Biología del nematodo Steinernema sp.

cepa CIAT25 (Nematoda: Steinernematidae) y

su bacteria simbionte

Elizabeth Laguna Fandiño
Microbiología
Pontificia Universidad Javeriana.

Resumen: se describió el ciclo biológico de Steinernema sp. Cepa CIAT25 (Nematoda:

Steinernematidae), aislado de suelos cultivados en el Valle del Cauca Colombia. Se hizo
seguimiento por 500 horas, a poblaciones de juveniles y adultos, presentes en larvas de
Galleria mellonella, mantenidas bajo condiciones controladas. Se sembró hemolinfa en dos
medios de cultivo para aislar la bacteria simbionte a partir de de larvas parasitadas de
Galleria mellonella, y fue tipificada con BBL Crystal®. Los estados de desarrollo se
caracterizaron a través de análisis morfológico y morfométrico, proceso mediante el cual se
discriminaron todos los estadios juveniles. Los resultados muestran que el nematodo cumple
dos generaciones de adultos anfimícticos y cuatro estados de desarrollo juvenil. Presenta
adultos de gran tamaño para la primera generación y relación de sexos 3:1. Las hembras
variaron ostensiblemente su capacidad de carga de primera a segunda generación, donde
presenta una hembra matricida. El Dauer larva obtenido no difirió en morfología ni
comportamiento parasítico respecto al juvenil infectivo usado en el proceso de parasitación.
La bacteria simbionte se caracterizó como Enterobacteriaceae del género Xenorhabdus. Dada
la baja tasa de penetración y el lugar de ingreso, este nematodo podría ser catalogado como
de estrategia emboscadora.

2. Introducción:

Los nematodos entomopatógenos (NE) son una alternativa para el control de plagas, debido a
su fácil producción, aplicabilidad, adaptabilidad, amplio rango de acción, muerte rápida al
hospedero (Stock et al., 2009) y reducido impacto ambiental (Kaya y Koppenhofer, 1990).
La identificación y el conocimiento de la distribución geográfica de especies de NE en la
última década han incrementado su uso en programas de control biológico de insectos de
importancia agrícola y epidemiológica animal o humana, principalmente en U.S.A. y Europa
(Stock et al., 2009). En Norte America y Europa el énfasis se ha concentrado en la
disponibilidad comercial de nematodos (Salma y Sharina 2012), mientras que en otras
regiones y países, se ha enfatizado en investigar la relación nematodo-bacteria, escalamiento,
formulación y producción comercial del nematodo, además del uso de metabolitos
secundarios de las bacterias simbiontes, en problemas fitosanitarios o como antibióticos en
salud animal y humana (Lee y Stock 2010). Modelos similares han sido desarrollados en
Japón, Korea, Turquía y China (Kaya y Stock 1997). En América latina y Colombia las
investigaciones se han centrado en registro y aislamiento de especies, se han reportado
trabajos en densidad y ecología de grupos funcionales en suelo (Machado et al., 2010),
ensayos de laboratorio y pruebas de campo con especies nativas y comerciales (Celeita, 2010;
Corredor et al., 2006; Sáenz et al., 2008; Melo et al., 2002; Caicedo et al., 2004; Leiva et al.,
2004; Parada et al., 2006) , mientras que la producción masiva se adelanta básicamente bajo
procedimientos in vivo (Parada et al., 2006), y en la determinación de condiciones ideales
para su produccion y aspersión de (NE) (Lara y Lopez 2005; Molina 2006).
Los nematodos del género Steinernema (Travassos, 1927) son patógenos obligados de
insectos. Presentan características únicas ya que tienen una relación mutualista con bacterias
gram-negativas del género Xenorhabdus (Poinar y Thomas, 1979) (Proteobacteria:
Enterobacteriaceae) (Lee y Stock, 2010). La única etapa de vida libre del nematodo juvenil
infectivo (JI), Dauer larva o juvenil III, porta la bacteria Xenorhabdus en Fase I, dentro de
una vesícula anterior del intestino. Una vez el juvenil infectivo (JI) localiza su potencial
hospedante, penetra vía boca, ano o espiráculos y dentro libera las células bacteriales en el
hemocele, donde se multiplican, causando septicemia y matando al hospedante entre 24-48
horas (Stock, 2009). El ciclo de vida de las especies del género Steinernema presenta un
estado de huevo, cuatro estados juveniles y un estado adulto anfimíctico (macho y hembra),
ocurriendo generalmente dos generaciones en un insecto hospedero (Kaya y Stock 1997).
De las 61 especies de Steinernema registradas actualmente en el mundo
(entnem.ifas.ufl.edu/nguyen/morph/steinsp1.htm), en Colombia se han reportado 8 especies,
tanto en ecosistemas naturales como en suelos de uso agropecuario (Parada, 2006). Las
investigaciones sobre especies nativas en el país han mostrado resultados sobre biología
básica (Triviño et al., 2006); comportamiento parasítico en plagas de café (López et al.,
2003), palma (Leiva et al., 2004), papa (Parada et al., 2006; Corredor et al., 2006; Sáenz et
al., 2008), yuca (Melo et al., 2002; Caicedo et al., 2004; Leiva et al., 2004) y caña de azúcar
(Moreno et al., 2011). Igualmente se han iniciado trabajos sobre producción masiva in vitro
(Parada et al., 2006), así como de bacterias simbiontes, particularmente Xenorhabdus
bovienni, simbionte de la especie nativa S. feltiae (Triviño 2006; Parada, 2007; Leguízamo y
Parada 2008; Leguízamo et al 2009; Vela et al, 2009).
A pesar del registro de especies nativas (Molina et al., 2010; Andalo 2011; Santos 2011) y
que el interés de uso e investigación de los nematodos entomopatógenos se ha extendido en el
territorio colombiano, su producción y comercialización se encuentra restringida, dada la
falta de conocimiento de su biología básica. En Colombia son pocos los trabajos enfocados a
la determinación de ciclo de vida, biología y comportamiento parásitico de los (NE) (Sáenz y
Lopez 2011; Sáenz y Olivares 2008; Mejia 2010; Triviño 2002; Parada et al., 2006), lo cual
es preponderante para posteriores procesos de escalamiento a nivel comercial, ya que son la
base para definir procedimientos de control de calidad, tanto para los que potencializan su
comercialización y uso, como de las entidades encargadas del control fitosanitario en el país.

Por lo anterior la presente investigación buscó entender y describir la biología básica del
aislamiento CIAT25, el cual fue reportado por el Centro Internacional de Agricultura
Tropical (CIAT) en Palmira, Valle del Cauca. Además de describir el ciclo de vida, la
variación morfométrica y el comportamiento parasítico de Steinernema sp. cepa CIAT25, se
caracterizó su bacteria simbionte. El nematodo fue aislado en un trabajo sobre diversidad de
nematodos de suelo realizado en el Laboratorio de Control Biológico de la Facultad de
Agronomía en la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá y en el Laboratorio de
Entomología Yuca del CIAT en Palmira Valle del Cauca (Melo 2010).

3. Justificación.

Dentro de los diferentes parámetros de calidad de JI a tener en cuenta en procesos de

escalamiento, comercialización y uso de nematodos entomopatógenos están las condiciones
físicas y morfológicas de los estadios de desarrollo; las condiciones morfológicas y
morfométricas de JI, tasa reproductiva, relación de sexos y capacidad de carga de las
hembras, entre otros aspectos. Por tal razón desarrollar protocolos y procesos para describir el
ciclo de vida y caracterización de los diferentes estadios de desarrollo de un nematodo
entomopatógeno, bajo condiciones in vivo es un proceso preponderante para posteriores
investigaciones y desarrollo en la comercialización y uso de estos organismos.
De igual forma los datos establecidos en el ciclo de vida brindan una base para la
determinación de tiempos y condiciones reológicas de cultivos artificiales para producción
masiva in vitro de nematodos entomopatógenos (NEPs), ya sea en aspectos netamente
biológicos como ambientales. Es así como diferencias morfométricas entre los parámetros
brindados por el presente estudio de la cepa CIAT25 en comparación con nematodos de
producción masiva, determina la calidad de los medios de cultivo, condiciones de aireación y
temperatura, entre otros.

4. Referentes Conceptuales:

NE y Control Biológico: Los nematodos Steinernema son excelentes candidatos en el

control de insectos plaga, por la combinación de atributos que poseen, la presencia de un
amplio rango de hospederos, fácil producción, aplicabilidad, adaptabilidad (Stock et al.,
2009) y la habilidad para buscar e introducir sus bacterias simbióticas dentro del cuerpo del
insecto, matándolo por septicemia dentro de las 24-48 horas (Gaugler y Kaya 1990).
Estos actúan ingresando al hospedero como juveniles infectivos por aberturas naturales como
ano, boca o espiráculos y en el interior del hospedero los J3 liberan la bacteria simbionte en
la hemolinfa, matando al insecto por septicemia (Kaya y Stock 1997). El hospedero muere y
se torna color crema dando lugar al desarrollo de J4 (preadultos), para dar paso a la primera
generación de adultos anfimícticos. Macho y hembra copulan y producen huevos que pasan a
estados de desarrollo J1, J2, J3 y J4 que dan lugar a la segunda generación, la cual liberará los
J3 o dawer larva (Parada 2001, Triviño et al. 2002), los cuales conservan la cutícula del
segundo estado juvenil, que les confiere resistencia a condiciones ambientales adversas
(http://ag.arizona.edu/ento/faculty/stock/publications.htm).
Registro biológico de NE: Los nematodos entomopatógenos de la familia Steinernematidae
están asociados con bacterias específicas del género Xenorhabdus sp. (Poinar 1979). El JI
lleva las células bacterianas simbiontes en el intestino y después de penetrar en un insecto
hospedero, el nematodo migra hacia el hemocele donde libera su bacteria simbionte. Esta
pasa a una fase infecciosa que permite matar al insecto y proporcionar las condiciones
adecuadas para el crecimiento y reproducción de los nematodos.
En Colombia se han realizado trabajos de reconocimiento de especies nativas de Steinernema
sp. en suelos bajo producción de yuca (Ortega et al., 2009), palma (Leiva et al., 2004), café
(Stock et al., 2004) papa (Parada 2006), maíz, soya (Leguízamo y Parada 2008) plátano,
pasto, cebolla, frijol y maní (Melo et al., 2002), como también se han realizado estudios de
aplicación a plagas de café (López et al., 2003), palma (Leiva et al., 2004), papa (Parada et
al., 2006; Corredor et al.,2006; Sáenz et al.,2008), yuca (Melo et al., 2002; Caicedo et al.,
2004; Leiva et al., 2004) y caña de azúcar (Moreno et al., 2011).
Estudios de ciclo de vida: Se usan generalmente dos procedimientos, in vivo e in vitro. Para
los procedimientos in vivo comúnmente se utiliza como insecto hospedero larvas de cuarto
instar de Galleria mellonella L. infectadas con juveniles infectivos sobre papel filtro estéril o
arena gris de río, en cajas de Petri estériles. Después de la inoculación se procede a
diseccionar las larvas cada 6 a 12 horas hasta que se inicie la emergencia de JI fuera de los
cadáveres infectados del insecto. Para cada muestra se procede a fijar el material como se
expuso anteriormente. Este procedimiento es usado en la determinación de patogenicidad del
nematodo sobre especies insectiles y determinar su tasa de colonización del hospedero por
boca, ano y espiráculos, además del ciclo de vida bajo condiciones naturales del nematodo
(Sáenz, 1998).
Otro procedimiento se basa en preparar un montaje estéril de cajas de Petri con papel filtro
humedecido y láminas portaobjetos. Dentro de ellas sobre la lámina es colocada un agota de
hemolinfa de larvas de G. mellonella y se liberan JI (Triviño et al., 2006). Los JI deben ser
esterilizados superficialmente con una solución desinfectante con antibióticos o sustancias
químicas (Stock, 1998; Woodring y Kaya, 1999). Se realizan observaciones a intervalos
iguales de tiempo y a medida que se agota la hemolinfa por acción de alimentación de los
nematodos y colonización de la bacteria simbionte, se transfieren a nueva hemolinfa de una
manera aséptica, y se procede a extraer los especímenes como lo descrito atrás. Este
procedimiento permite además de determinar ciclos de vida, realizar pruebas de
entrecruzamiento entre especies de nematodos entomopatógenos en procesos de clasificación
taxonómica (Parada, 2006).
Dentro los procedimientos in vitro se procede inicialmente con el aislamiento de la bacteria
simbionte del nematodo en estado Dauer (Akhurst, 1980), la cual después de purificada en
NBTA o Agar MacConkey es sembrada en medios sólidos en cajas de Petri con Agar oleoso
(bactoagar, aceite vegetal, extracto de levadura, caldo nutritivo y buffer fosfato) (Volgyi et
al., 1998) o medios líquidos basados en infusiones de tejidos animales (Nguyen y Smart,
1995). Allí el estado inicial generalmente es el de huevos fertilizados obtenidos de hembras
grávidas de primera generación, digeridas en soluciones de ácido láctico, NaOH o hipoclorito
de sodio por 10 minutos para no afectar la viabilidad de los huevos (Nguyen y Smart, 1995,
Martínez y Parada, 2006).
Se toman muestras cada 12 horas, lavándolas con agua destilada estéril, y fijando los
individuos con TAF, Así mismo para preservar los especímenes se utiliza el procedimiento
Seinhorst (Parada y Sáenz, 1999; Stock, 1998), para hacer observaciones requeridas según el
siguiente objetivo.
Ensayos de parasitismo: Estas pruebas son útiles en la medida que se verifique la virulencia
de los nematodos sobre el hospedero blanco. La virulencia se puede definir como la
capacidad de un organismo de producir enfermedad o muerte (Glazer y Lewis, 2000). Se
reconocen los ensayos de penetración, que reflejan la habilidad del nematodo para ingresar
dentro del hospedero (Kaya y Gaugler, 1993; Parada et al., 2006); el tiempo de exposición
(Huber y Hughes, 1984), indica la tasa de penetración la columna de arena mide la habilidad
del nematodo para localizar y penetrar el hospedero blanco (Caroli et al., 1996); y los
ensayos uno a uno, representan el proceso completo de infección. La susceptibilidad del
hospedero se registra por medidas de comportamiento de reconocimiento de hospedero.

5. Objetivos:
5.1 General: Bajo condiciones controladas caracterizar el ciclo de vida, comportamiento
parasítico y la bacteria simbionte asociada al nematodo entomopatógeno Steinernema sp.
 cepa CIAT25.
5.2 Específicos:
Determinar el comportamiento parasítico de Steinernema sp. cepa CIAT25.
Describir el ciclo de vida Steinernema sp. cepa CIAT25 en larvas Galleria mellonella.
Elaborar diagnosis diferencial con base a la morfología y morfometría de Steinernema
sp. cepa CIAT25.
Determinar la bacteria simbionte asociada al nematodo Steinernema sp. cepa CIAT25
y observar el fenómeno de disociación de fases in vitro.

6. Metodología:
6.1 Material biológico:
6.1.1. Cría G. mellonella: Partiendo de una población de 25 larvas de G. mellonella
proveniente del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) se estableció una
cría en el Laboratorio de Control Biológico de la Facultad Agronomía en la
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, de acuerdo al protocolo de cría
propuesto por Triviño et al. (2006). Para obtener larvas se procedió a:
Usar un aspersor para desinfectar las larvas con una solución de hipoclorito de sodio al
0.1%, para luego rociarlas con agua destilada estéril quitando residuos del
desinfectante.
Elaborar una dieta artificial a base de cera de abejas, que se dispuso en frascos
bomboneros previamente esterilizados. La dieta consistió de harina de maíz (160 g);
germen de trigo (160 g); levadura (56 g); glicerina (130 g); miel (250 g) y cera de
abejas (120g).
Disponer las larvas sobre la dieta, en frascos bomboneros de 2 l con tapas perforadas.
Mantener los frascos a una temperatura de ± 28ºC y una humedad relativa del 70%,
bajo condiciones de oscuridad.
Una vez presentada la etapa de pupa, estas fueron dispuestas en nuevos frascos, con
tiras de papel encerado, a la espera de la emergencia de adultos.
Recolectar los papeles cada 24 horas, para disponerlos de forma inmediata en nuevos
recipientes con dieta elaborada y así reiniciar el ciclo.
6.1.2. Escalado in vivo de Steinernema sp. cepa CIAT25: se usaron nematodos
depositados en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) aislados de
suelos colectados en el corregimiento Potrerillo, vereda el Olivo, finca Utopía (prom.
1600 m.s.n.m.; 03º33’07,2 N y 76º10,5’50,3 W) departamento del Valle del Cauca, en
cultivos de producción intercalada de banano y café.
Para el escalamiento in vivo del nematodo se siguieron las recomendaciones de
Lindegren et al. (1993); Triviño, (2002); Parada (2006) y Sáenz et al. (2008). El
procedimiento de cría comprendió los siguientes pasos:
Se almacenaron entre 4.000 y 5.000 JI en una caja de Petri plástica de 20 cm de
diámetro, con papel filtro Whatman No. 1, previamente esterilizado en horno a 300°C
Lindegren et al. 1993.
Se liberaron 15 larvas de último instar de G. mellonella en cada caja y se incubaron en
oscuridad (Triviño et al. 2002), a ±15°C, por siete días aproximadamente (Sáenz et al.
2008).
Después del período de incubación los cadáveres se recolectaron, realizando
desinfección superficial, con una inmersión en hipoclorito de sodio al 0.1% durante 30
segundos.
 Las larvas se lavaron con agua destilada estéril, luego se colocaron dentro de una caja
de Petri (60 x 15 mm) sobre papel filtro Whatman No. 2 (Lindegren et al. 1993).
Para la cosecha de juveniles infectivos, las larvas fueron transferidas a trampas White
(1929) modificadas (Parada 2006), que consisten en colocar en el centro de la caja Petri
de cuadrantes papel filtro Whatman No. 2 con 5 cm de diámetro, con los cadáveres de
G. mellonella. Luego se agregó 1 ml de agua destilada estéril a cada cuadrante de la
caja.
Los cadáveres permanecieron en la trampa por una semana. Transcurrido este tiempo se
revisó constantemente la migración de los nematodos al agua destilada estéril, teniendo
en cuenta el tiempo que tardaron en emerger de las larvas de G. mellonela (Stuart et al.
2003, Parada 2001).
Se realizaron varias infecciones hasta obtener una población de nematodos de
16.000/ml juveniles infectivos y una población de G. melonella de 600 larvas de último
instar de desarrollo.
6.2 Diseño experimental básico: Se diseñó un ensayo que permitiera registrar información
acerca del desarrollo biológico del nematodo, así como de su comportamiento parasítico.
Con este propósito se expusieron individualmente 250 larvas de G. mellonella a
concentraciones de 10JI/10µm y 50JI/10µm de agua destilada estéril, con base a la
metodología propuesta por Triviño (2002). Durante 540 horas continuas de evaluación, se
disectaron 5 larvas de cada concentración, en los siguientes intervalos de tiempo: las
primeras 72 horas con intervalos de 4 horas , de la hora 80 a la 168 cada 8 horas, de la
hora 180 a 288 cada 12 horas y cada 24 horas a partir de la hora 312. Con la finalidad de
tener información acerca de sitios de ingreso de JI, tasa de penetración, estados de
desarrollo variacion morfometrica y finalmente determinación del tiempo de muerte del
hospedero y tasa de mortalidad.

6.2.1. Registro de Información: la observación y exposición de las larvas de G.

mellonella, a través de la disección, determinó la asociación con el nematodo y la
actividad parasítica del mismo. Para la disección de larvas estas se sujetaron con la
ayuda de alfileres entomológicos, sobre una capa sólida de parafina dentro de cajas de
Petri 110x100mm. Una vez sujetas se procedió a realizar un corte longitudinal, desde la
base de las mandíbulas hasta la base del orificio anal. Durante el procedimiento se
mantuvo húmeda la larva con solución Ringer, a fin de evitar un choque osmótico de
los nematodos presentes. Para cada uno de los montajes, en las dos concentraciones, se
disectaron cinco larvas de G. mellonella al azar en los tiempos estimados para el
muestreo, con base en el diseño experimental.

Una vez determinada la localización de los nematodos dentro de las larvas, en cada uno de
los muestreos, estos fueron colectados en viales con agua destilada esteril ADE, y tras
continuos lavados por decantación, se fijaron en solución TAF (2 ml de Trietanolamina, 91
ml de agua destilada estéril o solución salina y 7 ml de Formaldehído al 38%), para
posteriormente ser preservados por la técnica de Seinhorts (Southwood, 1976; Stock, 1998).
La preservación inició transfiriendo los ejemplares fijados a vidrios de Siracusa, que
contienen 1 ml de solución I (20 partes de etanol al 95%, 1 parte de glicerina, 79 partes de
agua destilada). Los vidrios de Siracusa son ubicados sobre una rejilla en un desecador
conteniendo al menos 1/3 en volumen, de etanol al 95%, y llevados a incubadora a 35ºC por
12 horas, logrando una lenta evaporación de agua de la solución.
Luego de este tiempo se adiciona 1 ml de solución II (5 partes de glicerina, 95 partes de
etanol) y son parcialmente cubiertos, para ser llevados a 40ºC durante 3 horas. Durante este
tiempo se da una lenta evaporación del etanol, logrando así nematodos en glicerina pura,
listos para ser montados. Algunos especímenes mostraron contracción. En este paso fueron
transferidos a una mezcla nueva de etanol/glicerina para repetir este último procedimiento
(Stock, 1998).
Para observaciones y caracterización morfométrica, los especímenes fijados y preservados se
dispusieron sobre glicerina entre laminillas cubre objetos, fijadas con bálsamo de Canadá.
6.3. Parasitismo del JI:Se cálculo y analizó el comportamiento del JI respecto a:
Sitio de ingreso al hospedero: durante las primeras disecciones las observaciones
buscaron establecer la localización de los JI respecto a los orificios naturales de las larvas,
como boca, ano y espiráculos. De esta forma se inspeccionaron espiráculos y conductos de
conexión hacia el sistema traqueal del insecto. Para verificar ingreso por boca se examinó
el intestino anterior y en cuanto a ingreso por el ano, las observaciones se centraron en
intestino posterior, glándula rectal y tubos de Malpighi. Para establecer este resultado
fueron disectadas 155 larvas de G. mellonella por concentración.
Capacidad de penetración del nematodo al hospedero (CPh): Se estableció calculando
la población inicial de JI a la que fueron expuestas las larvas de G. mellonella sobre el
número máximo de juveniles infectivos ingresados, usando el algoritmo:

Donde:
Cph= Capacidad de penetración
= Número de nematodos dentro de la larva
= Total de nematodos liberados

Porcentaje mortalidad o eficacia: Para obtener el porcentaje de mortalidad de larvas de G.

mellonella se contó en cada hora del muestreo programado, el número de cadáveres y de
larvas vivas encontradas. Siendo el 100% el número de larvas disectadas por hora. En total
fueron disectadas 510 larvas de G. mellonella durante toda la evaluación.
6.4. Ciclo de vida:
Se determinó el crecimiento poblacional, realizando un recuento de la variación en el
número de especímenes dentro del hospedero durante 540 horas de evaluación, realizando
conteos en cada disección con base en el diseño experimental. Se determinó la población
total, y su comportamiento poblacional dentro del hospedero. Con base en la morfología y
morfometría de los estados de desarrollo, sobre un total de 9.785 nematodos de
Steinernema sp. cepa 25 obtenidos durante el ciclo se determinaron las siguientes
variables:
Duración de cada estado: con base a la morfología y morfometría de los estados de
desarrollo se contó el número de especímenes existentes por estado y se evaluó el tiempo
que permanecen en este o el tiempo que tardan en cambiar al siguiente estado.
Relación de sexos: se contó el número de hembras y el número de machos en cada
disección, para luego establecer la relación o diferencia entre estos en primera y segunda
generación, durante las 528 horas de evaluación.
Capacidad de carga hembras: se realizaron conteos del número de huevos dentro de
 cada hembra (Triviño et al. 2002) en las dos generaciones.
Formación Dauer larva o JI: se determinó con el tiempo que tardó (en horas) en
formarse el estado juvenil infectivo dentro de las larvas de G. mellonella que se definió
por la presencia de doble cutícula.
Tasa de emergencia: se determinó estableciendo la diferencia del número de juveniles
infectivos que migran de las larvas hospedero al finalizar el ciclo, con el número de
individuos inoculados por larva al iniciar las horas de evaluación (concentración inicial de
infección). Esta variable fue evaluada cada 24 horas luego de observar la primera
migración de J3 y hasta completar las 528 horas de evaluación.
6.5. Estudio morfológico y morfométrico. Se realizó por medio de captura de imágenes de
estructuras diagnósticas, usando microscopio (equipado con cámara y software
MOTIC2000®), organizando una matriz de caracteres, para posterior análisis a través de
modelos estadísticos de clasificación. A partir del análisis de caracteres diagnósticos, se
elaboró una diagnosis diferencial e ilustrada de la especie en estudio, la cual
posteriormente puede ser comparada con información de taxa clasificados. Todos los
nematodos encontrados durante el tiempo de evaluación (un total de 9.785) fueros
sometidos a este procedimiento, exceptuando el 40%(±) de J1 que por poco desarrollo y
tamaño solo permitieron medidas como longitud y ancho máximo corporal.

Se capturaron imágenes de cada estado de desarrollo, segmentos y órganos de los

especímenes en objetivos 4, 10, 40 y 100x. Para los diferentes estados de desarrollo se
describieron en detalle estructuras diagnósticas de los estados de desarrollo del nematodo
como labios, estoma, esófago, y genitalias internas y externas en adultos. Igualmente se
registraron medidas básicas dadas por Mann (1880), Nguyen (1996), Stock (1998), entre
otros autores (Figura1).
En una matriz de caracteres se registraron medidas como L: longitud total; W: ancho
máximo corporal; Ph: distancia cabeza base de esófago; T: longitud de la cola; Wc: Ancho
de la cola; Pe: distancia cabeza-poro excretor; y se calcularon los índices a:L/W; b:L/Ph;
c:L/T; d:Pe/Ph; e: Pe/T. Igualmente para machos se registró Le: longitud espícula y el
índice f: L/Le.
Con el fin de determinar variación a través del desarrollo biológico del nematodo dentro
de su hospedante, se calculara volumen corporal, para cada uno de los estados de
desarrollo que se presenten, usando el método propuesto por Andrassy (1956), ajustado
por Zuckermn et al., (1967), usando el algoritmo matemático:

Volumen en
Siendo a el ancho máximo (W); b es longitud corporal total (L) y 1.7 una constante.
Para discriminar las variaciones de estados de desarrollo de los nematodos aislados del
hospedante, la información morfométrica resultante fue analizada estadísticamente por el
método de componentes principales y análisis discriminante, usando software JMP4 de
SAS.
Figura 1. Medidas básicas en Nematoda (Mann, 1880) L: longitud total; W: ancho máximo
corporal; Ph: distancia cabeza base de esófago; T: longitud de la cola; Pe: distancia cabeza-
poro excretor; Le: longitud espícula (tomado de Southey, 1986).

6.6 Bacteria simbionte: para su aislamiento se usó el método gota de hemolinfa, usando
larvas de 24 horas de infección. Las larvas fueron esterilizadas superficialmente con alcohol
al 70%, y dos lavados en agua destilada estéril (ADE). Tras ser disectadas, y con la ayuda de
asa bacteriológica, las gotas de hemolinfa fueron dispuestas en medio NBTA (20.0 g/l, agar
nutritivo 0.025 g/l, azul de bromotimol (ABT) 0.04 g/l; cloruro de sodio 2, 3, 5 g/l) y
MacConkey para luego llevar a incubación durante 48 h a 25oC.

Tras tres aislamientos y dos repiques de colonias en Fase I (azules) y Fase II (rojas), en
medio NBTA, se obtuvo un cultivo puro, que se usó para clasificación por medio de paneles
BBL Crystal®.

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Parasitismo Steinernema sp. cepa CIAT25:

7.1.1 Sitio de ingreso y capacidad de penetración al hospedante: De acuerdo a la tasa de

penetración de los JI y tiempo de muerte de las larvas, se presume que este JI podría llegar a
presentar comportamiento de ataque tipo emboscador, similar a S. carpocapsae, que presenta
tiempos y tasas de parasitismo hacia las 56 horas de exposición directa al hospedante
(Campbell y Gaugler, 1993), mientras que los de estrategia de ataque tipo buscador presentan
tasas de penetración y muerte del hospedero hacia las 48 horas. Así mismo la tasa de
mortalidad y reproducción del nematodo dentro del hospedero, permiten obtener un promedio
adecuado de producción de larvas tipo Dauer, lo que prevé que este nematodo podría estar
dentro de un grupo de especies de emboscadores, con alta capacidad de uso en control de
especies de artrópodos de alta movilidad y dispersión en suelo y no con aquellos de hábitat
críptico (Corredor et al., 2006).

Tal vez la condición del nematodo como emboscador podría también verse reflejada en la
preferencia de sitios de penetración de los JI, de acuerdo a la concentración de nematodos
que se evalúen (Gráfica 1). Al igual que varios de los nematodos emboscadores, la mayor
tasa de penetración se presentó por el estoma o boca del hospedero, aún en bajas
concentraciones (Figuras 1 y 2). Sin embargo al revisar la tasa de penetración de los JI a las
larvas, se advierte mayor penetración en la concentración 50JI/10µm (Gráfica 2), respecto a
la concentración 10JI/10µm. Aunque se vislumbra el comportamiento tipo emboscador del
nematodo Steinernema sp. cepa CIAT 25 es necesario realizar ensayos especificos para
definir el comportamiento del nematodo, como pruebas en columna de suelo y arena, que
permiten determinar la movilidad de este en suelo, frente a un atrayente como G.mellonella.
(Parada et al., 2006).

Figuras 1 y 2: Diseccion longitudinal de una larva G. mellonella, para observar el ingreso de

JI Steinernema sp. cepa CIAT25 por estoma o espiraculos del hospedero. Bajo objetivo 10X
y 40X.

Aunque altas concentraciones permiten mayor posibilidad de contacto con el hospedante, no

siempre se garantiza mayor probabilidad de ataque (Campbell y Gaugler, 1993; Corredor et
al., 2006) pues como lo anota Westerman (1999), mayores densidades de nematodos,
particularmente en emboscadores, aumentan la probabilidad de agregación de los JI. Esto
puede llegar a minimizar la tasa de penetración posibilitando que los nematodos ingresen más
por vía oral al hospedante y no por áreas que lleven al nematodo a adaptarse al espacio y
morfología de hospedero, lo que puede eventualmente llevarle más tiempo y esfuerzo de
búsqueda e ingreso por aperturas como el ano y principalmente los espiráculos.

De acuerdo a las horas de mayor ingreso de JI al hospedero es presumible que entre las 80 y
100 horas (Gráficas 2 y 2ª), este nematodo se toma tiempo para acondicionarse y localizarse
respecto al hospedero, similar al típico emboscador S. carpocapsae (Epsky y Capinera,
1994), contrario a lo reportado para especies como S. feltiae, que presentan altas tasas de
penetración por boca, ano y espiráculos, hacia las 50 horas (Corredor et al., 2006; Triviño et
al., 2006).
 Gráfico 1: Sitios de ingreso de JI a larvas de G.mellonella, en concentración de 10JI/10µ y
50JI/10µm, durante las primeras 144 horas de Steinernema sp. cepa CIAT25 dentro del
hospedero.

Gráfica 2: Penetración promedio de JI a larvas de G.mellonella, en concentración de

10JI/10µ (rojo) y 50JI/10µm (azul) por larva, durante 180 horas de evaluación de
Steinernema sp. cepa CIAT25 dentro del hospedero.
Gráfica 2: Porcentaje de penetración de JI a larvas de G.mellonella, en concentración de
10JI/10µ (rojo) y 50JI/10µm (azul) por larva, durante 180 horas de evalucion de Steinernema
sp. cepa CIAT25 dentro del hospedero.

7.1.3.
Porcentaje de mortalidad o Eficacia: Dado que para evaluar la capacidad parasítica

de un nematodo es necesario tener en cuenta variables como estrategia y capacidad de
búsqueda, capacidad de penetración, tiempo de muerte de la larva (Glazer, 1992), y
desarrollar ensayos sobre los propios blancos a controlar. Los resultados obtenidos en este
ensayo permiten determinar que esta especie podrá tener un potencial sobre plagas
abundantes en suelo, que presenten tendencia a ser muy sésiles y de hábitat no crípticos.

No obstante al comparar la tasa de penetración del nematodo cepa 25 con otras especies de
importnacia como S. fetiae que alcanza su punto máximo de ingreso alrededor de las 48 horas
(Triviño et al., 2006), la tasa de penetración del nematodo cepa CIAT25 fue más baja y más
lenta. Pero aunque esta especie se toma en promedio 50 horas para penetrar su hospedero
(Gráfica 2) e iniciar su desarrollo, la muerte de las larvas es más eficiente, registrando el 50%
de mortalidad en una población, hacia las 88 horas, llegando a un 100% a las 100 horas
(Gráfica 3). En especies como S. fetiae, el mayor porcentaje de mortalidad es de 60%
(Triviño et al., 2006), y 50% para S.carpocapsae (Cabanilla et al., 1996). Estos resultados de
la cepa 25 muestran actividad sostenida de la bacteria simbionte, lo que a su vez vislumbra
un variado grupo de metabolitos secundarios en acción (Boemare y Akhurst, 1990). De igual
manera durante las primeras 152 de inoculación se observaron picos y variaciones en la
motalidad de las larvas de G.mellonella (Gráfico 3), debido probablemente a que las larvas
disectadas durante el ensayo, no provenían de la misma progenie y por lo tanto algunas
presentaron mayor resistencia al parasitismo de los nematodos.
Gráfico 3: Porcentaje de mortalidad en larvas de G.mellonella, inoculadas con JI
Steinernema sp. cepa CIAT25 en concentracion de 10JI/10µ (rojo) y 50JI/10µm (azul) por
larva, durante 528 horas de evaluación. 


7.2 Ciclo de Vida y Variación Morfométrica: La especie Steinernema sp. CIAT25

presentó todos los estados de desarrollo propios de un nematodo entomopatógeno (Stock,
1998). Como típico Ecdyzosoa, los JI que ingresaron, mudan a un J4 y de este a la primera
generación de adultos anfimícticos, desarrollándose en primer lugar machos y posteriormente
las hembras gigantes (Figura 3 y 4). Las hembras presentaron ovarios anfidélficos cargados
de huevos fertilizados, que son depositados luego en el hemocele. Los J1 se desarrollan y
emergen del corium, y tras 4 mudas llegan a adultos anfimícticos de segunda generación.
Machos y hembras de segunda generación copulan y dan paso al desarrollo de hembras
matricidas (Figura 5), que contienen huevos, J1 y en algunos casos J2, luego se formó el
Dauer larva, que retuvo la cuticula del segundo estado de desarrollo. Entre el ingreso del JI
hasta la formación del Dauer larva, el desarrollo de las dos generaciones de nematodos, se da
en 500 horas aproximadamente (Tabla 2). Aunque se distingue cierta sincronía en las mudas
y estados de desarrollo es evidente el traslape de estados, particularmente hacia la segunda
generación, por la presencia de las hembras matricidas.

Figura 3: Vista bajo el microscopio de Figura 4: Vista bajo el microscopio

estados juveniles, machos y hembras de de macho y hembras de primera
primera generacion de Steinernema sp. generacion de Steinernema sp. cepa
cepa CIAT25 en larva hopedero G. CIAT25 en larva hospedero G.
mellonella. Objetivo 4x. mellonella. Objetivo 4x.
Figura 5: Hembra matricida segunda generación de Steinernema sp. cepa CIAT25 en larva
hospedero G. mellonella. Objetivo 10x. 52 503

Tabla 2. Variación en volumen de los estados de desarrollo presentes en el ciclo de vida de

Steinernema sp. CIAT25, en G. mellonella, sobre un total de 9.785 nematodos. JI=juvenil
infectivo; J1, J2, y J3=juveniles dentro del hospedante; G1=1ªgeneración (celda azul) y
G2=2ªgeneración 2ª(celda crema); Dauer= JI que emerge del hospedante.

Volumen Volumen Volumen Volumen

Volumen Volumen Volumen Volumen Volumen Volumen
HORA Macho G1 Hembra Macho G2 Hembra
JI (µ) J4 (µ) J1 (µ) J2 (µ) J3 (µ) Dauer (µ)
(µ) G1 (µ) (µ) G2 (µ)
44 196.978
48 199.853
52 206.476

56 182.823
60 240.389 878.878
64 208.321 749.006
68 200.233 746.587

72 220.195 701.207
80 242.836 655.508
88 662.818
96 545.633
104 651.724

112 213.370 2.200.913

120 436.823
128 1.751.590 4.134.089 191.583
136 648.438 5.141.188 1.084.104 233.568
144 736.043 10.249.236 807.561 231.108

152 710.018 5.137.307 1.337.584 179.591

160 701.781 5.112.589 852.870 22.609 236.117
168 679.946 5.374.501 71.495.455 13.876 38.395 188.828
192 660.836 5.356.270 70.387.648 56.873 197.883
204 670.863 5.685.119 101.637.729 35.538 242.763

216 535.110 5.434.455 110.272.203 11.951 37.762 266.320

228 468.040 6.349.431 105.699.5 13.575 34.756 272.056
240 565.769 5.689.596 98.244.469 15.698 29.954 263.468
252 241.653 5.387.105 29.401.190 10.376 28.027
264 247.004 92.654.224 10.573 30.284
276 231.996 10.229 23.535
288 275.748 13.893 24.918 47.858
300 329.215 32.723
324 574.080 30.696 249.823
348 697.619 225.427 1.055.125 7.064.752
372 658.430 203.114 1.308.033 8.977.984
396 722.285 14.948 24.298 1.672.214 13.576.483
420 14.488 12.167 25.818 1.412.891 13.466.245
444 12.636 28.629 1.431.852 13.211.942 249.883
468 12.869 24.360 1.475.883 13.403.052 253.297
492 13.279 28.635 253.557
516 52.236 264.264
540 236.785

7.2.1. Duracion de cada estado y Crecimiento poblacional: Las dos generaciones de

nematodos dentro del hospedero se pueden discriminar a partir el tamaño de los juveniles
(tabla 3), la presencia de los adultos (tabla 4) y del Dauer larva (tabla 5). Además de tener en
cuenta el tiempo transcurrido desde la formación del J4 y del J3 proveniente de los primeros
adultos anfimícticos, como tambien la población inicial de J3 hasta la formacion del Dauer
larva.

De acuerdo a la tabla 2, especímenes de juveniles y adultos de primera generación se

desarrollan entre las 60 y 276 horas, durando 211 horas aproximadamente, siendo su evento
cumbre las 160 horas, donde se desarrollan y copulan los adultos. La presencia de J3,
provenientes de adultos de primera generación presentes hacia las 140 horas, denotan
posiblemente copulas precoces y solapamiento de poblaciones. La segunda generación inicia
hacia las 264 horas, con los J4 que mudaron de los J3 solapados, y termina con la presencia
de los Dauer hacia las 500 horas, llevando un tiempo de 230 horas aproximadamente.
Aunque la segunda generación lleva algo más de permanencia en el tiempo, la primera
generación es más prolífica en población, es decir genera mayor número de especímenes, en
menor tiempo.

7.2.1.1. Estados Juveniles: la permanencia del JI hasta las 80 horas aproximadamente, puede
atribuirse a una lenta adaptación del nematodo a la larva, y a ingreso tardío que se dan hasta
la hora 60. Periodos largos de ingreso al hospedero por parte del JI, permiten asegurarse a su
hospedero por más tiempo y así evitar ataque por carroñeros u otros parásitos (Glazer, 1992).
Igualmente en la tabla 2, se evidencia un porcentaje de JI que muda rápidamente a J4, lo cual
se evidencia por el aumento en volumen y morfometría en general (Gráfica 4). Una vez dada
la cópula se presenta buen número J1 en el hemocele del hospedero, los cuales por su tamaño
(Tabla 3) se dispersan rápidamente dentro de la larva e inician muda inmediatamente a J2 y
estos J3, en la que se evidencia una rápida variación en biomasa corporal (tabla3). La
actividad de estos juveniles se da por más horas, tiempo en el cual invaden por completo la
larva y dispersan la bacteria simbionte (Stock, 1998).

Tabla 3. Promedio Variación morfométrica de juveniles (J) presentes en el ciclo de vida de

Steinernema sp. CIAT25, en G. mellonella L: longitud total; W: ancho máximo corporal; Ph:
distancia cabeza base de esófago; T: longitud de la cola; Wc: Ancho de la cola; Pe: distancia
cabeza-poro excretor. Índices a:L/W; b:L/Ph; c:L/T; d:Pe/Ph; e: Pe/T. Las celdas vacías
corresponden a ocasiones en que el tamaño y el desarrollo de los estados JI no permitieron la
observación de algunas estructuras, por lo tanto no se cuenta con estos datos .

Estado L (µ) W (µ) T (µ) Wt(µ) Pe (µ) Ph (µ) A (µ) B (µ) C (µ) Volumen (µ)
JI 546.29 25.86 44.19 16.45 24.00 109.23 21.36 5.02 12.49 217410.65
J4 684.04 35.19 57.31 20.03 28.45 125.23 19.88 5.46 12.00 591757.28
J1 158.84 11.65 12.96 13.82 12988.22
J2 253.58 13.77 20.96 7.82 10.80 45.06 18.65 5.65 12.20 29673.98
J3 516.45 27.12 44.29 16.22 23.98 105.82 19.29 4.91 11.75 225733.99

7.2.1.2. Capacidad de carga y Relación de sexos: En la primera generación se observaron

424 hembras junto con 198 machos, y en la segunda generación, 612 hembras y 252 machos.
Se evidencian hembras gigantes para las dos generaciones, pero más evidente en la primera,
que es hasta un 65% más grande que la hembra de segunda generación (Tabla 2 y 4 y Gráfica
5 y 6). La proporción de hembras es superior en las dos generaciones, aproximadamente 3:1.
Las dos generaciones de adultos, aparentemente no se traslapan, siendo más abundantes en la
primera que en la segunda. En promedio se evidencia 125 huevos por hembra de primera
generación, para hembras de segunda generación disminuye drásticamente a un promedio de
35 huevos por hembra. Es probable que la condición de hembra matricida, en la segunda
generación, además de su biomasa (tabla 4), sea la causa de tan alta disminución en progenie
(Triviño et al., 2006).

Tabla 4. Promedio variación morfométrica de adultos presentes en el ciclo de vida de

Steinernema sp. CIAT25, en G. mellonella. MG1: macho primera generación; HG1: hembra
primera generación; MG2: macho segunda generación; HG2: hembra segunda generación. L:
longitud total; W: ancho máximo corporal; Ph: distancia cabeza base de esófago; T: longitud
de la cola; Wc: Ancho de la cola; Pe: distancia cabeza-poro excretor; Le: longitud espícula;
Índices a:L/W; b:L/Ph; c:L/T; d:Pe/Ph; e: Pe/T; f: L/Le. Estas dos últimas variables son
exclusivas para especímenes machos, ya que las hembras carecen de espicula.
Estado L (µ) W (µ) T (µ) Wt (µ) Pe (µ) Ph (µ) a (µ) B (µ) C (µ) Le (µ) f (µ) Volumen (µ)
MG1 1088.10 92.64 44.75 29.93 43.66 383.45 11.91 4.58 25.75 105.15 11.90 5559456.63
HG1 2472.84 199.62 108.37 102.72 143.31 431.73 25.91 5.95 28.45 71800349.26
MG2 927.30 50.77 33.22 28.83 39.26 459.69 21.17 2.02 27.91 58.79 15.77 1509014.37
HG2 1492.86 119.32 55.22 47.91 64.02 208.74 12.60 7.28 27.49 12659658.67
Gráfica 4: Promedio variación Gráfica 5: Promedio variación morfométrica
morfométrica en volumen, de estados de en volumen, de estados de Machos (rojo) y
desarrollo JI (rojo) y J4 (azul) de Hembras (azul) primera generacion de
Steinernema sp. CIAT25, postparasitismo de Steinernema sp. CIAT25, postparasitismo en
G. mellonella. G. mellonella.

Gráfica 6: Promedio variación Gráfica 7: Promedio variación morfométrica

morfométrica en volumen, de estados de en volumen, de JI (rojo) inoculados y Dauer
Machos (rojo) y Hembras (azul) segunda larva (azul) emergidos en larvas G.
generación de Steinernema sp. CIAT25, mellonella.
postparasitismo en larvas G. mellonella.

7.1.2. Tasa de emergencia y Dauer Larva: es claro que el ciclo de vida de los nematodos
enomopatógenos se considera exitoso, en cuanto se logre un Dauer de mínimas diferencias en
comportamiento y estado físico con respecto al JI que ingresó al inicio del ciclo (Campbell y
Gaugler, 1993; Corredor et al., 2006). Los Dauer que emergieron de los cadáveres de G.
mellonella, no presentan diferencias respecto al volumen morfométrico del JI usado para
parasitar (tabla 5 y grafica 7).

Igualmente el promedio de Dauer cosechados por larva es de 305 (tabla 6) denotando la

buena capacidad reproductiva de este nematodo, al tiempo de su alta capacidad parasítica en
ulteriores procesos de infección.

Tabla 5. Promedio variación morfométrica de juveniles (J) presentes en el ciclo de vida de

Steinernema sp. CIAT25, en G. mellonella. L: longitud total; W: ancho máximo corporal;
Ph: distancia cabeza base de esófago; T: longitud de la cola; Wc: Ancho de la cola; Pe:
distancia cabeza-poro excretor. Índices a: L/W; b:L/Ph; c:L/T; d:Pe/Ph; e: Pe/T.
Estado L (µ) W (µ) T (µ) Wt (µ) Pe (µ) Ph (µ) A (µ) B (µ) C (µ) Volumen (µ)
JI 546.29 25.86 44.19 16.45 24.00 109.23 21.36 5.02 12.49 217410.65
Dauer 536.99 28.17 43.83 16.06 22.25 105.12 19.23 5.11 12.33 253883.11

7.3. Bacteria simbionte:

7.3.1 Fenómeno de disociación de fases in vitro:

FASE1: La Fase I de la bacteria simbionte se observó durante las primeras 24 horas en medio
NBTA en donde las colonias presentaron una coloración azul oscuro opaco, bordes
irregulares y forma circular convexa. Lo que es característico de la fase uno de la bacteria
endosimbionte. También se presentó un halo traslúcido alrededor de cada colonia, causado
por la absorción del azul de bromotimol presente en el medio, que es indicador de la bacteria
en fase I según los criterios de Boemare y Akhurst (1996) y Boemare et al. (1993). La
coloración de Gram evidenció Bacilos gram negativos no muy alargados.
FASE 2: Luego de 48 horas de la siembra el aislamiento se caracterizó por colonias redondas,
con bordes irregulares y un poco más grandes que en la fase I. Las colonias tomaron un color
rojo brillante, debido a la tintura con el cloruro de trifeniltetrazolio anteriormente degradado
por la fase I. Esta coloración indica la presencia de la Fase secundaria. Bajo el microscopio se
apreciaron bacilos Gram negativos más alargados que en fase I.
Durante las 48 horas de la siembra, cuando la mayoría de las colonias se encontraban en fase
II se observaron colonias aún en fase I que tomaron más tiempo en virar a fase II. Esto se
debió probablemente a que la bacteria tenga una fase se crecimiento exponencial no infectiva
más larga, que en el caso práctico indicaría un trabajo continuo y sostenido de infección
contra el hospedero, como puede ser evidenciado en el porcentaje de mortalidad tardío de
100%.
7.3.2 Tipificación de la bacteria endosimbionte: Siguiendo la metodología proporcionada
por el Kit. BBL Crystal® y trascurridas 24 horas exactas de la inoculación se leyó el
resultado, el cual fue ingresado al software de identificación Crystal®. La bacteria
endosimbionte asociada al nematodo Steinernema sp. cepa CIAT 25 fue identificada como
Xenorhabdus nematophila. Esta bacteria se ha reportado en asociación a S.carpocapsae y sus
metabolitos secundarios están siendo usados en el control biológico de insectos y en la
protección de plantas y animales por medio de la transformación génica de la toxina (Nigel et
al., 2005). A pesar de que la bacteria es reportada en asociación a S.carpocapsae, no significa
que el nematodo Steinernema sp. cepa CIAT25 pertenezca a esta especie, puesto que para su
reconocimiento es necesario una identificación taxonómica y a nivel molecular.
8. Conclusiones:

Comportamiento parasítico:

Según la baja tasa de penetración, el tiempo prolongado de muerte y la preferencia de

penetración por el estoma o la boca, el nematodo Steinernema sp. cepa CIAT25 podría
presentar comportamiento de tipo emboscador, para especies de alta movilidad y dispersión,
esta dos últimas debido a la alta tasa de morbilidad y reproducción del nematodo.

La especie Steinernema sp. CIAT25 podrá tener un potencial sobre plagas abundantes en
suelo, que presenten tendencia a ser muy sésiles y no crípticas, debido a que son lentas en
ingreso y muerte, pero muy efectivas frente a la mortlidad del hospedero.

Ciclo de vida:

El ciclo de vida presentado por el nematodo Steinernema sp. CIAT25 en condiciones

controladas tuvo una duración aproximada de 500 horas, en donde el JI ingresa al hospedero
y trascurren dos generaciones anfimícticas, antes de la formacion del Dauer larva. El ciclo
estuvo caracterizado por cópulas precoces, solapamiento de poblaciones, traslapes de estado
y hembras matricidas en segunda generación.

La relación de sexos fue de 3:1 hembra:macho, respectivamente. Tambien hay una diferencia
marcada de tamaño, siendo la hembra mucho más grande que el macho, sobre todo en
hembras de primera generación.

El ciclo de vida para los nematodo Steinernema sp. CIAT25 dentro de G. mellonella se
consideró exitoso, por las mínimas variaciones de comportamiento, estado físico y volumen,
respecto al Dauer larva emergente y el JI de ingreso.

Diagnosis morfológica y morfométrica:

Cada estado de desarrollo presentó características únicas de volumen y estructuras
diferenciales, que permitieron su identificación. A su vez esta variación permitió evidenciar
el comportamiento poblacional y desarrollo del nematodo dentro del hospedero.

Durante todo el ciclo se presentan traslapes de estados, posiblemente por la entrada tardía de
JI, por la diferencia en tiempos de copula o por la variación medio ambiental. Esta ultima
también determino en gran medida la variación de biomasa entre cada generación.

Bateria Simbionte:
La bacteria endosimbionte fue tipificada como Xenorhabdus nematophila, comúnmente
asociada a nematodos S. carpocapsae, lo que brinda una base para una posterior
identificación taxonómica y molecular del nematodo Steinernema sp. CIAT25.
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