Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254

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Biomasa y Bioenergía

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Trabajo de investigación

Evaluación de la Kappaphycus alvarezii crecimiento bajo diffdiferentes condiciones

ambientales y effieficiencia de la hidrólisis enzimática del residuo generado en el
procesamiento de carragenina
Eddyn Gabriel Solórzano-Cháveza, Fernando Roberto Paz-Cedeñoa, Levi Ezequiel de OliveiraB,
Valéria Cress GelliC, Rubens MontiD, Samuel Conceição de Oliveiraa, Fernando Masarina,∗
a Universidad Estatal de Sao Paulo (UNESP), Facultad de Ciencias Farmacéuticas (FCF), Departamento de Bioprocesos y Biotecnología, Araraquara, SP, 14800-903, Brasil
B Universidad de Sao Paulo (USP), Escuela de Ingeniería Lorena (EEL), Departamento de Ingeniería Química, Lorena, SP, Brasil
C Instituto de Pesca (IP), Centro de Investigación y Desarrollo de la Costa Norte, Secretaría de Agricultura y Abastecimiento del Estado de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil
D Universidad Estatal de Sao Paulo (UNESP), Facultad de Ciencias Farmacéuticas (FCF), Departamento de Alimentación y Nutrición, Araraquara, SP, 14800-903, Brasil

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Kappaphycus alvarezii es una macroalga roja generalmente utilizada para la producción industrial de hidrocoloides. Una
Kappaphycus alvarezii alternativa es utilizar elK. alvarezii para la producción de carragenina y sus residuos para la fabricación de bioproductos de
Culturas interés comercial (biocombustibles, alimentos, cosméticos, nutracéuticos, farmacéuticos y biofertilizantes). Este estudio
Productividad
informó el cultivo deK. alvarezii cepas en diffdiferentes condiciones ambientales durante un período de un año. La
Composición química
productividad, la tasa de crecimiento y el rendimiento de refiSe evaluó el carragenano ned (RC) y los residuos (RE) de los
RefiResiduo de
cultivos estudiados. Además, la effiSe evaluó la eficiencia de la hidrólisis enzimática del RE obtenido en el procesamiento de
carragenano ned
Hidrólisis encimática carragenina. Considerando las variaciones de productividad durante diffdiferentes estaciones climáticas, tres diferentesff
grupos diferenciados (A, B y C) fueronfined para cada cepa estudiada. Las tasas de productividad y crecimiento fueron más
pronunciadas en las temporadas de verano-otoño (grupo B). La productividad media de la biomasa no tratada de diff
diferentes cepas de K. alvarezii fue de 31,6 kg.m-2año-1. El rendimiento medio de RC y RE de diffdiferentes cepas de K. alvarezii
fueron 14,4 y 7,4 kg.m-2año-1, respectivamente. Los CR mostraron un enriquecimiento en galactano, al igual que el
carragenano de calidad comercial. Los RE mostraron un enriquecimiento en glucanos, con contenido promedio (A, B y C) de
31,5%, 34,3% y 32,6%, respectivamente. La hidrólisis enzimática de la fracción de glucano del RE, resultó en una conversión
del 100% e indicó que la tasa de formación de glucosa a partir del glucano no depende de los cultivos o cepas estudiadas. Por
tanto, estos resultados muestran que la glucosa procedente de RE se puede obtener durante todo el año, alcanzando una
productividad media de 2,7 kg.m-2año-1.

1. Introducción
Las macroalgas marinas son plantas acuáticas que se pueden cultivar en
grandes cantidades en muchos países, incluido Brasil. Puede ser clasified en tres
grupos principales: macroalgas marrones (Phaeophyceae), macroalgas verdes
(Chlorophyceae) y macroalgas rojas (Rhodophyceae) [1,2]. Muchas especies de
macroalgas rojas tienen un alto contenido de carbohidratos, por lo que su uso es
una alternativa prometedora para la fabricación de bioproductos de interés
comercial (hidrocoloides, biocombustibles, alimentos, cosméticos, nutracéuticos,
farmacéuticos y biofertilizantes) [2-6]. Las macroalgas rojas también tienen
beneficios ambientalesfits al promover la absorción de dióxido de carbono a
través de la fotosíntesis [2,7,8]. Además, las macroalgas
los cultivos tienen una productividad media de 22 kg.m-2año-1, mientras que las
plantas terrestres tienen una productividad de 0,5-4,4 kg.m-2año-1 [2,9,10].
La composición química de las macroalgas rojas varía entre especies, pero
generalmente incluye galactanos, glucanos, grupos sulfato, proteínas y
minerales. Los galactanos son polímeros de unidades fundamentales de
galactosa y 3,6-anodrogalactosa, que tienen grupos sulfato conectados a lo largo
de su cadena. El patrón de sustitución de los grupos sulfato y la cantidad de
3,6-anhidrogalactosa varían entre diffdiferentes clases de estos compuestos [11]. Los
glucanos son polímeros compuestos por unidades de glucosa que también pueden estar
sustituidas con grupos sulfato [2,10-13].
La pared celular de las macroalgas rojas está compuesta por polisacáridos
estructurales de cadena larga. Los principales son el glucano y dos tipos de

∗ Autor correspondiente.
Correos electrónicos: eddynsch04@hotmail.com (EG Solórzano-Chávez), fernando.paz@unesp.br (FR Paz-Cedeño),
levi_ezequiel@yahoo.com.br (L. Ezequiel de Oliveira), valeriagelli@pesca.sp.gov.br (VC Gelli), rubens.monti@unesp.br (R. Monti),
samuel.oliveira@unesp.br (S. Conceição de Oliveira), fernando.masarin@unesp.br (F. Masarin).

https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.105254
Recibido el 18 de julio de 2018; Recibido en forma revisada el 22 de mayo de 2019; Aceptado el 5 de junio de 2019
0961-9534 / © 2019 Publicado por Elsevier Ltd.
EG Solorzano-Chavez, et al.
polisacáridos valorados por su capacidad de formación de gel, es decir, agar y
carragenina [2,11-14]. El carragenano puede clasificarsefied como lambdaλ),
kappaκ) o iota (i) según su capacidad de formación de gel y grado de sustitución
de los grupos sulfato. Se utiliza principalmente para espesar alimentos como
yogur, helado y pudín [2,14-dieciséis].
La K. alvarezii especie pertenece a la clase de macroalgas rojas. Las culturas de
K. alvarezii se cultivan comúnmente por el método denominado palangre
(conocido como "corbata") que comenzó en 1992 en Indonesia [dieciséis-18]. Este
método consiste enfiuniendo las macroalgas marinas en líneas (longitudes de 10-
50m) que se colocan en paralelo, con un espaciamiento variable entre ellos, en
función del tamaño de los brotes vegetativos de la especie a desarrollar. La
profundidad de los brotes vegetativos puede variar de 0,3 a 1 m. Este método se
ha utilizado en varios países como Brasil, Filipinas, Kenia, Indonesia, India,
Madagascar, Malasia, Tanzania y Vietnam [dieciséis-18]. Los parámetros
ambientales como la temperatura, la salinidad y la transparencia del agua son
muy importantes para las macroalgas rojas.K. alvarezii, a medida que crece en diff
diferentes temperaturas y salinidades (20-35 ° C y 23-38 mgL-1, respectivamente).
Así, una característica fundamental de las macroalgasK. alvarezii es su capacidad
para crecer en aguas turbias y poco profundas con diffdiferentes temperaturas y
salinidades [17,19-22].
El cultivo de K. alvarezii fue evaluada como una actividad económica
importante en más de 10 países, contribuyendo aproximadamente con el 6% de la
producción total de plantas acuáticas [23]. En 2017, Brasil produjo 700 toneladas
deK. alvarezii [23], pero esta producción no fue suficiente para satisfacer la
demanda económica nacional [2,19]. K. alvarezii se utiliza ampliamente para la
producción de hidrocoloides de carragenina. La carragenina representó un
mercado mundial anual de más de 762 millones de dólares estadounidenses en
2016 [24]. Brasil produce pequeñas cantidades de carragenina, aproximadamente
10 t por año, a partir de bancos naturales deHipnea musciformeWulfen)
Lamouroux [2,25].
Allífiprocesamiento de ned carragenano de K. alvarezii generó la formación
de un residuo (RE) rico en glucano. Este RE puede hidrolizarse con enzimas dando
lugar a la formación de glucosa, que puede utilizarse para la fabricación de
bioproductos de interés comercial (un ejemplo sería la producción de bioetanol
combustible) [19,26]. En este contexto, el objetivo de este estudio fue evaluar el
cultivo deK. alvarezii
culturas en different condiciones climáticas, la producción effieficiencia de refined
carragenina (RC) y residuo (RE) (obtenido después del procesamiento de
carragenina) y la hidrólisis enzimática de la RE obtenida con celulasas comerciales.
2. Métodos
2.1. Cultivo y preparación de biomasa de K. alvarezii
Cuatro diffdiferentes cepas de macroalgas K. alvarezii (marrón, rojo, verde y
G11). Las cepas fueron cultivadas en el Océano Atlántico en la playa de Itaguá
experimentalficampo, Ubatuba, SP, Brasil (23 ° 27′5.8″S; 45 ° 02′49,3″W). La
estructura utilizada para el cultivo de cepas de macroalgas consistió en una balsa
anclada en la bahía (palangre o"corbata")
[11,13]. Previamente se pesaron diez brotes de crecimiento vegetativo de cada
cepa estudiada, cada uno con aproximadamente 70 g (base húmeda), y se
unieron en un hilo de nailon en un módulo secundario sobre la superficie del
agua de mar, lo que proporcionó una densidad de 6,7 plantas por m.2 del fondo
marino. Cada cultivo de las cepas estudiadas se realizó durante
aproximadamente 30 días (cultivos cada mes durante un período de un año).
Después de la cosecha, se unió un nuevo brote en el hilo de nailon y comenzó un
nuevo ciclo. Las macroalgas se pesaron en húmedo y la masa seca de las cepas se
determinó con una humedad promedio del 35% (valor de referencia comercial) [
11,13]. Los experimentos se realizaron por triplicado. La tasa de crecimiento y la
productividad de las culturas de la diffLas diferentes deformaciones se calcularon
a partir de las ecuaciones (1) y (2), respectivamente. Ecuación(1) ha sido
ampliamente utilizado en estudios cinéticos del crecimiento de algas [27] y se
basa en la ley de crecimiento geométrico, según la cual la población de algas
aumenta al mismo ritmo durante cada unidad
2
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de tiempo. Si esta tasa constante de crecimiento está representada porr y la inicial
la población está representada por W0, luego después de un tiempo t la fipoblación final
es dado por Wt =W0 (1 + r)t, expresión que después de la manipulación algebraica
da como resultado la ecuación (1). Los cálculos se realizaron en un húmedo
base de peso porque este procedimiento es una práctica común ya que el factor
aplicado para la conversión en peso seco asume un mismo valor para
ambas cosas Wt y W0, así que no es unffEctando el valor de Wt /W0 relación cuando
se calcula en base seca.
Dado que la velocidad de crecimiento no se calcula a partir de la aritmética
ley de crecimiento, es decir, Wt =W0 (1 + rt), tasa de crecimiento y productividad,
como sefined, no los multiplique entre sí y debe
calcularse por separado para una interpretación más completa de los datos
experimentales. Laβ factor en la ecuación (2) tener en cuenta la conversión de
peso húmedo en peso seco, proporcionando un cálculo realista de
productividad.
1 /t
⎤
r = ⎡⎛W
⎢ t⎞
⎟ - 1⎥× 100%
⎜
⎣⎝W0 ⎠ ⎦ (1)
⎡ (Peso -tW0) × β ⎤
P=⎢ ⎥
⎢ A ⎥
⎣ ⎦ (2)
dónde: r =tasa de crecimiento (% día-1), Wt =fimasa húmeda final (g), W0 = masa
húmeda inicial (g), t =tiempo de cultivo (días) y P =productividad
(gm-2día-1), β =masa seca total (g) / masa húmeda total (g), A =área de cultivo de
cada brote (m2), respectivamente. Los datos de productividad y tasa de
crecimiento se evaluaron mediante la prueba de Tukey (GraphPad Instat v3.10)
con una signifinivel de cáncer de 0,05.
2.2. Pretratamiento del material con hidróxido de potasio (KOH)
Para el pretratamiento, las muestras de cultivo correspondientes a tres specifi
Se seleccionaron c marcos de tiempo, A, B y C. Grupo A: septiembre-Diciembre
2013; Grupo B: enero-Marzo del 2014; Grupo C: abril-Junio de 2014. Las biomasas
se lavaron con agua destilada, mientras se agitaba, durante 45 min en una
proporción de 35 g (peso seco) de biomasa de macroalgas por 1 L de agua
destilada. Después del lavado, la solución se filtró usando un tamiz con un tamiz
de 2 mm. Las muestras se secaron nuevamente a 25 ° C. Estos materiales se
denominan en lo sucesivo'biomasa sin tratar ». Para el pretratamiento de la diff
diferentes grupos y cepas de K. alvarezii, Se utilizaron aproximadamente 30 g
(peso seco) de biomasa sin tratar, colocados en un vaso de precipitados de
polipropileno de 4 L que contenía 1500 ml de solución de KOH al 6% (p / v)
durante 24 ha 25 ° C. Posteriormente, la solución alcalina se filtró usando un
tamiz con una pantalla de 2 mm, luego se expuso a la luz del sol durante un día
para blanquear. Después del blanqueo, se lavó con agua destilada en una
proporción de 35 g (peso seco) de biomasa de macroalgas por 1 L de agua
destilada durante 10min (se repitió el proceso 2 veces y posteriormente se secó la
biomasa a 60 ° C). Los experimentos se realizaron por triplicado. Esta biomasa se
denominó macroalgas pretratadas en solución alcalina fría (MPC) [11,13,14,19,28].
Los rendimientos del pretratamiento con KOH del diffSe calcularon diferentes
cepas y cultivos.
culado de acuerdo con la ecuación (3).
WF× 100%
R=
WI (3)
dónde: R =rendimiento en masa de material pretratado con KOH (%),
Wyo = masa seca inicial (muestra sin tratar) (g), Wf =fimasa seca final (muestra
postratamiento con KOH) (g). Se evaluaron los datos de rendimiento
utilizando la prueba de Tukey (GraphPad Instat v3.10) con un significadoficance nivel de
0,05.
2.3. Extracción de refined carragenina (RC) y obtención del residuo (RE)
Aproximadamente 5 g (peso seco) de MPC de biomasa fueron molidos en un
EG Solorzano-Chavez, et al.
molino de cuchillas (Micro molino tipo Willye TE-648, TECNAL, 0,84 mm), luego
agregado a un Erlenmeyer flpreguntar y remojar en 400 ml de agua destilada.
Posteriormente elflLas preguntas se colocaron en una incubadora con agitador
(GyromaxTM 737R, Amerex Instruments) a 65 ° C y 120 rpm durante 2 h. La
solucion fuefiSe filtró a través de un tejido de nailon y el extracto se secó a 40ºC.
Esta biomasa se denominó como refined carragenano (RC) [11,13,14,19,28]. La
fracción insoluble retenida en elfiEl filtro se lavó con agua destilada y se secó a 40
° C y se denominó residuo (RE). Los experimentos se realizaron por triplicado. El
RC y el RE se pesaron y luego se molieron en un molino de cuchillas (Micro molino
tipo Willye TE-648, TECNAL, 0,84 mm). Los rendimientos de RC y RE se calcularon
de manera similar a los rendimientos de materiales pretratados con KOH (ítem
2.2, Ecuación(3)), pero sobre la base de biomasa de algas no tratada y pretratada
con KOH (peso seco). Dónde:R =rendimiento de masa de residuo o
refined carragenano (%),Wyo =masa seca inicial (sin tratar o pretratada
con KOH) (g), Wf =fimasa seca nal (residuo o refined carragenano)
(gramo).
Los datos de rendimiento se evaluaron mediante la prueba de Tukey (GraphPad
Instat v3.10) con una signifinivel de cáncer de 0,05.
2.4. Composición química de las fracciones de K. alvarezii
Contenido de lípidos: Se extrajeron aproximadamente 0,5 g (peso seco) de
muestras sin tratar con hexano durante 6 h en un extractor Soxhlet [11,13,14,
dieciséis,29].
Contenido de cenizas: El contenido de cenizas se determinó según la norma
NREL [30]. Para ello, se pesó aproximadamente 1 g (peso seco) de muestra, se
colocó en crisol de porcelana y se oxidó en un mufflEl horno a 575 ± 25 ° C,
utilizando una rampa de calentamiento preestablecida. Al final de las 3 h, los
crisoles se enfriaron y se pesaron.
Contenido de proteínas: El contenido de proteína se determinó según la
metodología de Lowry, modified por Hartree [31]. Para ello, se pesaron
aproximadamente 0,05 g (peso seco) de cada muestra en tubos de ensayo que se
pretrataron con 20 ml de NaOH 1 M a 80 ° C durante 4 h [11,13]. La solución
obtenida se analizó para determinar la concentración de proteínas.
Contenido de grupos de sulfato: El contenido de grupos sulfato fue cuantified
mediante técnica espectrofotométrica [11,13,14,dieciséis,26]. Se pesaron
aproximadamente 0,05 g (peso seco) de muestra previamente molida y se
añadieron a tubos de ensayo. Se añadió 1 ml de HCl 0,5 M a cada tubo, que se
esterilizó en autoclave a 120 ° C durante 1 h. Al final de la reacción, el volumen se
completó hasta 10 ml, seguido de centrifugación a 7000 ×gramo durante 10min.
Luego, se colocaron 2 ml del sobrenadante, 18 ml de agua destilada y 2 ml de HCl
0,5 N en un tubo de ensayo y se agitaron. A continuación, 1 ml
de BaCl2 Se añadió reactivo de gelatina (Difco-Laboratories, Detroit, EUA). Los
tubos se mantuvieron a 25 ° C durante 30 min. Al final, los tubos
se homogeneizaron y las lecturas del espectrofotómetro se tomaron a 550 nm
(Ultrospc 3100 Pro, Amersham / Biosciences).
Contenido de carbohidratos y ácidos orgánicos: Para la determinación del
contenido de carbohidratos poliméricos y ácidos orgánicos se utilizó la
metodología de hidrólisis ácida [11,13,14,dieciséis,32,33]. Se trataron porciones
de aproximadamente 300 mg (peso seco) de las muestras con 3 ml de 72% (p / p)
en tubos de ensayo durante 1 ha 30ºC. A continuación, el contenido se transfirió a
Erlenmeyer de 250 ml.flpregunta con la ayuda de 79 ml de agua destilada. La
mezcla se esterilizó en autoclave durante 1 ha 121 ° C, se enfrió y se
fifiltrado sobre vidrio sinterizado filtros de porosidad número 3 (Schott,
Alemania). Posteriormente, el material retenido se secó a 105 ° C durante 2 h, se
enfrió en un desecador a 25 ° C y se pesó. El material retenido en elfiLos ltros
correspondieron a los aromáticos insolubles. Para la detección de azúcares
monoméricos, una pequeña alícuota delfiEl filtrado se inyectó en un sistema de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El análisis cromatográfico se
realizó con una columna BIORAD AMINEX HPX-87H, utilizando ácido sulfúrico
0,005 M como eluyente aflflujo de
0,6 ml min-1 a 60 ° C. La detección se realizó mediante índice de refracción a 60 ° C
(Shimadzu, modelo C-R7A), con el fin de detectar glucosa, galactosa, ácido
fórmico y ácido levulínico.
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Contenido de hidroximetilfurfural (HMF): El contenido de HMF se determinó
en el filtrado obtenido tras la hidrólisis ácida de las muestras en estudio. Para la
detección de HMF se utilizó una pequeña alícuota
inyectado en un HPLC, con una C18 columna de 250 mm de largo y 4 mm de
diámetro exterior (Hypersil; Thermo-Scientific) usar como eluyente acet-
onitrilo: agua (1: 8) con 1% (v / v) de ácido acético a flflujo de
0,8 ml min-1 a 25 ° C. Se detectó HMF a 276 nm usando un UV-Detector visible a 25
° C. Todos los experimentos del punto 2.4 se realizaron por triplicado. Los
porcentajes de masa de las fracciones de glucano y galactano se calcularon de
acuerdo con las ecuaciones(4) y (5), respectivamente [11,13,14,dieciséis]. El factor
de corrección para HMF (Ecuación(4)) se calculó a partir de la estequiometría de la
reacción. Considerando que una molécula de glucosa genera una molécula de
HMF, el factor de corrección se calculó a partir de la relación entre la masa
molecular de glucosa
y HMF [34].
= [(glucosa + (HMF × 1.429)) × 0,9] × 100%
WI
(4)
dónde: G =porcentaje de masa de glucano (%), glucosa =masa de glucosa (g),
HMF =masa de hidroximetilfurfural (g), Wyo = muestra de masa seca inicial (g).
Según la literatura, en una hidrólisis química con ácido sulfúrico, 3,6-anhidro-
L-la galactosa (AHG) se degrada rápidamente en HMF y luego en ácido levulínico y
fórmico [14,35-37]. Por este motivo, se consideró que los ácidos fórmico y
levulínico se producían a partir de (AHG). Al observar la estequiometría de la
reacción, se puede suponer que una molécula de AHG genera una molécula de
ácido levulínico y una molécula de ácido fórmico. Por tanto, la suma de las
concentraciones de fórmico
y ácido levulínico después de la hidrólisis ácida se consideró como estafa-
concentración de AHG (Ecuación (5)).
al = [(galactosa × 0,9) + (AF) + (AL)] × 100%
WI (5)
dónde: Gal =porcentaje de masa de galactano (%), galactosa =masa de galactosa
(g), AF =masa de ácido fórmico (g), AL =masa de ácido levulínico (g),
Wyo = muestra de masa seca inicial (g), respectivamente.
2.5. Determinación de la actividad enzimática de celulasas totales.
La actividad celulasa se determinó según la metodología descrita por Ghose [
38]. La reacción enzimática se llevó a cabo en tubos de ensayo de 30 ml que
contenían 1 ml de acetato de sodio 50 mM buffer pH
4.8, una tira de fipapel de ltro de 1 cm × 6 cm, aproximadamente 50 mg y
0,5 ml de extracto de enzima. Los tubos de ensayo se calentaron en un baño de
agua a 50 ° C durante 60 min. Luego, 3 ml de 3-Se añadió ácido 5 dinitrosalicílico
(DNS) y la mezcla se hirvió durante 5 min [39]. Se añadieron 20 ml de agua
destilada a cada tubo y la mezcla se homogeneizó invirtiendo completamente los
tubos varias veces. La lectura de absorbancia se realizó en un espectrofotómetro
(Ultrospc 3100 Pro, Amersham / Biosciences) a 540 nm. Los controles se
realizaron agregando el reactivo DNS antes del extracto enzimático. Para el
blanco, se utilizó agua destilada en lugar de la muestra. Los experimentos se
realizaron por triplicado.
2.6. Hidrólisis enzimática de los residuos (RE)
La hidrólisis enzimática se realizó con extracto comercial que contenía
actividad celulasas (Cellic CTec II, Novozymes, Dinamarca). Para ello se utilizó una
carga enzimática de 10 FPU por gramo de muestra (peso seco), que correspondió
a 200 UI deβ-glicosidasas. Cada experimento de hidrólisis se realizó en tubos
Falcon de 50 ml que contenían 100 mg de muestra previamente molida (peso
seco) y 5 ml de acetato de sodio 50 mM buffer (pH 4,8). Los tubos se incubaron a
45 ° C con agitación rotatoria de 120 rpm. Durante el sacchari enzimáticofiproceso
catiónico las reacciones se controlaron a intervalos de 4-72 h [11,13]. Para la
determinación y cuantificatión de azúcares resultantes de
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hidrólisis enzimática, el sobrenadante fue previamente diluido y analizado por

HPLC (ítem 2.4, carbohidratos y ácidos orgánicos). Los experimentos se realizaron
por triplicado. A partir de los datos de composición química, los factores de
hidrólisis enzimática (0,9, para glucosa) y lafivolumen final de la reacción (5 ml), se
utilizaron para calcular el porcentaje de conversión de glucano en glucosa
(Ecuación (6)) [11,13,14,dieciséis].

ς = [(Cg × Vf) × 0,9] × 100%

WI (6)

dónde: ς =conversión de glucano en glucosa (%), Cg =glucosa estafa-

centrado (gL-1), Vf =fivolumen final de solución que contiene glucosa

(0,005 L), Wyo =masa seca inicial correspondiente a la fracción de glucano
(gramo). Los datos experimentales de la hidrólisis enzimática fueronfitted por
un modelo matemático (Ecuación (7)) previamente validado para la cinética
enzimática en estudio [40,41]. Ecuación(7) se basa en la observación experimental
de que la concentración de glucosa crece exponencialmente
con el tiempo hasta alcanzar un valor estacionario máximo.

g = gmax (1 - - mi kt) (7)

dónde: g =concentración de glucosa (gL-1), gramomax =concentración máxima

asintótica de glucosa (gL-1), t =tiempo de hidrólisis (h), k =velocidad de reacción
constante (h-1). La estimación de los parámetros del modelo se realizó en el
software Origin (OriginPro 2017), obteniendo los parámetros cinéticos.
metros gramomax, k, y gramomax *k (tasa máxima de formación de glucosa) [40-43].
Como razonablefiprimera aproximación, la calidad de fit de lo no lineal
El modelo matemático se evaluó mediante coefficiente de determinaciónR2). Di
estadísticoffLas diferencias entre los valores estimados para la concentración
máxima de glucosa se evaluaron mediante la prueba de Tukey (GraphPad Instat
v3.10) con un significado significativo.finivel de cáncer de 0,05.
Figura 1. (a) Productividad profile y (b) profile de tasa de crecimiento de diffdiferentes
3. Resultados y discusión cepas de K. alvarezii en función de los cultivos mensuales. Cultivos de 4 cepas deK.
alvarezii. Datos de agosto de 2013 a julio de 2014. Los datos de productividad y tasa de
3.1. Evaluación de cultivos de diffdiferentes cepas de K. alvarezii crecimiento se evaluaron mediante la prueba de Tukey con una signifinivel de
cancelación de 0.05 (software GraphPad Instat, v3.10).

Las culturas de diffdiferentes cepas de K. alvarezii fueron evaluados

analizando la tasa de crecimiento y la productividad profiles en diffErent
estaciones climáticas durante un período de un año en Ubatuba-SP, Brasil.
Aunque es muy relevante para evaluar la effefectos de la temperatura, la
transparencia, la salinidad, la luz solar y sus interacciones sobre las variables
investigadas, el análisis aquí presentado ignora dicha interacción effects. Esto se
debe a que, en las condiciones y escala a la que se realizaron los cultivos (Océano
Atlántico), no fue posible controlar los factores a ciertos niveles apuntando, por
ejemplo, a la aplicación de un diseño factorial de experimentos para evaluar
individual e interacción effefectos entre factores sobre las variables de respuesta.
La temperatura, la transparencia y la salinidad se midieron diariamente y sus
valores medios seflect las condiciones de crecimiento promedio.
Las cepas evaluadas fueron: roja, marrón, verde y G11. Figura 1a-b muestra la
productividad y la tasa de crecimiento profile de las cuatro cepas en estudio
durante los meses de agosto de 2013 a julio de 2014. Los valores de productividad
oscilaron entre 39,4-144,0 gramos-2día-1
(cepa roja),
45,4-181,0 gramos-2día-1 (cepa marrón), 39,5-156,7 gramos-2día-1
(cepa verde) y 19,3-70,5 gramos-2día-1 (Cepa G11) (Figura 1a). Las cepas roja,
marrón y verde mostraron valores similares de productividad entre sí. Sin
embargo, estas cepas presentaron mayores valores de productividad que la cepa
G11 (Figura 1a). Los valores de la tasa de crecimiento variaron de 5.0 a 8.5% día-1 (
cepa roja), 5.3-9.0% día-1 (cepa marrón),
comparado con los grupos A y C. Esta mayor productividad y tasa de crecimiento
se obtuvieron en los períodos de las temporadas verano-otoño (Grupo B),
productividad intermedia y tasa de crecimiento en los períodos de primavera-
verano (Grupo A) y otoño- temporadas de invierno (Grupo C) (Figura 1ab). A pesar
de las variaciones encontradas a lo largo del año, los valores presentados de
productividad y tasa de crecimiento de las culturas de la diffdiferentes cepas de K.
alvarezii están al mismo nivel que otras culturas de la misma especie cultivadas
en Ubatuba-SP [11,13,19,28].
Fig. 2abc y 3abc presenta las correlaciones de la productividad y la tasa de
crecimiento en función de la temperatura, la transparencia y la salinidad (valores
medios mensuales) para la diffdiferentes cepas estudiadas. Los datos de
productividad y tasa de crecimiento en función de la temperatura se ajustaron
mediante un modelo matemático de tipo lineal, para todas las cepas estudiadas (
Higos. 2a-3a). Sin embargo, los datos de productividad y tasa de crecimiento en
función de la transparencia se ajustaron mediante un modelo matemático de los
tipos exponencial y lineal, respectivamente, para todas las cepas estudiadas (
Higos. 2b-3B). Sin embargo, los datos de productividad y tasa de crecimiento en
función de la salinidad no mostraron ningún tipo de correlación matemática (
Higos. 2c-3C).
Los ajustes de los modelos matemáticos para los datos de productividad y
tasa de crecimiento en función de la temperatura y la transparencia para cada
cepa individual en estudio fueron razonables, presentando un promedio R2

4.8-9.0% día-1 (cepa verde), y 3.3-6,6% día-1 (Cepa G11) (Figura 1B). Se informaron
valores similares en cultivosde K. alvarezii en Ubatuba -SP [18,28]. Las cepas
rojas, marrones y verdes mostraron valores similares de tasa de crecimiento. Sin
embargo, estas cepas mostraron valores más altos de tasa de crecimiento en
comparación con la cepa G11 (Figura 1B). En cuanto a la productividad y la tasa
de crecimiento profile de las cepas en estudio, se seleccionaron tres grupos, A, B
y C, de los cultivos producidos en diffdiferentes estaciones climáticasFigura 1ab,
ítem 2.2). Una productividad y una tasa de crecimiento notablemente más altas
de las cepas en el grupo B son
de 0,72 y 0,70 (productividad) y 0,76 y 0,70 (tasa de crecimiento), respectivamente (
Fig. 2ab y 3ab).
3.2. Procesamiento de carragenina de K. alvarezii para la obtención del residuo y
evaluación de su composición química
Para obtener RC y RE, se seleccionó la biomasa de las cepas marrón, roja y
verde de cada grupo estudiado. La selección de tres

4
EG Solorzano-Chavez, et al.
Figura 2. Productividad en función de la temperatura, transparencia y salinidad de los
cultivos mensuales de diffdiferentes cepas de K. alvarezii. (a) Productividad versus
temperatura, (b) Productividad versus transparencia y (c) Productividad versus salinidad.
Cultivos de cepas deK. alvarezii. Datos de cultivos de agosto de 2013 a julio de 2014.
Las cepas se realizaron con base en los valores de productividad y tasa de crecimiento,
que fueron mayores para las cepas marrón, verde y roja en comparación con la cepa G11
(Figura 1ab). Figura 5a y tabla 1 muestra los rendimientos después de la fiprimer paso de
procesamiento para obtener RC y RE, es decir, pretratamiento con KOH. Los
rendimientos en los materiales de macroalgas pretratados en solución alcalina fría (MPC)
fueron más pronunciados en los grupos A y C, excepto para la cepa marrón del grupo C
(73,3%, p / p) (Figura 5a y tabla 1). Las cepas marrón y roja mostraron los rendimientos
más bajos en el grupo B (Figura 5a y
tabla 1). Los datos presentados fueron similares a los reportados en la literatura y
mostraron valores característicos deK. alvarezii (marrón y rojo) en la misma
región de Ubatuba-SP [11,13].
Extracción con agua caliente (segunda etapa de procesamiento) usando MPC
5
Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254
Fig. 3. Tasa de crecimiento en función de la temperatura, transparencia y salinidad de los
cultivos mensuales de diffdiferentes cepas de K. alvarezii. (a) Tasa de crecimiento versus
temperatura, (b) Tasa de crecimiento versus transparencia, y (c) Tasa de crecimiento
versus salinidad. Cultivos de 4 cepas deK. alvarezii. Datos de cultivos de agosto de 2013 a
julio de 2014.
La biomasa generó dos fracciones más: la RE (fracción insoluble) y la RC (fracción
líquida). Los rendimientos del RE de los grupos A, B y C en relación a las muestras
MPC fueron 31,4%, 35,4% y 31,2% (cepa marrón, p / p), 28,8%, 26,7% y 33,1%
(cepa roja, p / p ), y 30,4, 26,5% y
34,9% (cepa verde, p / p), respectivamente (Figura 5by Tabla 2). Los rendimientos
de la RE con respecto a la muestra MPC no mostraron signifino puedo diff
diferencia entre las tres cepas y los grupos seleccionados. La excepción fue el
rendimiento de RE de la cepa roja del grupo B, que mostró un signifivalor
ligeramente más bajo (26,7%, p / p) en comparación con el rendimiento de RE de
la cepa verde del grupo C (34,9%, p / p) (Figura 5by
Tabla 2). Datos reportados en la literatura para cepas rojas y marrones deK. alvarezii
presentaron rendimientos de ER en relación con la biomasa de MPC del orden de
27,8%, siendo similares a los presentados en este trabajo [11,13,14].
EG Solorzano-Chavez, et al.
Figura 4. Diagrama de flujo y rendimientos de fracciones del procesamiento de carragenina de las tres cepas y grupos seleccionados de la K. alvarezii biomasa. Muestra pretratada con
KOH al 6% (MPC), residuo (RE) y refined carragenano (RC) en relación con la muestra sin tratar (material de partida). Contenido expresado en porcentaje (g / 100 g a partir
material) (base seca).
Los rendimientos de la RC en relación a la muestra de MPC en los grupos A, B
y C fueron 69.1%, 54.8% y 53.2% (cepa marrón, p / p), 63.1%,
62,9% y 59,5% (cepa roja, p / p) y 63,2%, 64,2% y 56,1% (cepa verde, p / p),
respectivamente (Figura 5c y Tabla 2). Los rendimientos de la RC en relación con
la muestra de MPC no mostraron un signifino puedo diffdiferencia entre las tres
cepas y los grupos seleccionados (Figura 5C). Las excepciones fueron las cepas
marrones de los grupos A y B (69,1% y 54,8%, p / p) respectivamente, que
mostraron un signifino puedo diffdiferencia entre sus valores de rendimiento de
la RC (Figura 5C). Datos reportados en la literatura para cepas rojas y marrones de
K. alvarezii presentó rendimientos de RC en relación con MPC del orden de
61,7%, siendo similares a los presentados en este trabajo [11,13].
También se calcularon los rendimientos de la ER y la RC en relación a la
biomasa no tratada (Figura 6ab). Los rendimientos de ER para los grupos A, B y C
en relación a la biomasa no tratada fueron 23.0%, 23.6% y 23.5% (marrón, p / p),
24.3%, 17.4% y 26.8% (rojo, p / p) y 24.3 %, 22,9% y 27,1% (verde, p / p),
respectivamente (Figura 6a). Los rendimientos de ER en relación con la biomasa
no tratada no mostraron signifino puedo diffdiferencias para las tres cepas y
grupos seleccionados, a excepción de la cepa roja del grupo B (17.4%, p / p) que
mostró una signifirendimiento significativamente menor en comparación con las
otras cepas y grupos estudiados (Figura 6a).
Los rendimientos de RC para los grupos A, B y C en relación con la biomasa
no tratada fueron 50,7%, 36,6 %% y 40% (marrón, p / p), 53,2%, 41,1% y 48,1%
(rojo, p / p) y 50,5%, 55,6% y 41,8% (verde, p / p), respectivamente (Figura 6a). Los
rendimientos de la RC en relación con la biomasa no tratada no mostraron signifi
no puedo diffdiferencias para las tres cepas y grupos seleccionados, a excepción
de las cepas marrones de los grupos B y C, además de la cepa roja del grupo B
(36,6%, 40% y 41,1%, p / p, respectivamente) que mostró signifirendimientos
significativamente más bajos en comparación con otras cepas y grupos
seleccionados (Figura 6B). De esta forma, las RC y RE que presentaron menores
rendimientos se refieren a las cepas pardas y rojas cultivadas durante los meses
de enero.-Marzo (Grupo B). Estos cultivos mostraron la mayor productividad y
tasa de crecimiento en comparación con los cultivos de los grupos A y C. A pesar
de las variaciones encontradas a lo largo del año, los rendimientos de RC en
relación con la biomasa no tratada de los cultivos de las tres cepas y grupos
seleccionados fueron similares a los reportados. en la literatura (rendimientos
entre 53 y 57%) [11,13,14].
Teniendo en cuenta la productividad de la diffdiferentes grupos y cepas de
Kappaphycus alvarezii (Figura 1) y el rendimiento global de las fracciones
obtenidas (Figura 4), se calculó la productividad anual de biomasa no tratada,
MPC, RE y RC de cada cepa y se mostró en Figura 7. La productividad anual de la
biomasa no tratada mostró valores que variaron entre
29,4 y 35,1 kg.m-2año-1, siendo que la cepa marrón presentaba una significaciónfi
valor significativamente mayor en comparación con las cepas verde y roja,
mientras que el MPC mostró valores de productividad anual que variaron entre
22,4 y 25,0 kg.m-2año-1, siendo que la cepa roja presentó un significadofivalor
ligeramente más bajo en comparación con las cepas verde y marrón (prueba de
Tukey). La productividad anual de ER mostró valores que
6
Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254
varió entre 8.2 y 6.6 kg.m-2año-1, sin embargo, las tres cepas no presentaron signifi
no puedo diffdiferencias en los valores de productividad (prueba de Tukey). La
productividad anual de RC mostró valores que variaron entre
13,4 y 15,2 kg.m-2año-1, siendo que la cepa roja presentó un significadofivalor
ligeramente más bajo en comparación con las cepas verde y marrón (prueba de
Tukey).
Los principales componentes encontrados en la biomasa en estudio fueron:
galactanos, glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y grupos sulfato [
11,13,14]. Los contenidos de galactanos, glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos
insolubles, grupos sulfato, lípidos y la suma de los componentes en las muestras
sin tratar se clasificaron según las cepas y grupos seleccionados, de la siguiente
manera: 26,9-33,1% (galactanos), 12,7-16,6% (glucanos), 14,4-17,1% (cenizas), 1,8-
5,6% (proteínas), 2,5-4% (aromáticos insolubles), 10,7-13,8% (grupos sulfato), 1,5-
8,6% (lípidos) y
77,7-89,7% (suma de componentes) (p / p) (tabla 1). Las cepas seleccionadas deK.
alvarezii referidas al grupo C mostraron los niveles más bajos de galactanos
(promedio de 27.6%, p / p), mientras que las cepas seleccionadas referidas a los
grupos A y B mostraron niveles más altos de galactanos (promedio de 31.5%, p /
p) (tabla 1). Sin embargo, las cepas seleccionadas deK. alvarezii referidas al grupo
A presentaron los niveles más altos de lípidos (promedio de 8.3%, p / p), mientras
que las cepas seleccionadas referidas a los grupos B y C presentaron niveles más
bajos de lípidos (promedio de 3.4%, p / p) (tabla 1). Además, las cepas deK.
alvarezii seleccionadas para el grupo C mostraron los niveles más bajos de
proteínas (promedio de 2.1%, p / p), mientras que las cepas seleccionadas para
los grupos B y C mostraron niveles de proteínas más altos (promedio de
4,4%, p / p) (tabla 1). El contenido de los otros componentes (glucanos, cenizas,
aromáticos insolubles y grupos sulfato) no mostró diámetros marcados.ff
diferencias entre cepas y grupos seleccionados, considerando las desviaciones
estándar, presentando niveles promedio de 13,8%, 14%, 3,2% y 5% (p / p),
respectivamente (tabla 1). La literatura reporta un contenido promedio de 66.5%
(p / p) de carbohidratos totales en diffdiferentes cepas de K. alvarezii de Indonesia
[29], mientras que el contenido promedio de carbohidratos totales de las cepas y
grupos seleccionados fue 53.2% (p / p), es decir, 20% menor (tabla 1). Además, los
autores también informaron un contenido de lípidos promedio para el diff
diferentes cepas de K. alvarezii del 0,7% (p / p) [29], mientras que el contenido
medio de lípidos de las cepas y grupos seleccionados fue del 5% (p / p), es decir,
un 86% más alto. Sin embargo, cabe señalar que el contenido de lípidos varió
mucho, debido a la differrantes condiciones climáticas de los cultivos mensuales (
tabla 1). Por lo tanto, es posible que el contenido de lípidos sea una fuente
importante de reserva energética para las especies.K. alvarezii y que el contenido
puede depender de las condiciones climáticas.
Estudios recientes realizados con cepas rojas y marrones de K. alvarezii
cultivados en Ubatuba -SP (misma región que los cultivos estudiados en este
trabajo) en los meses de mayo y junio de 2013, mostraron niveles promedio de
galactanos, glucanos, cenizas, aromáticos insolubles y grupos sulfato similares a
los reportados en este trabajo [11,13,14,dieciséis]. La excepción fue el contenido
de lípidos, que se reportó con un promedio de 0.6% (p / p), mientras que
EG Solorzano-Chavez, et al.
Figura 5. Rendimientos de fracciones del procesamiento de carragenina de las tres cepas
y grupos seleccionados de la K. alvarezii biomasa. (a) Muestra pretratada con KOH (MPC)
al 6% (p / v) en relación con la muestra sin tratar. (b) Residuos (ER) en relación con la
biomasa pretratada con KOH al 6% (MPC) (p / v). (c) Refined carragenina (RC) en relación
con la biomasa pretratada con KOH al 6% (MPC) (p / v). Contenido expresado en
porcentaje (g / 100 g de materia prima) (base seca). Todos los datos presentados son los
valores promedio seguidos de las desviaciones estándar de la muestra. * Valores
obtenidos solo con una muestra. Los valores con las mismas letras no difierenffer el uno
del otro con un signifinivel de cancelación de 0.05 (prueba de Tukey, software GraphPad
Instat, v3.10).
en el presente estudio se encontró un contenido promedio de 5.2% y 4.5% (p / p)
de lípidos para las cepas pardas y rojas cultivadas en los meses de abril, mayo y
junio, respectivamente.
tabla 1 muestra la composición química de las cepas y grupos seleccionados
de la K. alvarezii Muestras de MPC en relación a la fracción insoluble obtenida del
posprocesamiento de refined carragenano (RC). Los contenidos de galactanos,
glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles, grupos sulfato y la suma de
los componentes en las muestras de MPC se clasificaron de acuerdo con las cepas
y grupos seleccionados, de la siguiente manera:
16,7-27,7% (galactanos), 9,1-16,1% (glucanos), 15,1-19,4% (cenizas),
7
Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254
1.8-5,2% (proteínas), 1,8-3,9% (aromáticos insolubles), 11,1-18,4% (grupos sulfato)
y 59,0-82,7% (suma de componentes) (p / p) (tabla 1). Las cepas seleccionadas
para el grupo C presentaron los niveles más bajos de galactanos y glucanos
(promedio de 21,3% y 11,6%, p / p), respectivamente, mientras que las cepas
seleccionadas referentes a los grupos A y B alcanzaron niveles más altos de
galactanos y glucanos (promedio de 25,7% y 12,4%, p /
w), respectivamente (tabla 1). Sin embargo, las cepas seleccionadas referidas al
grupo C mostraron los niveles más bajos de proteínas (promedio de 2.1%, p / p),
mientras que las cepas seleccionadas referidas a los grupos B y A alcanzaron
niveles más altos de proteínas (promedio de 3.9%, p / p ) (tabla 1). Además, las
cepas seleccionadas referentes al grupo C presentaron los niveles más bajos de
grupos sulfato (promedio de 11.4%, p / p), mientras que las cepas seleccionadas
referidas a los grupos B y C alcanzaron niveles más altos de grupos sulfato
(promedio 16.9%, p / p). w) (tabla 1). Las cenizas y los aromáticos insolubles no
mostraron diffdiferencias entre cepas y grupos seleccionados, considerando las
desviaciones estándar, presentando en promedio contenidos de
16,9% y 2,9% (p / p), respectivamente (tabla 1). La literatura informa que las
muestras de MPC, de las cepas roja y marrón deK. alvarezii, mostraron contenidos
promedio de galactanos, glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y
grupos sulfato del orden de 34%, 13,8%, 21,6%, 0,4%,
2,7% y 10,5% (p / p), respectivamente [11,13], corroborando con los datos
presentados para las cepas y grupos seleccionados en este trabajo.
Se requiere un balance de masa para comparar el material de MPC
directamente con la biomasa no tratada. Los componentes que alcanzaron
mayores reducciones fueron: galactanos, glucanos, proteínas y lípidos (tabla 1 y
Cuadro S2). El contenido de lípidos no se detectó en materiales MPC (tabla 1 y
Cuadro S2). Las reducciones en el contenido de galactano, glucano y proteína en
las muestras de MPC de las cepas y grupos seleccionados se clasificaron de la
siguiente manera: 25.2-52,4%, 22,3-59,2% y 3,4-45,9% (p / p), respectivamente. El
contenido de glucano de las cepas y grupos seleccionados alcanzó una reducción
media del 22,5% (p / p). Sin embargo, la literatura reporta una reducción en la
fracción de glucano en las muestras de MPC, de las cepas roja y marrón deK.
alvarezii, del orden del 5,5% (p / p) [11,13]. Este diffLa diferencia se puede atribuir
al proceso de lavado del material postratamiento con KOH, porque puede enfl
influir en la disolución de la fracción de glucano en la biomasa de K. alvarezii [11,
13]. Los rendimientos en las etapas de pretratamiento con KOH de las cepas y
grupos seleccionados alcanzaron un valor promedio de 78,4% (p / p,Figura 5a,
tabla 1 y Cuadro S2). Sin embargo, la literatura reporta rendimientos de
postratamiento con KOH de cepas rojas y marrones deK. alvarezii, del orden del
89,4% (p / p) [11,13]. Así, el proceso de lavado con agua post-tratamiento con KOH
de las cepas y niveles seleccionados sugiere una mayor disolución de la fracción
de glucano.
Las muestras de los RE mostraron un diffcomposición química diferenciada
en comparación con las muestras no tratadas y MPC (Tabla 2). Los contenidos
promedio de galactanos, glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y
grupos sulfato de RE de cepas y grupos seleccionados fueron
12,4-21,2% (galactano), 29,6-36,7% (glucano), 11,5-13,7% (cenizas),
1,7-3,8% (proteínas), 1,6-4,3% (aromáticos insolubles), 5,5-8.2% (grupos sulfato) y
52.2-78,6% (suma de componentes) (p / p) (Tabla 2). Estos datos confirm el
enriquecimiento de la fracción de glucanos en las muestras de RE, corroborando
con la mayor solubilidad de los galactanos en agua en comparación con los
glucanos [11,13]. La literatura reporta un comportamiento similar con biomasa de
K. alvarezii, cepas rojas y marrones, sin embargo, presenta un enriquecimiento
más marcado de la fracción de glucano en los RE obtenidos [11,13,14].
Se requiere balance de masa para comparar los RE directamente con las
muestras de MPC (Tabla 2 y Cuadro S3). Las reducciones en las fracciones de
galactanos, glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y grupos sulfato
de RE de cepas y grupos seleccionados se clasificaron de la siguiente manera:
72,2-86,2%, 1,9-43,6%, 72,4-81,3%, 59,1-90,4%, 41,7-88,9% y 81-90% (p / p),
respectivamente. Las fracciones de galactanos en los RE de las cepas y grupos
seleccionados culminaron en mayores reducciones, en comparación con las
muestras de MPC, alcanzando un valor promedio de 79,6% (p / p). La reducción de
la fracción de galactano en los RE es común en el procesamiento de carragenina,
porque la fracción de galactano tiene un alto grado de
EG Solorzano-Chavez, et al. Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254

tabla 1
Composición química y rendimientos de muestras sin tratar y pretratadas con KOH (MPC) (p / v) al 6% de cepas y grupos seleccionados de K. alvarezii. Rendimientos y contenidos
presentados como porcentaje (g / 100 g, tal cual; base seca).

Muestras Grupos seleccionados Componentes de biomasa (g / 100 g tal cual)

Producir (%) Galactano (%) Glucano (%) Cenizas (%) Proteínas (%) Aromáticos insolubles (%) Grupos de sulfato (%) Lípidos (%)

Sin tratar
marrón A 30,9 ± 0,7 13,8 ± 1,0 15,2 ± 0,1 5,6 ± 0,5 3,5 ± 0,4 12,1 ± 0,8 8,6 ± 0,9
Verde 30,7 ± 1,4 12,9 ± 0,5 14,8 ± 0,1 3,8 ± 0,2 3,1 ± 0,3 11,0 ± 0,6 8,4 ± 0,2
rojo 30,2 ± 0,5 12,7 ± 0,7 14,4 ± 0,03 4,4 ± 1,0 2,8 ± 0,9 10,7 ± 0,5 8,0 ± 1,2
marrón B 33,1 ± 3,1 16,6 ± 2,2 15,0 ± 0,7 4,9 ± 0,4 3,4 ± 0,6 14,0 ± 0,3 1,5 ± 0,3
Verde - 32,9 ± 0,5 14,5 ± 1,6 15,1 ± 0,1 3,7 ± 0,3 3,4 ± 1,0 13,4 ± 1,0 2,3 ± 0,2
rojo 31,2 ± 2,3 13,5 ± 1,6 14,3 ± 0,1 3,8 ± 0,3 4.0 ± 1.0 13,8 ± 0,6 1,5 ± 0,1
marrón C 27,7 ± 0,9 13,5 ± 0,4 17,1 ± 0,02 2,2 ± 0,9 2,5 ± 0,3 12,4 ± 0,4 5,2 ± 0,5
Verde 26,9 ± 2,4 13,0 ± 1,6 15,4 ± 0,01 1,8 ± 0,7 3,9 ± 0,2 11,7 ± 0,8 5,3 ± 0,2
rojo 28,1 ± 1,9 12,7 ± 0,8 15,1 ± 0,4 2,4 ± 0,1 2,7 ± 0,6 12,2 ± 0,3 4,5 ± 0,2

Componentes de biomasa (g / 100g tal cual)

Muestras Producir (%) Galactano (%) Glucano (%) Cenizas (%) Proteínas (%) Aromáticos insolubles (%) Grupos de sulfato (%) Lípidos (%)

Tratado con KOH

marrón A 73,3 ± 0,1 26,6 ± 2,8 12,6 ± 1,1 19,4 ± 0,3 3,7 ± 0,4 2,4 ± 2,3 16,1 ± 1,1
Verde 79,9 ± 0,3 27,7 ± 1,4 10,3 ± 1,4 16,9 ± 0,2 5,2 ± 0,4 1,9 ± 0,5 18,4 ± 1,6
rojo 84,3 * 24,7 ± 3,9 11,1 ± 0,3 16,8 ± 0,03 2,3 ± 0,1 3,4 ± 0,3 16,9 ± 2,2
marrón B 66,6 ± 2,8 25,5 ± 2,3 13,3 ± 0,02 17,9 ± 0,3 3,0 ± 0,1 3,8 ± 0,5 17,2 ± 1,1
Verde 88,6 * 24,7 ± 0,9 15,8 ± 0,6 17,2 ± 0,5 5,2 ± 2,1 1,8 ± 0,1 18,0 ± 0,3 Dakota del Norte

rojo 65,2 ± 2,0 24,9 ± 2,3 11,2 ± 0,4 16,6 ± 0,1 4,3 ± 0,01 3,6 ± 0,2 15,0 ± 0,1
marrón C 75,4 ± 3,9 27,5 ± 1,1 16,1 ± 0,4 17,1 ± 0,02 2,2 ± 0,9 5,5 ± 0,3 12,1 ± 0,9
Verde 76,9 ± 1,9 16,7 ± 0,4 9,1 ± 0,8 15,4 ± 0,01 1,8 ± 0,7 4,9 ± 0,2 11,1 ± 0,5
rojo 80,9 ± 0,2 19,8 ± 1,3 9,5 ± 0,9 15,1 ± 0,3 2,4 ± 0,1 3,1 ± 0,6 11,1 ± 1,1

Todos los datos presentados son los valores promedio seguido de la desviación estándar de la muestra. * Valores obtenidos con una sola muestra. nd = no detectado.

solubilidad en agua a temperaturas superiores a 60 ° C [11,13]. La literatura
reporta el mismo comportamiento de la fracción de galactano en ER obtenidas en
el procesamiento de carragenina de cepas rojas y marrones deK. alvarezii
(reducción del orden del 94%, p / p) [11,13]. Los niveles de cenizas, proteínas,
aromáticos insolubles y grupos sulfato de cepas y grupos seleccionados también
se redujeron en los RE en comparación con las muestras de MPC, alcanzando un
valor promedio de 68%, 73,5%, 64,6% y 76% (p / p ), respectivamente. La literatura
presenta un comportamiento similar en la reducción de
cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y grupos sulfato en residuos de biomasa
de K. alvarezii (cepas rojas y marrones) de las muestras de MPC en comparación
con los datos de las cepas y grupos seleccionados de este documento [11,13]. Los
glucanos de cepas y grupos seleccionados mostraron una disolución promedio de
22,5% (p / p) después de la obtención de RE. Sin embargo, la literatura reporta
una disolución de la fracción de glucano en el procesamiento de carragenina, en
muestras de MPC deK. alvarezii (cepas rojas y marrones), del orden del 2,6% (p /
p), esto se atribuye al hecho de que hubo

Tabla 2
Composición química y rendimiento de residuo (RE) y refined muestras de carragenina (RC) del procesamiento de carragenina de cepas y grupos seleccionados de K. alvarezii.
Rendimientos y contenidos presentados como porcentaje (g / 100 g, tal cual; base seca).

Muestras Grupos seleccionados Componentes de biomasa (g / 100 g tal cual)

Producir (%) Galactano (%) Glucano (%) Cenizas (%) Proteínas (%) Aromáticos insolubles (%) Grupos de sulfato (%)

Residuo
marrón A 31,4 ± 2,0 21,2 ± 4,3 31,8 ± 1,8 13,3 ± 0,2 1,8 ± 0,1 3,2 ± 0,2 6,8 ± 0,8
Verde 30,4 ± 0,8 18,4 ± 1,8 33,3 ± 2,3 13,5 ± 0,7 1,7 ± 0,3 3,5 ± 0,4 8,2 ± 0,5
rojo 28,8∗ 19,2 ± 0,9 29,6 ± 0,7 13,7 ± 0,5 1,9 ± 0,1 2,6 ± 0,8 7,7 ± 0,6
marrón B 35,4 ± 3,3 14,0 ± 1,1 31,5 ± 2,8 11,9 ± 0,2 1,7 ± 0,1 2,2 ± 0,1 6,5 ± 0,8
Verde 26,5 ± 0,0 12,8∗ 33,9∗ n/A 3.4∗ 2.1∗ n/A

rojo 26,7 ± 3,5 16,4 ± 1,2 36,7 ± 0,9 11,5 ± 0,6 1,9 ± 0,1 1,6 ± 0,2 5,7 ± 0,1
marrón C 31,2 ± 0,1 18,0 ± 2,2 30,7 ± 0,4 12,9 ± 1,2 2,8 ± 0,1 3,6 ± 1,7 7,3 ± 0,7
Verde 34,9 ± 0,4 12,4 ± 0,4 32,9 ± 1,6 12,3 ± 0,4 3,7 ± 0,2 2,5 ± 0,3 5,5 ± 0,6
rojo 33,1 ± 0,7 16,7 ± 1,1 34,2 ± 0,9 11,6 ± 0,2 2,1 ± 0,4 4,3 ± 0,7 5,5 ± 0,7

Componentes de biomasa (g / 100g tal cual)

Muestras Producir (%) Galactano (%) Glucano (%) Cenizas (%) Proteínas (%) Aromáticos insolubles (%) Grupos de sulfato (%)

Refined carragenano
marrón A 69,1 ± 4,2 20,8 ± 0,5 7,8 ± 1,5 23,0 ± 0,2 3,2 ± 0,6 1,9 ± 0,5 17,4 ± 0,6
Verde 63,2 ± 1,5 30,1 ± 1,4 7,0 ± 0,5 24,2 ± 0,04 2,0 ± 0,5 1,6 ± 0,5 19,0 ± 1,1
rojo 63,1∗ 26,1 ± 1,9 8,3 ± 1,2 24,8 ± 0,5 2,8 ± 0,4 3,4 ± 0,8 21,7 ± 1,4
marrón B 54,8 ± 5,0 21,4 ± 4,0 4.0 ± 1.0 24,3 ± 0,2 3,5 ± 0,5 1,5 ± 0,4 21,9 ± 1,2
Verde 64,2∗ 19,7 ± 2,2 5,6 ± 0,6 21,6 ± 0,2 2,3 ± 0,3 1,6 ± 0,9 19,5 ± 0,9
rojo 62,9 ± 4,2 19,1 ± 1,8 4,1 ± 1,3 24,2 ± 0,6 4,2 ± 0,3 2,2 ± 0,4 18,7 ± 2,0
marrón C 53,2 ± 0,3 18,6 ± 0,2 6,6 ± 0,6 23,9 ± 0,4 4,5 ± 0,4 2,5 ± 0,6 10,5 ± 1,1
Verde 56,1 ± 1,3 22,6 ± 1,8 5,9 ± 0,1 25,3 ± 0,3 4,5 ± 1,0 2,5 ± 0,5 13,3 ± 0,7
rojo 59,5 ± 0,5 30,5 ± 2,0 6,2 ± 0,7 22,9 ± 0,8 5,5 ± 0,6 1,7 ± 1,0 11,4 ± 0,5

Todos los datos presentados son los valores promedio seguidos de la desviación estándar de la muestra. * Valores obtenidos con una sola muestra. na = no analizado.

8
EG Solorzano-Chavez, et al.
Figura 6. Rendimientos de fracciones del procesamiento de carragenina de las tres cepas y
grupos seleccionados de la K. alvarezii biomasa. (a) Rendimiento del residuo (ER) en relación con
la biomasa no tratada. (b) Rendimiento del refined carragenina (CR) en relación con la biomasa
no tratada. Contenido expresado en porcentaje (g / 100 g de materia prima) (base seca). Todos
los datos presentados son los valores promedio seguidos de las desviaciones estándar de la
muestra. * Valores obtenidos solo con una muestra. Los valores con las mismas letras no difieren
ffer el uno del otro con un significance nivel de
0.05 (prueba de Tukey, software GraphPad Instat, v3.10).
Figura 7. Productividad anual de residuos (REs) y refined carragenina (RC) de cada cepa.
Todos los datos presentados son los valores promedio seguidos de las desviaciones
estándar de la muestra. Los valores con las mismas letras en la fracción no difierenffer el
uno del otro con un signifinivel de cancelación de 0.05 (prueba de Tukey, software
GraphPad Instat, v3.10).
no signifireducción de la fracción de glucano en la extracción de carragenina de
las muestras de MPC [11,13]. Los datos sugieren que puede haber variaciones en
el procesamiento de carragenina (pretratamientos con KOH y extracción en agua)
que pueden conducir a la formación de RE con diffcontenidos actuales
(principalmente el contenido de glucano y galactano). Otra posibilidad serían
variaciones en la solubilidad de la materia prima (diffsolubilidades de las
fracciones de galactano y glucano en diffdiferentes cepas y culturas de K.
alvarezii). Por tanto, hay indicios de que la
9
Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254
materia prima (diffdiferentes culturas y cepas de K. alvarezii) y la producción de
procesamiento de carragenina (tratamiento con KOH y extracción con agua)
puedeflinfluyen en la composición química de las ER y las CR.
Tabla 2 presenta la composición química de refined muestras de carragenina
(RC) del procesamiento de carragenina de cepas y grupos seleccionados de K.
alvarezii. El contenido promedio de galactanos, glucanos, cenizas, proteínas,
aromáticos insolubles y grupos sulfato de los CR de las cepas y grupos
seleccionados fue de 18,6-30,5% (galactanos), 4,1-8,3% (glucanos), 11,5-25,3%
(cenizas), 2,3-5,5% (proteínas), 1-2,7% (aromáticos insolubles), 10,5-21,9% (grupos
sulfato) y 66,6%-87,1% (suma de componentes) (p / p), respectivamente (tabla 1).
Estos datos confirm el enriquecimiento de los grupos galactanos, cenizas y sulfato
en las muestras de RC, corroborando con una mayor tendencia a la solubilidad de
los galactanos en agua en comparación con los glucanos [11,13]. La literatura
reporta un comportamiento similar con biomasa deK. alvarezii (cepas rojas y
marrones), sin embargo, presenta un enriquecimiento más marcado del
galactano en las RCs [11,13]. Los contenidos de los RC de las cepas y grupos
seleccionados fueron similares a los informados para un carragenano comercial.
Sin embargo, la carragenina comercial mostró un mayor contenido de cenizas
(34,8%, p / p) y menores grupos de glucano y sulfato (0,4% y 12,8% p / p,
respectivamente) en comparación con los CR de las cepas y grupos seleccionados
en este artículo (tabla 1).
Se requiere balance de masa para comparar los RC directamente con las
muestras de MPC (Tabla 2 y Cuadro S4). Reducciones en los niveles de galactanos,
glucanos, cenizas, proteínas, aromáticos insolubles y grupos sulfato de la
RC de la Las cepas y grupos seleccionados se clasificaron de la siguiente manera:
8.1-64,0%, 53,2-83,5%, 7,8-63,7%, 9,1-71,1%, 48-84,2% y (p / p),
18,3-53,7% respectivamente. Los glucanos en las muestras de los CR de cepas
el seleccionado y grupos culminaron en mayores reducciones cuando
en comparación con las muestras de MPC, alcanzando un valor medio del 67,5%
(p / p). Esta effEl efecto es común, porque como se describió anteriormente, la
mayor parte de la fracción de glucano no era soluble en el procesamiento de
carragenina, permaneciendo en la fracción insoluble (RE). La literatura informa
una e similarffefecto sobre la extracción de carragenina de biomasa de K. alvarezii
(cepas rojas y marrones), pero menos pronunciado, lo que indica que
prácticamente todas las fracciones de glucano permanecieron en la fracción de RE
(no hubo disolución de la fracción de glucano en el procesamiento de
carragenina) [11,13]. Las fracciones de galactanos, cenizas y grupos sulfato en las
muestras de los CR de las cepas y grupos seleccionados no mostraron una
reducción marcada, debido a que una menor cantidad de galactanos, cenizas y
grupos sulfato permanecen en los RE insolubles (la mayor parte es disuelto en el
procesamiento de carragenina). El mismo comportamiento se observó en la
extracción de carragenina a partir de biomasa deK. alvarezii (cepas rojas y
marrones) [11,13], corroborando con los datos de cepas y grupos seleccionados
en este trabajo. Así, los datos de composición química del RC confirm la evidencia
de que la materia prima (diffdiferentes culturas y cepas de K. alvarezii) y la
producción de procesamiento de carragenina (pretratamiento con KOH y
extracción con agua) enflinfluyen en la composición química de RE y RC.
3.3. Evaluación de la hidrólisis enzimática de la fracción de glucano de los
residuos obtenidos
Figura 8abc muestra el comportamiento cinético de la hidrólisis enzimática,
en función de la conversión de glucano en glucosa, de los RE obtenidos tras el
procesamiento de carragenina de las cepas y grupos seleccionados. La Fig. 8abc
muestra que después de 72 h de hidrólisis enzimática todos los ER estudiados
tenían una conversión promedio de glucano en glucosa cercana al 100% (p / p),
considerando las desviaciones estándar. La excepción fue la conversión de
glucano en glucosa a partir del RE de la cepa verde referida al grupo C, que
alcanzó una conversión máxima del 85,4% (p / p), después de 72 h de hidrólisis
enzimática. La literatura reporta un comportamiento similar de la hidrólisis
enzimática de RE a partir del procesamiento de carragenina de biomasa de
K. alvarezii, cepas rojas y marrones, que muestran una conversión de glucano a
glucosa de aproximadamente el 100% después de 72 h de hidrólisis enzimática
con extracto comercial Cellic CTec II (carga enzimática: 10FPUg-1 de sustrato) [11,
13].
EG Solorzano-Chavez, et al. Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254

Figura 9. Productividad anual de glucosa a partir de residuos de macroalgas (ER). Todos los datos
presentados son los valores promedio seguidos de las desviaciones estándar de la muestra. Los
valores no differ el uno del otro con un signifinivel de cancelación de 0.05 (prueba de Tukey,
software GraphPad Instat, v3.10).

Tabla 3
Parámetros cinéticos para la hidrólisis enzimática de residuos (RE) del procesamiento de
carragenina de cepas y grupos seleccionados de K. alvarezii.

Muestras Seleccionado gramomax (gL-1) k (h-1) R2 * Tasa máxima de

grupos producción de glucosa
(gL-1h-1)

marrón A 7,2 ± 0,01 0,3 ± 0,01 0.9758 2,3 ± 0,1

Verde 8,5 ± 0,1 0,2 ± 0,03 0,9824 1,6 ± 0,2
rojo 6,4 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0.9314 2,0 ± 0,4
marrón B 6,4 ± 0,2 0,4 ± 0,1 0,9678 2,4 ± 0,5
Verde 5,7 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0.8936 1,9 ± 0,6
rojo 7,1 ± 0,1 0,3 ± 0,02 0.9790 1,9 ± 0,1
marrón C 6,6 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,9657 1,8 ± 0,5
Verde 6,6 ± 0,2 0,4 ± 0,01 0,9895 2,3 ± 0,1
rojo 7,6 ± 0,3 0,2 ± 0,04 0,9347 1,9 ± 0,3

Todos los datos reportados son los valores promedio seguidos de las desviaciones estándar de la
muestra.
* En la columna, los valores no differ el uno del otro con un signifinivel de cancelación de
0.05 (prueba de Tukey, software GraphPad Instat).
gramomax =concentración máxima asintótica de glucosa (gL-1).
k =constante de velocidad de reacción (h-1).

y los grupos variaron de 1,6 a 2,4 gL-1h-1 (Tabla 3). Recientemente se informaron
datos similares en la literatura, donde la tasa máxima de formación de glucosa
para un RE a partir del procesamiento de carragenina (cepas marrón y roja) deK.
alvarezii era de aproximadamente 1,8 gL-1h-1, utilizando la misma carga
enzimática y extracto que en este estudio (Cellic CTec II) [11]. El parámetro de la
Figura 8. Hidrólisis enzimática de residuos (RE) del procesamiento de carragenina
tasa máxima de formación de glucosa se utilizó para comparar la effefectos de diff
para las tres cepas y grupos seleccionados de K. alvarezii. Hidrólisis enzimática
diferentes condiciones experimentales sobre la hidrólisis enzimática de las ER del
con celulasas comerciales (extracto de enzima comercial Cellic CTec II). (a)
procesamiento de carragenina de cepas y grupos seleccionados. Así, luego de
Conversión de glucano en glucosa referida al nivel A. (b) Conversión de glucano a
aplicar una prueba estadística (prueba de Tukey) sobre los datos de tasa máxima
glucosa referida al grupo B. (c) Conversión de glucano a glucosa referida al grupo
C. Las barras de error corresponden a la desviación estándar de la muestra. de formación de glucosa, se encontró que no hubo signifino puedo diffdiferencias
entre cepas y grupos seleccionados (Tabla 3). Por lo tanto, todos los RE del
procesamiento de carragenina de cepas y grupos seleccionados se hidrolizaron
Considerando que la hidrólisis enzimática logra una conversión total del
de manera similar, es decir, alcanzaron el mismo nivel que la tasa máxima de
glucano contenido en los RE, la productividad anual de glucosa mostró valores
formación de glucosa.
que variaron entre 2.9 y 2.4 kg.m-2año-1, siendo que la cepa roja mostró un
significadofivalor ligeramente más bajo en comparación con las cepas verde y
marrón (prueba de Tukey) (Figura 9).
4. Conclusión
Tabla 3 presenta los valores de los parámetros cinéticos (gramomax, k) y R2
para la hidrólisis enzimática de los RE obtenidos post-carragenina
El diffdiferentes cepas de macroalgas K. alvarezii (verde, marrón, rojo y G11)
procesamiento de cepas y grupos seleccionados [40-43]. Los valores degramomax,
pudieron crecer en todos los meses en la costa de la región sureste de Brasil
k y R2 de cepas y grupos seleccionados varió entre 5.7 y
(Ubatuba-SP). Sin embargo, hubo signifiNo hay variaciones de productividad a lo
8.5 gL-1, 0,2-0,4 h-1 y 0.8936-0,9895, respectivamente (Tabla 3). La
largo del año. Por lo tanto, los cultivos de diffdiferentes cepas de K. alvarezii se
valores de gramomax y k se utilizaron para calcular la tasa máxima de formación
puede realizar todo el año en la costa sureste de Brasil, con mayor productividad
de glucosa [40-43] y los valores calculados para las cepas seleccionadas
de biomasa

10
EG Solorzano-Chavez, et al.
durante los meses de enero, febrero y marzo. Los carbohidratos poliméricos
(galactano y glucano) fueron los principales componentes encontrados en la
biomasa deK. alvarezii. Todos los RE del procesamiento de carragenina de las
cepas y grupos estudiados mostraron un enriquecimiento de la fracción de
glucano. La conversión promedio de glucano en glucosa a partir de los RE fue del
100%, no existiendo recalcitrancia del material frente a la hidrólisis enzimática con
celulasas comerciales. Además, la hidrólisis enzimática de la fracción de glucano
de los RE indicó que existe una tasa máxima de formación de glucosa a partir del
glucano independientemente de las diferentes cepas y períodos de producción de
biomasa.
En resumen, se puede afirmar que existe potencial para producir carragenina
a lo largo del año en la región sureste de Brasil a pesar de la variación mostrada
en la productividad en cada temporada. Además, el procesamiento post-
carragenano generado por ER puede ser una materia prima alternativa para la
fabricación de bioproductos de interés comercial. Un ejemplo sería la producción
de etanol de cuarta generación a partir del hidrolizado de glucosa.
Aprobación ética y consentimiento para participar
No aplica.
Consentimiento para la publicación
Todos los autores leyeron y aprobaron el fimanuscrito final.
Disponibilidad de datos de apoyo
Si se solicita, podemos proporcionar los datos de respaldo utilizados en la publicación de
este documento.
Estafaflictos de interés
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Fondos
FAPESP (número de contrato 2014 / 05969-2), CNPq (número de contrato
440385 / 2014-8), PROPe - UNESP (número de contrato 506) y Programa de Apoio
ao Desenvolvimento Científicofico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
UNESP-PADC (número de contrato 2013 / 19-1) que financia este trabajo.
Autores' contribuciones
EGSC y FRPC realizaron análisis de hidrólisis química y enzimática de
muestras, interpretación de datos y revisaron el manuscrito. VCG proporcionó las
cepas de macroalgas experimentales, realizadasfiensayos de campo, determinó
los datos de productividad agronómica, interpretación de datos y revisó el
manuscrito. LEO, RM, SCO y FM participaron en el diseño del estudio, la
interpretación de datos, el modelado matemático y revisaron el manuscrito.
Todos los autores leyeron y aprobaron elfimanuscrito final.
Agradecimientos
FAPESP (número de contrato 2014 / 05969-2), CNPq (número de contrato
440385 / 2014-8), PROPe - UNESP (número de contrato 506) y Programa de Apoio
ao Desenvolvimento Científicofico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
UNESP-PADC (número de contrato 2013 / 19-1) apoyó este documento.
Agradecemos también el apoyo del alemán Enrique Pesantez (Licenciado en
Ciencias en Ingeniería Eléctrica) al proporcionar
recursos para la revisión en inglés del artículo.
11
Biomasa y Bioenergía 127 (2019) 105254
Lista de abreviaciones
λ lambda
κ kappa
I Iota
DNS Unidades de papel de filtro de
FPU ácido 3,5-dinitrosalicílico
Interfaz de usuario Unidades Internacionales
HMF Hidroximetilfurfural
MPC Macroalgas pretratadas en solución alcalina fría REs
RE y Residuos y Residuos
RC y RCs Refined carragenano y Refined carragenanos
HPLC Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento
C18 columna de fase inversa HYPERSIL C18
HCl Ácido clorhídrico
KOH Hidróxido de potasio
BaCl2 Cloruro de bario
A Grupo seleccionado de los cultivos de cada cepa de K. alvarezii
refiriéndose a los meses de septiembre-Diciembre de 2013 Grupo
B seleccionado de los cultivos de cada cepa de K. alvarezii para los
meses de enero-Marzo del 2014
C Grupo seleccionado de los cultivos de cada cepa de K. alvarezii
refiriéndose a los meses de abril-Julio de 2014
Apéndice A. Datos complementarios
Se pueden encontrar datos complementarios a este artículo en línea en
https: // doi.org/10.1016/j.biombioe.2019.105254.
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