el método de análisis de la curva de

fusión es análogo al de electroforesis en gel de agarosa (Giglio et al.,
2003). Con ambos métodos se puede evidenciar la presencia de
productos no específicos, sin embargo también están expuestos a
errores. Estos casos ocurren cuando las masas moleculares de los

20
productos de la PCR en cuestión son similares. Adicionalmente, la
exactitud de estos datos depende también de las plataformas de
hardware utilizadas (Lee et al., 2004).

Umbral y valores umbral del ciclo (threshold cycle values)

Como se ha descrito, los resultados de la PCR en tiempo real se basan

en la detección y cuantificación de los marcadores fluorescentes a lo
largo de la reacción de la PCR. Esto permite conocer la cantidad de
fluorescencia emitida durante la fase exponencial de la reacción,
donde un aumento significativo del producto de la PCR se
correlaciona con la cantidad inicial de ADN o ADNc en estudio
(Walker, 2002).

Para obtener estos resultados, los valores umbral de ciclo (Ct por sus
siglas en ingles) deben ser obtenidos. Anteriormente, un umbral
adecuado debe ser fijado por el operador en un punto
significativamente por encima de la línea base (Figura 4). Los valores
Ct son determinados por la identificación del ciclo en el cual la
emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por
encima del ruido de fondo en la fase exponencial de la reacción de la
PCR (Figura 5). En otras palabras, el valor Ct está representado por el
ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral
establecido (Bustin, 2005a).

Es importante considerar que un valor Ct superior a 40 ciclos indica

que no hay amplificación y por consiguiente no deben incluirse en los
cálculos. En la actualidad hay software que puede determinar valores
Ct mediante un análisis matemático de la curva de crecimiento
pudiendo tener así una mejor reproducibilidad en las pruebas de PCR
en tiempo real (Dorak, 2008)

21
Figura 4

Umbral (threshold) fijado con anterioridad para la determinación de

los valores Ct.

Gráfico 5

Los números de ciclo en los cuales la curva de fluorescencia atraviesa

el umbral establecido corresponden a los valores Ct que se utilizarán
en cálculos posteriores.

22
En el grafico A nos planteamos ahora saber cual de las dos muestras
(el de la derecha y el de la izquierda) esta en mayor cantidad. El
de la izquierda requiere de menos ciclos que el de la derecha
para alcanzar el umbral Ct, eso significa que se encuentra en
mayor cantidad. Cuantos mas ciclos se requieran para
transponer el umbral (Ct), menor es la cantidad de muestra.

En el caso de la figura A, el derecho representa el control y el

izquierdo la muestra a determinar. La muestra con mayor
contenido de ADN mostrara una fluorescencia precoz, o sea
necesita menor cantidad de ciclos para pasar el umbral.

Optimización de PCR en tiempo real

Para obtener resultados confiables en las pruebas realizadas con la

PCR en tiempo real es necesario optimizar la reacción en el
laboratorio. La optimización consiste en hacer que las variaciones
normales de la prueba no causen efectos importantes en los valores
Ct y que tengan un impacto mínimo en la cantidad de fluorescencia
observada. Los criterios más importantes para la optimización son
especificidad, sensibilidad, eficiencia y reproducibilidad de la PCR en
tiempo real (Edwards, 2004).

Los factores que deben ser optimizados son las mezclas maestras de
reactivos, la concentración de los primers, concentración de los

23
marcadores fluorescentes y la concentración de la muestra. Las
mejores concentraciones de reactivos y condiciones de la PCR son
aquellas en las que se observan resultados óptimos en términos de la
curva de fusión y de la eficiencia de la amplificación en reacciones
llevadas a cabo con controles positivos o calibradores (Edwards,
2004).

También es útil realizar electroforesis en gel de agarosa cuando se

optimiza una PCR en tiempo real. Los resultados de este análisis
proporcionan datos para relacionar la longitud del producto con los
picos del análisis de la curva de fusión y la posible presencia de
artefactos como primer dimmers (Dussault & Pouliot, 2006).

Teóricamente la cantidad de templado de ADN (T) aumenta al

doble con cada ciclo de amplificación. Luego de n ciclos, la
cantidad de producto (P) es:

P= 2n * T
Donde P es el producto final y T es la cantidad de templado
inicial.
Principios fundamentales del qPCR (PCR en tiempo
real)
Primer principio
 Medir la cantidad de producto a cada ciclo.
 Señal de fluorescencia proporcional a la cantidad
de producto fluorescente.
 Técnica basada en la detección y cuantificación
de un “reportero” fluorescente.

Métodos de detección

Agentes intercalantes SYBR Green

Sondas de hidrólisis Taíman
Molecular beacons
Scorpion primers
Fret Hybridization Probes

24
FASES DE LA AMPLIFICACION

Fase 1:exponencial inicial, oculta por el background de la reacción.

Fase 2: exponencial, donde se produce una exacta duplicación del
ADN que se acumula en cada ciclo.
Fase 3: lineal (altamente variable), se empiezan a consumir los
componentes.
Fase 4: Plateau o punto final, no se produce más producto

Principios fundamentales del qPCR (PCR en tiempo

real)
Segundo principio

El primer aumento significativo en la cantidad de producto de P se

correlaciona con la cantidad inicial de templado

Interpretación de la curva

Un Ct bajo indica mayor cantidad de producto inicial para alcanzar el

umbral con menor cantidad de ciclos. Un Ct elevado indica escasa
cantidad de producto inicial.

25
Ciclo umbral (threshold cycle o Ct): es el primer ciclo en el que se
detecta un nivel significativo de fluorescencia superior al “ruido de
fondo”.

Ct es inversamente proporcional al nivel de copias del templado

inicial

El plateau no depende de la cantidad de templado inicial, diferentes

cantidades de templado inicial pueden llegar al mismo plateau.
A igual cantidad de templado, distintas muestras pueden alcanzar
distintas concentraciones finales en el plateau.

La determinación de la cantidad de producto se debe realizar en la

fase exponencial cuando todavía el producto es proporcional al
templado.

El Ct de la muestra incógnita se interpola en la curva de calibración

para determinar su concentración

Ventajas de qPCR

La amplificación puede ser monitoreada en tiempo real

26
No se necesita procesamiento de los productos de PCR después de la
reacción.
Alto rendimiento
Menor riesgo de contaminación
Ciclado más rápido
Requiere menor cantidad de templado (ADN, ARN).
Confirmación de amplificación específica por análisis de curva de
meeting.
Más específica, sensible y reproducible
No mucho más cara (excepto por la inversión inicial del equipo).

Agentes intercalantes
Fluorescen solamente al intercalarse entre las bases del ADN doble
cadena
Permite el uso de cualquier par de primers.
Detecta todo el ADN doble cadena presente en la muestra, incluyendo
dímeros de primers.
No puede usarse para procesos multiplex
Permite realizar curvas de melting luego de la amplificación

Agentes intercalantes: Syber green

• es un fluorocromo que une preferencialmente ADN dc(>1000
veces).
• Genera mas señal ( al brillo) que el bromuro de etidio.
• Mejor especificidad para ADN dc que el bromuro de etidio.
• Económico

No requiere un kit especial, puede utilizarse con cualquier par de

primers.
No permite multiplex
No permite discriminación alélica (excepto HRM)
No permite detección de bajo número de copias (en presencia de
contaminantes).
En presencia de inhibidores, no hay amplificación o la eficiencia es
baja.

27
Detecta cualquier ADN doble cadena (dímeros de primers)

La detección de la señal se realiza al final de la extensión donde la

incorporación del colorante al ADN doble cadena es máximo.
En el gráfico inferior puede observarse que la fluorescencia disminuye
a medida que sube la temperatura y se separa la doble cadena
(meeting). A 78°C se ha producido la total desnaturalización y la
fluorescencia ha desaparecido. La fluorescencia será alta a bajas
temperaturas cuando el ADN es doble cadena y decrecerá
drásticamente a la Tm.

Sondas de hidrólisis Taqman

28
Oligosondas específicas marcadas con un fluoróforo en el extremo 5´
y un quencher en el extremo 5´.
Por su proximidad física el quencher no permite que el fluorocromo
“reportero” emita fluorescencia.

Annealing: la sonda hibridiza con el ADN

Extensión: la sonda es hidrolizada por la Taq polimerasa (exonucleasa

5´--3´.

29
La polimerasa libera la parte fluorescente al alejar el quencher.
El fluorocromo reportero es liberado por hidrólisis y aumenta la
fluorescencia por no tener el efecto inhibitorio del quencher.

Fluoróforo: molécula que absorbe energía y pasa a un estado

excitado; posteriormente, al volver al estado inicial emite el exceso de
energía en forma de fluorescencia.
Quencher: molécula que acepta la energía de un fluoróforo y la disipa
en forma de calor o fluorescencia .

30
La detección de la señal se realiza al final de la extensión donde se
detecta la fluorescencia emitida por el reportero (ya que la
fluorescencia emitida no es absorbida por el quencher).

Quenching FRET: se produce cuando el fluoróforo transfiere la energía

al quencher (que en este caso puede ser otro fluoróforo) y esta
energía es disipada en forma de fluorescencia a una mayor longitud
de onda.

Molecular beacons

Quenching colisional: se produce cuando el fluoróforo está en

contacto o muy próximo al quencher de tal forma que se produce la
transferencia de energía al quencher, el cual la disipa en forma de
calor.

Scorpios

Moléculas mixtas conteniendo:

31
Un primer complementario al templado, unido en foema covalente a
una horquilla similar a las sondas del tipo molecular beacon.
Loop sequence: secuencia complementaria al templado.
Fluoróforos reportero y quencher: cuando la horquilla se encuentra
cerrada no se produce la emisión de fluorescencia.
Bloqueante.

Estrategias para la cuantificación de ARNm en PCR en tiempo

real

Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a cabo la

cuantificación de la expresión genética con PCR en tiempo real. Estas
estrategias son: cuantificación absoluta y cuantificación relativa de la
PCR en tiempo real.

Cuantificación absoluta

El Ct de la muestra incógnita se interpola en la curva de calibración

para determinar su concentración.

Ct = f (logaritmo de la concentración de estándar)

32
Pendiente

La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con

la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia
estándar utilizando una curva de calibración. Las curvas de
calibración son altamente reproducibles y permiten la generación de
datos específicos y sensibles. Sin embargo el modelo de curvas de
calibración externas tiene que ser rigurosamente validado con
absoluta exactitud pues la cuantificación de la expresión genética en
la PCR en tiempo real depende exclusivamente de la precisión de los
estándares empleados (Pfaffl, 2008).

Además, el diseño de secuencias estándar, su producción y la

determinación exacta de sus concentraciones así como su estabilidad
a largo plazo y su almacenamiento son factores complejos y puede
presentar algunos problemas (Pfaffl, 2004). Estas consideraciones
hacen de la cuantificación absoluta un procedimiento laborioso,
costoso y que no siempre pueden llevarse a cabo en todos los
laboratorios.

Cuantificación relativa

33
La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones
determinadas. Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los
cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gene
en estudio en comparación con uno o más genes de referencia (Pfaffl,
2004). Hay que tomar en cuenta que la expresión de los genes de
referencia debe ser constante en las células estudiadas. Por esto, las
secuencias utilizadas para cuantificación relativa son generalmente
genes "housekeeping" (Ambion, 2008).

Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan

en la comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de la
reacción de la PCR como factor de corrección. Sin embargo, hay un
modelo que no requiere la eficiencia de la reacción para acceder a un
factor de corrección. Este modelo supone una eficiencia óptima e
idéntica (correspondiente al 100%) en la eficiencia de reacción en las
PCR en tiempo real tanto del gen en estudio como del gen de
referencia (Livak & Schmittgen, 2001). Este es el método 2 delta-delta
Ct que sólo es aplicable para una estimación rápida de la proporción
relativa de la expresión genética en estudio (Pfaffl, 2001). El método 2
delta-delta Ct expresa la proporción obtenida de la relación entre los
valores Ct de la muestra y los valores Ct del control tal y como se
muestra en la siguiente ecuación:

Es importante mencionar que la eficiencia de la PCR en tiempo real es

la capacidad de la reacción de duplicar el número de copias de las
cadenas de ADN o ADNc en cada ciclo (Bustin & Nolan, 2004a)

Genes de referencia

Algunos de los genes de referencia más utilizados incluyen: β-actina,

Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa, hipoxantina guanina

34
phosphoribosyl-transferasa y 18S del RNA ribosomal (Huggett et al.,
2005).

La elección correcta de los genes de referencia para la normalización

de PCR en tiempo real es esencial para reflejar datos fiables sobre los
procesos biológicos de las proteínas objeto de estudio (Robinson et
al., 2007). Además se ha demostrado que el uso de un solo gen
como gen de referencia es susceptible a tener errores en la
interpretación de los resultados de la PCR en tiempo real (Lee et al.,
2002). En consecuencia, para normalizar las expresiones de genes
cuando se trabaja con PCR en tiempo real, es necesario utilizar más
de un gen de referencia, sobre todo cuando no se puede encontrar un
único gen de referencia con características óptimas para realizar
cuantificación relativa (Huggett et al., 2005; Robinson et al., 2007)

Actualmente existe software adecuado para realizar el análisis de la

idoneidad de genes de referencia para cada experimento que se
realice y pueden ser encontrados de forma libre en internet. Un
ejemplo es BestKeeper con el cual se puede acceder a la calificación
de hasta 10 genes de referencia y puede ser descargado de
http://www.gene-quantification.info/

Aplicaciones de la PCR en tiempo real.

La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación

científica y como herramienta de diagnóstico. Vale la pena resaltar
que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al
hombre y a los animales (Bustin, 2005a) así como en la investigación
de bacterias y hongos patogénicos, pues esta prueba ofrece una gran
sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a un menor costo.
También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o
polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus
resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (Valasek
& Repa, 2005). Asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder
a datos relevantes a la biodinámica de los organismos que producen
enfermedades (Clementi et al., 1993).

35
Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica
es la investigación de cambios en la expresión genética de células a
través de la cuantificación de su ARNm, permitiendo asociar dichos
cambios a estados fisiológicos celulares, presencia de fármacos,
agentes infecciosos, etc (Bustin et al., 2005).

Una ventaja adicional de esta técnica es que para implementarla es

suficiente contar con una cantidad pequeña de muestra. Esto la hace
ideal cuando se usa conjuntamente con microcirugía laser para hacer
biopsias de tejidos o células específicas y estudiar, por ejemplo, el
comportamiento de células cancerosas (Edwards et al., 2004;
Johnson et al., 2005).

La PCR en tiempo real también se está usando en otros campos como

la investigación forense y la bioseguridad. En estos casos las
investigaciones se basan en la identificación con una alta sensibilidad
y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en
el medio ambiente. La caracterización de pequeñas cantidades de
material genético procedente de tales organismos hace posible
conocer su procedencia e identificar su dinámica (Johnson et al.,
2005).

Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la

seguridad alimentaria. Aquí, la identificación de organismos
genéticamente modificados (OGM) en alimentos o aditivos
alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta
tecnología. Bajo los principios revisados anteriormente también se
puede acceder a la cuantificación de OGM, recurriendo a genes de
referencia para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los
ensayos (Bustin, 2005a).

Conclusión

36
En la actualidad, la investigación basada en biología molecular
está abriendo un inmenso espectro de posibilidades para
un mejor entendimiento de los fenómenos biológicos que
nos rodean. Las implicaciones que tiene este nuevo
conocimiento abarcan campos tan diversos como la
medicina, la conservación medio ambiental y la industria.
En este contexto las pruebas como la PCR en tiempo real
son una prometedora ayuda para el desarrollo de
aplicaciones que permitan realizar investigación en
biología molecular obteniendo un gran flujo de datos
fiables y precisos sobre los organismos estudiados. Sin
embargo mayor investigación y desarrollo serán necesarios
para hacer de esta prueba accesible a un gran público y
sus resultados interpretados de manera directa y fiable.

Variaciones de la PCR básica

PCR ALELO ESPECIFICA (ASO: ALLELO SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE)
PCR ASO

PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es

usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base
(SNPs).

Un ASO u oligonucleótido alelo específico es una pequeña pieza de

ADN sintético complementario a la secuencia de una cadena de ADN
blanco que puede tener variaciones. Actúa como sonda en un ensayo
de tipo Southern blot o más comúnmente en el ensayo Dot blot.
Un ASO es típicamente un oligonucléotido de 15 a 21 bases de largo.
Se diseña de forma tal que resulte específico para uno solo de los
alelos del DNA testeado. De acuerdo a la astringencia con la que se
manejo el estudio, permitirá detectar la modificación de tan poco
como una base de la secuencia genética testeada. Por lo que resulta
de mucha utilidad en SNPs.

37
Para que sea detectado después de su unión al blanco, la sonda ASO
debe estar marcada con radioactividad o marcado enzimático o
fluorescente.

Ejemplo

La anemia falciforme (sickle cell anemia) es producida por una

mutación del codón del sexto aminoácido de la cadena beta de la
hemoglobina. La secuencia normal G A G que codifica el aminoácido
glutamina está mutada por G T G que codifica una valina (G U G en el
ARNm) . Para testear la presencia de la mutación en una muestra de
ADN, se sintetiza una sonda ASO que sea complementaria a la
secuencia alterada (que produce hemoglobina S en lugar de
hemoglobina A). Como control, también se sintetiza otro ASO
complementario de la secuencia sana. Cada ASO es totalmente
complementario a su blanco y se une con fuerza, pero tiene un
“mismatch” único con su alelo no blanco, lo que produce menor
unión. El diagrama muestra que la sonda S es totalmente
complementaria de su blanco S pero tiene un mismatch parcial contra
el blanco A.

Unión de sonda "S" ASO a ADN "S" (arriba) o unión a ADN "A" (abajo)

Técnica

Un segmento de los genes de la beta hemoglobina es amplificado

mediante PCR y transferido (blot). Luego las cadenas de la muestra se
escinden con álcali y cada sonda ASO es aplicada a un blot diferente.

38
Luego de la hibridización, se realiza el lavado que puede discriminar
entre los híbridos complementarios y los mismatched. Los híbridos
mismatched son lavados del blot, mientras que los complementarios
permanecen.

Esquema de dot-blots usando sondas "A" o "S" ASO

En el gráfico superior, se observan seis muestras de ADN amplificado

que se han aplicado a cada uno de los dos blots. La lectura del ASO
marcado que permanece después del lavado permite realizar la
lectura genotípica de la muestra. Los ejemplos 1 y 4 solo tienen la
variante normal A, los ejemplos 2 y 6 solo tienen la forma S, o sea son
homocigotos para la enfermedad y por ende la padecen, mientras que
3 y 5 son heterocigotos (portadores heterocigotos de esta mutación
recesiva). La pequeña cantidad de hibridización cruzada es típica y se
la considera en la interpretación final de los resultados.

PCR DOT ASO aplicado a la FIBROSIS QUISTICA

39
 PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas
secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de
oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.

 PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una

cadena del ADN original con respecto a la otra. Se coloca
mucho primer forward y pequeña cantidad de primer reverse o
a la inversa. Con esto se consigue la síntesis de una sola
cadena.

 PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias

Escherichia coli pueden ser rápidamente examinadas para
construcciones viables de vectores de ADN.

 Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy

parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la
enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la
polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalización-
extensión.

40
 PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica
durante las etapas iniciales de la PCR.

 PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método

de PCR para su uso en huella genética, que amplifica regiones
entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella
genética única de longitudes de fragmento amplificadas.

 PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR

cuando sólo es conocida una secuencia interna. Muy útil en la
identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.

 PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de

ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores
hibridando estos linkers.

 PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar

metilaciones en islas CpG de ADN genómico.

 Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex

Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite
amplificar varias secuencias objetivo con un único par de
cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR
multiplex.

 PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto

de PCR (preferentemente en tiempo real).

 PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada

para aislar una secuencia desconocida que flanquea una
secuencia conocida.

 PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se

emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los
extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume
que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento
cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no
específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación
a lo largo del progreso de la PCR.

41
  PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la
amplificación, y puede ser usado en células vivas.

Aplicaciones
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia
básica, como herramienta de detección y/o generación de acervos de
fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como elemento
resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.

Investigación

La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas

en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la
PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de
ADN de interés.

Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con

cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinación
dirigida con un plásmido.
Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de
secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para
ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta
secuencia que permite la interacción posterior con otra
complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por
ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos

42
cebadores, de modo que, y si ésta no existía previamente en el
fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una ligación
mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de restricción
apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es
el empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los
cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la
recombinación dirigida con un vector dado

PCR- RFLP

Definición: variaciones detectables en la longitud de los fragmentos

generados al cortar ADN con una enzima de restricción

43
Técnica que radica en el corte con endonucleasas de restricción de los
productos amplificados por PCR. Si dos amplicones presentan una

44
variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de
reconocimientos de las enzimas de restricción, generarán distintos
patrones de fragmentos. Se realiza la electroforesis en gel de agarosa.
Permite tipificar microorganismos tales como el virus del papiloma
humano y el de la hepatitis C.

Por el tipo de corte, se produce un fragmento más largo y otro más

corto. Es por eso que NN (normal-normal) tiene dos fragmentos a
pesar de ser Homocigoto. El fragmento más largo y el más corto, que
de todas maneras son más pequeños que el fragmento sin cortar, tal
como se ve en MM y en NM.
En MM no se corta ninguno de los alelos, ya que están ambos
mutados y existe una sola migración electroforética.
En NM un alelo, el mutado no se corta (arriba), y el otro alelo se corta
en dos fragmentos desiguales (los dos de abajo).

45
 CORTE
v
---------------------T.---------------------
---------------------C---------------------

_____ _____
_____ _____
TT CT CC

TT CT CT TT TT CC

Hay corte en el caso T, pero se cortan ambos alelos y tienen la misma

longitud. C no tiene corte. Si es homocigoto ninguno tiene corte y se
registra una sola señal. El heterocigoto tiene un alelo cortado con dos
fracciones del mismo tamaño y otro alelo sin cortar.

46
47
High Resolution Melt (HRM)
Es una técnica poderosa para detector mutaciones, polimorfismos y
diferencias epigéneticas en muestras de ADN de doble cadena.
Fue desarrollado por la Universidad de UTAH y por Idazo
Technology.

Tiene ventajas sobre otras formas de genotipado:

 Menor precio, lo que la hace ideal para el screening a gran

escala.
 Es rápido y poderoso porque es capaz de tipificar gran cantidad
de muestras con rapidez.
 Es simple. Con un ensayo de HRM de Buena calidad, se pueden
realizar genotipados por no genetistas y en cualquier

48
 laboratorio con acceso a un aparato de PCR en tiempo real
capaz de HRM.

METODO: se realiza sobre ADN de doble cadena. Se realiza

previamente una PCR para amplificar la porción de ADN que se
quiere estudiar. El proceso consiste en el calentamiento cuidadoso
del ADN amplificado de los 50° a cerca de 95°. En algún momento
de este calentamiento se alcanza el punto de melting y las dos
cadenas se separan.

El secreto del HRM consiste en el monitoreo de este proceso en

tiempo real. Esto se logra utilizando un colorante fluorescente. Son
llamados colorantes intercalantes o de interposición que tienen una
propiedad única: se incorporan únicamente a la doble cadena y
cuando están unidos, emiten fluorescencia. En ausencia de doble
cadena no tienen nada a lo que unirse y solo tienen un mínimo de
fluorescencia.

Al comienzo del procedimiento hay un alto nivel de fluorescencia por

la presencia de la doble cadena. Pero a medida que se realiza el
calentamiento, las dos cadenas se separan y la fluorescencia
disminuye. El dispositivo de HRM tiene una cámara que observa este
proceso midiendo la fluorescencia y lo traduce en un gráfico,
conocido como la curva de meeting, mostrando el nivel de
fluorescencia en virtud de la temperatura.

49
La temperatura de melting a la que se separan las dos cadenas es
absolutamente predecible y depende de la secuencia de bases del
ADN. Si se comparan dos muestras de dos personas diferentes,
debería generarse en ambos casos la misma curva de melting. Pero, si
una de las personas tiene una mutación en la región de ADN que se
ha amplificado, esto alterará la temperatura a la que las cadenas se
separen. Por lo tanto, ahora las dos curvas de melting serán
diferentes. La diferencia puede ser muy pequeña, una fracción de
grado, pero como el dispositivo de HRM tiene la habilidad de
monitorear este proceso con alta resolución, es posible documentar
con precisión estos cambios y por lo tanto identificar si existe una
mutación.

Las cosas son algo más complicadas ya que los especimenes en

estudio contienen más de una copia del gen en los alelos.

Las situaciones pueden ser

1. Ningún alelo tiene la mutación.

2. Uno u otro alelo tienen la mutación.

50
 3. Ambos alelos tienen la mutación.

Los 3 escenarios posibles el “Wild –type”, “Heterozigota” o

“Homozigota” respectivamente. Cada una genera una curva
ligeramente diferente.

Determinación de SNPs. Detección de mutación puntual.

Los métodos convencionales para detectar SNPs son costosos y

consumen mucho tiempo requiriendo varias sondas para el ensayo
multiplex o bien utilizar DNA arrays. HRM es costo efectiva y reduce la
necesidad de utilizar múltiples primers y la compra de varias sondas.

HRM ha demostrado utilidad en el diagnóstico de mutaciones de

BRCA1 y BRCA2 (genes de susceptibilidad al cáncer de mama), del gen
TP 53 que codifica la proteina P53, supresora de tumores.

HRM permite determinar si un gen es Homocigota o heterocigoto, y

los cambios Epigeneticos como la metilación de algunos
genes (los genes no metilados tienen una temperatura de
melting más baja que los genes metilados).

GAP – PCR

Gap-PCR es una técnica que permite identificar mutaciones genéticas

por deleción (o inclusión), siempre que se conozcan las secuencias
delecionadas.
Se utilizan dos primers complementarios para la cadena sentido y
antisentido en las regiones que flanquean la deleción.
En las deleciones pequeñas, menores a 1kb de tamaño, el par de
primers generará dos productos, siendo el menor el originado en el
alelo con la deleción.
Si las deleciones son de mayor tamaño, la distancia entre los dos
primers flanqueantes es demasiado grande para amplificar el alelo
normal y el único producto que se obtiene es el del alelo delecionado.
En estos casos, el alelo normal se detecta utilizando un tercer primer
complementario a la deleción, que se fija al alelo sano.
Esta técnica es el método Standard para el diagnóstico de la deleción
de genes de 3,7 kb y 4,2 kb que se observan en la talasemia.

51
Multiplex Gap PCR

Permite detector las principales deleciones vinculadas con la

talasemia y otras hemoglobinopatías, usando 7 primers

SCREENING: SSCP

SSCP (Single-strand conformation polymorphism)

Single-strand conformation polymorphism (SSCP), o polimorfismo de

cadena simple se define como una diferencia conformacional de
secuencias nucleotídicas de monocadenas de idéntica longitud y
debido a diferencias en la secuencia y bajo determinadas condiciones
experimentales. Esta propiedad permite distinguir las secuencias
mediante electroforesis en gel, que separa las diferentes
conformaciones.

Fundamentos físicos

El cambio de un solo nucleótido en una secuencia en particular, tal

como se encuentra en la doble cadena de ADN, no puede ser
distinguido por electroforesis, ya que las propiedades físicas de la
doble cadena son similares para ambos alelos. Luego de la
desnaturalización, el ADN monocadena realiza un doblamiento
tridimensional y adquiere un estado conformacional único basado en
su secuencia. La diferencia en el aspecto entre dos ADN monocadena
con secuencia diferente puede hacer que migren de forma diferente
en una electroforesis en gel, aunque el número de nucleótidos sea el
mismo. Este es el fundamento del SSCP.

PCR-SSCP (Siglas en Ingles de Polymerase chain reaction single-

strand conformation polymorphism). PCR-SSCP es un proceso donde
el ADN es amplificado mediante PCR y el producto final de este
proceso es desnaturalizado para separar las dos cadenas en cadenas
simples de ADN, y luego se favorecen los apareamientos
intracatenarios, lo que produce una alteración de la conformación de
cada una de las dos cadenas, si estas difieren en su secuencia y

52
finalmente analizados en un gel de Poliacrilamida. Con esto, la
estructura de cada hebra de ADN de un amplicón adoptará una
conformación dada, dependiente de la secuencia nucleotídica, que
afectará su migración en el gel. Así dos productos de PCR con
diferencias puntuales en su secuencias presentaran distintos patrones
electroforéticos de los fragmentos de ADN monocatenarios.

En la figura superior, puede observarse que una vez amplificada la

secuencia de interés para el estudio, mediante PCR con primers
marcados con fluorescencia, se produce su desnaturalización
mediante temperatura a 95°C durante 5 minutos, se produce luego su
enfriamiento rápido para evitar el annealing. Luego las simples
cadenas se someten a electroforesis en un polímero no
desnaturalizante que muestra la diferente movilidad de cada cadena
marcada.

Debemos señalar, que en el caso del ejemplo, las cadenas anteriores

son mezcladas con productos de PCR de tamaño standard para que
sirvan de control.

La solución conteniendo las simples cadenas en estudio y los

controles, se cargan en un tubo capilar que contiene un polímero y se
realiza electroforesis. De esta manera la diferente movilidad de cada
cadena (en caso que las dos cadenas sean distintas) puede ser

53
detectado mediante su diferente conformación que produce diferente
movilidad electroforética.

En la figura que sigue, puede observarse en la imagen superior, la

imagen que se obtiene en el wild type (normal) y en la variedad
mutante en el panel inferior.

Figure 2: CE-SSCP data for Exon 18 of the CLCN2 gene showing an

abnormality in the lower panel.

Si se detecta un cambio en la migración electroforética de las dos

cadenas, corresponde proceder a la secuenciación para identificar la
mutación.

¿Qué información nos da el PCR – SSCP?

Solamente nos dice si existe polimorfismo, o no, en el caso en

estudio. Si existe polimorfismo, la estructura del ADN de cadena
simple, adopta una estructura secundaria diferente, debida a uniones

54
intracatenarias, que producen loops y dobleces que cambian la
estructura tridimensional.

Es un método de bajo costo, ideal para screening de grupos

poblacionales.

LIMITACIONES DEL SSCP

La movilidad electroforética de las cadenas simples es dependiente de

la temperatura. La sensibilidad del SSCP se afecta por el pH y la
longitud de la cadena en estudio. Deberían usarse fragmentos entre
150 y 300 nucleótidos. Colocando glicerol en el gel, se pueden
utilizar fragmentos de mayor extensión.

55
56
 Estudio poblacional por SSCP del exón 10 del receptor beta de
hormonas tiroideas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4 Y 5 MUTADOS – RESTO NORMAL

M
M = MUTADO

En resumen

SCREENING DE MUTUACIONES PUNTUALES: SSCP Y HETERODUPLEX

ADN ---- PCR --- ELECTROFORESIS EN GEL-DETECCION DE

DE POLIACRILAMIDA BANDAS
ANOMALAS

La detección puede realizarse con tinción con plata

ANALISIS PCR – HETERODUPLEX

El ADN doble cadena no es una estructura totalmente rígida.

Variaciones en la secuencia pueden producir acodamientos y hasta

57
cambiar la estructura básica de la hélix. Un acodamiento restringe la
movilidad en un gel, ya que presenta una proyección hacia las poros
del gel. Un mismatch entre las dos cadenas del ADN puede producir
un acodamiento más radical en la estructura produciendo un
heteroduplex que es una especie de “burbuja” y que puede
distinguirse por electroforesis.
Se denomina heteroduplex a un fragmento de ADN en el cual una
base no encuentra su homólogo y produce una modificación
estructural (“una burbuja”). La migración electroforética detecta esta
modificación estructural.
Se utiliza para screening en fibrosis quística.

El estudio consiste en utilizar un ADN control y la muestra en un

mismo tubo. Son desnaturalizadas mediante calor y el producto
renaturalizado al descender la temperatura se somete a
electroforesis. Si la muestra no es igual al ADN control, se observarán
múltiples bandas, siendo la de más rápida migración la homoduplex,
mientras que el heteroduplex (que contiene los mismatch) lo hará de
manera más lenta. Pueden testearse muchas muestras al mismo
tiempo.

El annealing del ADN mutante al wild type control produce “burbujas” en los sitios
de mismatch. Esto produce una movilidad electroforética más lenta en el caso de
formarse heteroduplex.

58
SOUTHERN BLOT

Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern, es un

método de biología molecular que permite detectar la presencia de
una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido
nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de
agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos
de ADN y, después, una transferencia a una membrana en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de
su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno

heterocigoto. (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda específica (rosa) se
observa el resultado del Southern a la derecha

Pasos
1) Purificación del ADN
2) Tratar con enzima de restricción
3) Electroforesis en gel de agarosa
4) Desnaturalización con solución alcalina
5) Transferencia a membrana de nitrocelulosa
6) Incubación con sonda marcada
7) Lavado del exceso de sonda
8) Revelado con placa fotográfica

METODO

1. CORTE CON ENDONUCLEASA DE RESTRICCIÓN

Se usan endonucleasas de restricción para cortar la cadena de DNA

de alto peso molecular, en fragmentos más pequeños.

59
2.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Los fragmentos de DNA se someten a electroforesis en gel de

agarosa para separarlos por tamaño.

3.- SI FRAGMENTOS GRANDES, HIDRÓLISIS ACIDA DEBIL

Si alguno de los fragmentos es mayor a 15 kb, antes del blotting,

el DNA puede ser sometido a un ácido como el HCL diluido que
depurina los fragmentos de DNA rompiendo la cadena en
porciones más pequeñas, esto permite una mayor eficiencia para
la transferencia del gel a la membrana.

4.- DESNATURALIZACION DEL DNA

Si se utilizan métodos de transferencia alcalina, el DNA se coloca

en una solución alcalina (HONa) para desnaturalizar la doble
cadena de DNA. La desnaturalización en un medio alcalino puede
mejorar la union del DNA cargado negativamente a una membrane
cargada positivamente, separándola en cadenas simples de DNA
para la posterior hibridación con la sonda. La elección de
transferencia alcalina o neutra, es habitualmente conforme a la
experiencia del operador y puede producir resultados similares.

5.- TRANSFERENCIA A LA MEMBRANA

Se coloca una hoja o membrane de nitrocelulosa (o

alternativamente nylon) encima del gel. Se aplica presión sobre el
mismo para asegurar buen contacto parejo entre el gel y la
membrane. Las interacciones de intercambio iónico unen el DNA a
la membrana debido a la carga negativa del DNA y la carga positiva
de la membrana.

6.- CALENTAMIENTO DE LA MEMBRANA: AUMENTA ADHESIVIDAD

La membrana se coloca en un horno a 80°c por 2 horas (membrana

de nitrocelulosa o nylon) o se expone a radiación ultravioleta
(membrana de nylon) para adherir el DNA en forma permanente a
la membrana.

60
7.- HIBRIDACION

La membrana se expone a la sonda de hibridación—una única

secuencia de DNA con una secuencia específica, cuya presencia en
el DNA se busca demostrar. La sonda de DNA está marcada, de
manera que pueda ser detectada. Habitualmente se utiliza un
marcador radioactivo, fluorescente o colorante cromogénico. En
algunos casos la sonda puede realizarse con RNA. Para asegurarse
la especificidad de la unión entre el DNA y la sonda, los métodos
habituales de hibridación usan DNA de esperma de salmón o
arenque para bloquear la superficie de la membrana y apuntar al
blanco de DNA específico.

8.-VISUALIZACION

Luego de la hibridización, el exceso de sonda se lava de la

membrana y el patrón de hibridización se visualiza en un film de
Rx por autoradiografía o mediante el desarrollo de color en la
membrana si el método de detección es cromogénico.

RESULTADOS

La Hibridización de la sonda a un fragmento específico de DNA en

la membrana indica que ese fragmento contiene la secuencia de
DNA que es complementaria a la de la sonda.

El paso de transferencia de DNA del gel de electoforesis a la

membrane permite la fácil unión de la sonda de hibridización
marcada al DNA fraccionado. También permite la fijación del
híbrido-sonda, requerido para el análisis por autoradiografía u
otros métodos de detección.

Southern blot permite determinar la cantidad de secuencias

idénticas a la de la sonda, contenidas en un genoma (copias del
gen).

Una sonda que hibridiza con un único segmento de DNA que no ha

sido cortado por enzima de restricción, produce una única banda
en el Southern blot, mientras que múltiples bandas probablemente

61
se observen cuando la sonda hibridiza con varias secuencias
similares (ej. Aquellas que pueden resultar de duplicación de la
secuencia).

Las modificaciones de las condiciones de hibridización (ej.

Incremento de la temperatura de hibridización o disminución de la
concentración salina) pueden utilizarse para incrementar la
especificidad y disminuir la hibridización de secuencias que son
menos de 100% similares.

62
Permite determinar la cantidad de copias de un gen existentes en el
genoma.

Determinación del gen de la anemia falciforme mediante Southern

blot

63
La anemia falciforme se produce por una mutación de la beta globina
de la hemoglobina, donde un nucléotido de adenina se reemplaza por
uno de timina.
La endonucleasa de restricción Mst II reconoce precisamente el sitio
de la mutación y produce corte en normales, mientras que no lo
produce en los portadores del gen mutado.

Cadena Normal
1,2 kb 0,2kb
¡----------------------------CCTGAGGAG----------¡

El largo total es de 1,4 kb

Cadena con la mutación

¡----------------------------CCTGTGGAG----------¡

En el primer caso por efecto de Mst II se producen dos fragmentos,

uno de 1,2 kb y otro de 0,2 kb.
En la cadena mutada no hay corte y se produce un único fragmento
de 1,4 kb.
N=normal NN: sano MM: homocigota enfermo
M=mutado NM: heterocigota

NN NM MM kb

--- ---
1,4

--- ---
1,2

1,0

0,8

64
 0,6

0,4

--- ---
0,2

NICK TRANSLATION

Nick translation fue desarrollado en 1977 por Rigby y Paul Berg. Es

una técnica de biología molecular consistente en etiquetado en el
cual la DNA Polymerase I es usada para reemplazar algunos
nucleótidos de una secuencia de ADN con sus análogos etiquetados
(ya sea con radioactividad, fluorescencia u otro método de marcado)
creando de esta manera una secuencia de ADN etiquetada que puede
ser usada como sonda en técnicas de hibridización fluorescente in
situ o técnicas de blotting.

Este proceso se llama nick translation porque el ADN que se ha de

procesar es tratado con DNasa lo que produce nicks en una de las
cadenas. Luego la actividad exonucleasa 5'-3' de la DNA polimerasa I
remueve los nucleótidos y los reemplaza con dNTPs que pueden estar
marcados de diferentes maneras.

65
Para marcar radioactivamente un fragmento de ADN para su uso
como sonda en procedimientos de blotting, uno de los nucleótidos
que se incorporan en la reacción está marcado en la posición del
fósforo alfa. De manera similar, se puede unir un fluoróforo para
marcado fluorescente, o un antígeno para inmunodetección.
Existen en el mercado mezclas enzimáticas que realizan todos los
pasos del nick translation y marcado en una simple incubación.
El procedimiento puede causar rupturas de la doble cadena si la DNA
polimerasa I encuentra otro nick en la cadena opuesta, generándose
de esta manera cadenas más cortas. Esto no modifica la performance
de la sonda marcada para la hibridización in situ.

66
 NICK
TRANSLATION

RANDOM
PRIMERS

RANDOM PRIMERS
Consiste en un conjunto de nucleótidos chicos usados como primers.
Su diseño es al azar. Se agrega al ADN y luego se copia con
polimerasa.
La técnica de los random primers fue desarrollada por Feinberg y
Vogelstein en 1983 y su objetivo es producir una cadena de ADN
complementaria cuando se desconoce la secuencia de la misma. Los
random primers son segmentos cortos de ADN de cadena simple
consistentes en 6 a 8 nucleótidos que generan más de 65.000
combinaciones posibles. Dado que casi todas las secuencias están
presentes pueden adherirse a cualquier secuencia del ADN.

67
3 ejemplos de hexameros de una mezcla de todos los hexámeros al azar
posibles de los random primers. Estos tres primers en particular, pueden
unirse de manera sobrepuesta a porciones de mRNA para actuar como
primers en la producción de cDNA. El primer que llega primero se unirá y
el que llega luego deberá unirse a otro segmento.

Debe tenerse presente que el escaso largo de estos primers, significa

que no realizan una unión muy firme al ADN.

Western Blot

Sería más correcto llamarlo protein inmunoblot. Western blot permite

determinar el peso molecular de proteínas y determinar la
cantidad relativa presente en una muestra.

1) Las proteínas se separan mediante electroforesis en gel.

2) Las proteínas son transferidas a una hoja de papel especial de

nitrocelulosa (blotting). Las proteínas retienen el mismo patrón de
separación que tenían en el gel.

3) Se agrega un anticuerpo a la solución para que se una con su

proteína específica. El anticuerpo tiene unida una enzima (por
ejemplo fosfatasa alcalina) o un colorante.

4) La localización del anticuerpo se revela mediante la incubación con

un sustrato que modifica al colorante o que la enzima transforma
en un producto coloreado.

68
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)

EMSA es una técnica utilizada para estudiar la interacción entre ARN o

ADN con proteínas. Este procedimiento permite determinar si una o
más proteínas son capaces de unirse a una secuencia dada de ADN o
ARN.

El procedimiento consiste en la separación electroforética de una

proteína unida a ADN o de una proteína unida a ARN en gel de
agarosa o poliacrilamida. La velocidad de movimiento electroforético
está determinado por el tamaño de la molécula y su carga eléctrica y
en menor medida por su forma. Se utiliza como control una calle con

69
ADN o ARN sin la proteína. Esta calle mostrará un movimiento más
rápido por tener unida la proteína.

La calle 1 es el control, la calle 2 muestra ADN que no tiene unión a la

proteína, mientras que la calle 3 muestra el retardo de la banda por
contener unión entre proteína y ADN. El ácido nucleico se marca por
radioactividad, fluorescencia o biotina. La tinción con bromuro de
etidio es poco sensible.

Este tipo de estudios es muy útil para detectar factores de

transcripción.

TECNICA: En este estudio, se incuba un fragmento de ADN marcado

con P32 que contenga un sitio específico de unión a la proteína en
estudio. Los complejos ADN-proteína son separados del ADN libre
(no unido) mediante la electroforesis en poliacrilamida no
desnaturalizante. La proteína retarda el movimiento de las moléculas
de ADN a las que se une, por lo que el ADN libre “viaja” más rápido.
La diferencia es observable en la ubicación de las bandas de ADN libre
y ADN unido a proteína.

70
Figure 1 Procedures for determining the DNA-binding sites of transcription factors.
(A) Gel mobility shift assay. A DNA fragment containing the Pax6-binding site
changes its mobility in the gel when Pax6 protein binds to it. Lanes 1 and 3 show the
positions of a DNA fragment containing a Pax6-binding site. When Pax6 is added to
the fragment, it moves more slowly. Lanes 2 and 4 show the positions of a similar-
sized fragment that does not bind Pax6. (B) A DNase protection assay of the intron
between the third and fourth exons of the chick δ1 lens crystallin gene. DNA with
and without Pax6 is labeled at one end and is subjected to varying concentrations of
DNase I, which randomly cleaves the DNA. The resulting fragments are run on an
electrophoretic gel and autoradiographed. No cleavage is seen in the region where a
bound protein (Pax6) has prevented DNase from binding. There are two sites (purple
bars) where Pax6 binding is able to protect the DNA from digestion with DNase;
these sites are the enhancers. (A after Beimesche et al. 1999; B from Cvekl et al.
1995.)

71
EJERCICIOS

Se utiliza la siguiente enzima de restricción en el ADN de 3 personas: A, B, y C.

La secuencia de ADN de cada persona es

¡-------------3---------¡¡--------------------5--------------¡

¡------------------------8 kb--------------------------------¡
Persona A: Alelo 1 5´---ACCTTGGTGACCAAGGG----------------------3´
Persona A: Alelo 2 ACCTTGGTGACCAAGGG

Persona B: Alelo 1 ACCTTGGAATTCAAGGG

Persona B: Alelo 2 ACCTTGGTGACCAAGGG

Persona C: Alelo 1 ACCTTGGAATTCAAGGG

Persona C: Alelo 2 ACCTTGGAATTCAAGGG

Determine a quien corresponde cada una de las calles de la corrida electroforética

Calle 1 2 3
10
9

8 ------ ------
7
6

5 ----- ------
4

3 ----- ------
2
1

72
ELABORACION/SELECCIÓN DE PRIMERS PARA PCR

El forward primer se elabora sobre la cadena 3´---5´

Y este primer será 5´----3´

El reverse primer se elabora sobre la cadena 5´---3´

Y este primer será 3´<----5´

Ejemplo
3´< ---- 5´
5´------------------------------------------------- 3´

3´--------------------------------------------------5´
5´----3´

Ejercicio 3. Se quiere amplificar el siguiente fragmento de ADN

5´GACCTGTGGAAGC-----------------CATACGGGATTG 3´
3´CTGGACACCTTCG-----------------GTATGCCCTAAC 5´

Decida de la siguiente lista de primers ¿Cuál es el par apropiado?

1) 5´GACCTGTGGAAGC
2) 5´CAATCCCGTATG
3) 5´GTTAGGGCATAC
4) 5´GTATGCCCTAAC
5) 5´CTGGACACCTTCG
6) 5´CGAAGGTGTCCAG
7) 5´CATACGGGATTG

Debería ser

Forward 5´GACCTGTGGAAGC 3´sobre la cadena 3´--5´ Coincide

con opción 1
Reverse 5´CAATCCCGTATG 3´sobre la cadena 5´-3´ Coincide con
opción 2

73
Ejercicio 4 Dada la siguiente secuencia de bases:
5´ACTTGACGGACTCGATT3´
Identifique el primer forward y el reverse
5´ACTTG3´ ó 5´AATCG3´

Solución
3´GCTAA5´ REVERSE
5´ACTTGACGGACTCGATT3´

3´TGAACTGCCTGAGCTAA5´
5´ACTTG3´ FORWARD

Ejercicio 5 ¿Cuál de los siguientes primers permitiría obtener la

cadena complementaria del ADN monocatenario de secuencia 5
´ATGCCTAGGTC3´

A) 5´ATGCC3´
B) 5´TACGG3´
C) 5´CTGGA3´
D) 5´GACTT3´
E) 5´GGCAT3´

5´ATGCCTAGGTC3´
Primer para obtener cadena 3´TACGG 5´

dada vuelta 5´GGCAT3´ o sea la opción D

Ejercicio 6.- Diseñe un juego de primers (10 pb c/u) para amplificar el

gen que determina el tamaño de la oreja y proponga un programa de
ciclado

5´GTCCTGATTTAAAGGC-gen - GGGTCTAATGCCTAGTAGGTCCAAT3´
de la
3´CAGGACTAAATTTCCG oreja CCCAGATTACGGATCATCCAGGTTA5´

Respuesta

74
 CCCAGATTAC 5´
5´GTCCTGATTTAAAGGC-gen - GGGTCTAATGCCTAGTAGGTCCAAT3´
de la
3´CAGGACTAAATTTCCG oreja CCCAGATTACGGATCATCCAGGTTA5´
5´ ATTTAAAGGC

Forward: 5´ ATTTAAAGGC
Reverse: 5´CATTAGACCC

Dibuje los productos de ADN que estarían presentes después de 2

series de reacción. Incluya los primers en cada cadena donde sea
necesario.
Solución
Primer ciclo:
1.1 Calentamiento, separación de las cadenas
5´GTCCTGATTTAAAGGC-gen - GGGTCTAATGCCTAGTAGGTCCAAT3
´

3´CAGGACTAAATTTCCG oreja
CCCAGATTACGGATCATCCAGGTTA5´

1.2 Agregado de los primers

CCCAGATTAC 5´
5´GTCCTGATTTAAAGGC-gen - GGGTCTAATGCCTAGTAGGTCCAAT3
´

3´CAGGACTAAATTTCCG oreja
CCCAGATTACGGATCATCCAGGTTA5´
5´ ATTTAAAGGC

1.3 Acción de la Taq polimerasa

75
 ……………….. CCG - gen - CCCAGATTAC 5´
5´GTCCTGATTTAAAGGC-gen - GGGTCTAATGCCTAGTAGGTCCAAT3
´

3´CAGGACTAAATTTCCG oreja
CCCAGATTACGGATCATCCAGGTTA5´
5´ ATTTAAAGGC oreja GGG …………
RESULTADO AL FINAL DEL PRIMER CICLO

Final del segundo ciclo

TAAATTTCCG - gen - CCCAGATTAC 5´

5´ ATTTAAAGGC oreja GGGTCTAATG

Tercer ciclo

Se inicia por primera vez con el producto acotado.

76
Detección mediante PCR de distintos alelos de un polimorfismo microsatélite. En el ejemplo
se presentan dos individuos heterozigotos para los alelos de 6 y 7 repeticiones y de 4 y 8
repeticiones del dinucleótido (CA)n. La detección se realiza mediante PCR utilizando como
cebadores oligonucleótidos que flanquean a la región que contiene la repetición (flechas). De
cada individuo se amplifican fragmentos de ADN que difieren entre si por el número de
repeticiones. El resultado de la amplificación se fracciona en un gel de acrilamida-urea para
determinar el genotipo de cada individuo.

Enfermedad de Huntington

Repetición del trinucleótido CAG en el gen IT15

Método de Warner: PCR con primers HD1 y HD3

77
Para determinar el número de las repeticiones CAG se realizó la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).El protocolo de la PCR
usado fue el descrito por Warner et al.13 ,con algunas
modificaciones.Se amplificaron 150 ng de ADN genómico siguiendo
las condiciones usuales,con buffer 10X,2U de Taq polimerasa, agua y
0.5 µM de cada uno de los iniciadores HD1 y HD3 , que amplifican
selectivamente las repeticiones CAG.

78
La PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 25 µL.El perfil de
reacción utilizado en un termociclador Perkin Elmer (GGeneAmp PCR
System 2400) fue el siguiente: una desnaturalización inicial del ADN
por 4 min a 94 °C, seguida por 35 ciclos de 94 °Cpor 30S, 65 °Cpor
30S y 45S de extensión a 72 °C. Finalmente un período de extensión
última 2°C por 10 min.

Después los productos de la PCR se corrieron en minigeles de agarosa

al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio, en buffer TBE 1X pH:7.7
durante 1 hora con el fin de confirmar si había producto
amplificado.Luego,los productos de la PCR se sometieron a una
electroforesis sobre geles de poliacrilamida desnaturalizante al 6% ó
al 8%, en buffer TBE 1X pH: 8.0 por un período de 2h 50min, para
determinar el tamaño absoluto de los fragmentos. Los fragmentos
fueron visualizados mediante el método de tinción con nitrato plata
(Figura 1). Los alelos son considerados normales cuando tienen
menos de 36 repeticiones y expandidos cuando contienen más de 40
CAGs. Los alelos que tienen de 36 a 39 repeticiones presentan
penetrancia incompleta.

SECUENCIACION DEL ADN

METODO DE SECUENCIACION DE Maxam–Gilbert

Desarrollado entre 1976-77 por Allan Maxam y Walter Gilbert está

basado en modificación química del ADN y posterior partición a nivel
de bases específicas. Se realiza la marcación radioactiva con fósforo
32 a nivel del extremo 5´. El tratamiento químico produce rupturas
en los siguientes nucleótidos G, A+G, C, C+T. Luego se produce
electroforesis de los cuatro productos puestos uno al lado del otro. El
gel es luego revelado con placa radiográfica. Este método se conoce
también con el nombre de método químico.

METODOS DE TERMINACION DE CADENA

79
Dado que los métodos de terminación de cadena, o método Sanger es
más eficiente, utiliza menos químicos tóxicos y menores cantidad de
radioactividad que el método de Maxam y Gilbert, rápidamente se
transformó en el método de elección. La clave principal del método de
Sanger consiste en el uso de dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs)
como terminación de cadenas.

El método clásico utiliza un templado monocadena de ADN, un

primer, una ADN polimerasa, deoxinucleótidotrifosfatos normales
(dNTPs) y nucleótidos modificados (dideoxiNTPs) marcados en forma
radioactiva o con fluorescencia.

MATERIAL 1) TEMPLADO MONOCADENA DE ADN

2) PRIMER

3) ADN POLIMERASA

4) dNTPs

5) ddNTPs MARCADOS con (radioactividad o

fluorescencia)

La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación

separadas. Cada muestra contiene los cuatro deoxinucleótidos (dATP,
dGTP, dCTP, y dTTP) pero solo uno de los dideoxinucleótidos. Los
dideoxinucleótidos carecen del oxhidrilo en la posición 3´que se
requiere para realizar la unión fosfodiester, por lo que la cadena deja
de crecer cuando adiciona un ddNTP. Se producen por lo tanto
fragmentos de distinta longitud.

Los fragmentos de ADN recién sintetizado y marcado se

desnaturalizan por calor y se separan por tamaño mediante
electroforesis en un gel de poliacrilamida y urea, corriendo cada
muestra en una de las cuatro pistas del gel. Las bandas se visualizan
por autoradiografía o por luz ultravioleta y pueden leerse en un film
radiográfico. Una banda negra en una calle corresponde a un
fragmento de ADN cuya terminación corresponde al ddNTP que se le
adicionó. Las posiciones relativas de las diferentes bandas entre las

80
cuatro calles se usan para leer de abajo hacia arriba la secuencia de
ADN.

81
Las variaciones técnicas de la secuenciación por terminación de
cadena incluyen el marcado del nucleótido con fósforo radioactivo, o
el marcado del primer con fluorescencia en el extremo 5´. Este tipo
de marcado facilita la lectura en un sistema óptico.
Fue el trabajo de Leroy Hood et al de marcado fluorescente de ddNTPs
y primers que sentó las bases de la lectura automatizada.

82
Escalera de secuenciamiento por método radioactivo comparado con el fluorescente.

SECUENCIAMIENTO MEDIANTE ddNTPs MARCADOS

Permite el secuenciamiento en una sola reacción en lugar de cuatro

reacciones como con el método Sanger. Los 4 ddNTPs son marcados
con cuatro colorantes fluorescentes diferentes, que emiten a diferente
longitud de onda. Este es el método actualmente en uso por su
sencillez, exactitud y rapidez.

83
 Electroforesis capilar

Secuenciación automática

Entre el metodo quimico (Maxel – Gilbert) y el metodo de Sanger

existe una diferencia fundamental en cuanto al marcado: en el
quimico se marca el inicio de la cadena con P32 mientras que en el
metodo de Sanger la marca se produce al final de la cadena, a nivel
ddNTP.

84

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