DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ALFA

AMILASA VEGETAL

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y

cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal.
El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la
amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por
cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces α- C1-C4, mientras que la
amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6,
formando cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la
amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas
(oligosacáridos) como productos.
Cataliza la hidrólisis al azar de los enlaces-1,4 glucosídicos de la región central
de la cadena de amilosa y amilopeptina exceptuando las moléculascercanas a
la ramificación, obteniendo como resultado maltosa y oligosacáridos de varios
tamaños. La actividad de la enzima se determinacualitativamente mediante la
disminución de la capacidad de la solución dealmidón para formar el color azul
característicos con el yodo o midiendo ladisminución de la viscosidad de la
suspensión de almidón.
La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y laramificada
(amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores(endoamilasa) para
formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conocecomo enzima
dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,acrodextrina y
maltodextrina) con poca producción de maltosa.
El almidón es un polímero semicristalino de glucosa de gran abundancia enla
naturaleza. La cantidad de almidón contenido en el grano de cereal varia,pero
generalmente oscila entre el 60 y 75 % del peso del grano. El almidónpresente
en los granos es el más importante de los carbohidratos para finesindustriales
resultando preciso degradarlo enzimáticamente con unagelatinización previa
por acción de calor o sometiéndolo a un intensotrabajo mecánico. El almidón
consta de dos fracciones: amilosa yamilopectina
El objetivo de esta práctica fue determinar la activad específica de la amilasa
vegetal y la actividad enzimática de una amilasa, extraída de trigo perminado,
luego dosandolo almidón residual.
II. MATERIALES Y MÉTODOS:
 Se procedió a machacar las raíces del trigo y de la cebada con 10 ml de buffer +
cloruro de calcio hasta obtener la cantidad del sustrato suficiente para nuestra
realización de nuestra práctica.
 Luego de machacar las raíces se procedió a colarla en el embudo y con ayuda
de una gasa a filtrar.
 Luego se procedió a filtrar en un embudo con ayuda de una gasa.

III. RESULTADOS:
6.1. PARA LA DEMOSTRACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
 Se cogieron 4 tubos de ensayo y se preparó el sistema con las enzimas y los
reactivos como se muestra en la tabla N° 01.
TABLA N°1: Se armó el siguiente sistema.
N° TUBOS I II III IV
SUSTRATO 1 1 1 1
  incubadora 30° 51'  
Enzimas   0.1 0.2 0.3
  incubadora 30° 15'  
Ácido clorhídrico 1 1 1 1
  Reparar 5'    
H20 9.9 9.8 9.7 9.6
Lugol 0.5 0.5 0,5 0.5

 Se llevó a cabo en la incubadora del espectrofotómetro a 620 nm, obteniendo

los resultados como se muestra en la tabla N°02.

TABLA N° 2: La actividad enzimática en el espectrofotómetro a 620 nm

  ABSROBANCIA ABSORBANCIA 
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.277 0.237
II 0.018 0.018
III 0.020 0.040
IV 0.019 0.069
Promedio 0.0835 0.091

 Los resultados obtenidos no fueron de forma ascendente como se

espera los resultados, esto se debe a que tal vez en el proceso en armar
el sistema enzimático, la cantidad enzimática quizá no fue lo suficiente.
6.1.1. Determinación de la concentración del almidón (mg/ml), multiplicando
absorbancia por factor de calibración.
Concentración
 TABLA A Concentración (mg/ml) (mg/ml) 
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 2.77 2.37
II 0.18 0.18
III 0.2 0.4
IV 0.19 0.69
Promedio 0.835 0.91

6.1.2. Cálculo de las unidades de enzima (U):

Unidad enzimática Unidad enzimática
 TABLA B (mg/mn) (mg/mn) 
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.185 0.158
II 0.012 0.012
III 0.013 0.027
IV 0.0127 0.046
Promedio 0.055675 0.06075

6.1.3. Determinar mg de proteína/ml = Absorbancia X Factor:

 TABLA C Proteína (mg/mn)  Proteína (mg/mn)
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 2.77 2.37
II 0.18 0.18
III 0.2 0.4
IV 0.19 0.69
Promedio 0.835 0.91

6.1.4. Determinación de la Actividad Específica (AE):

Actividad Específica Actividad Específica
 TABLA D (AE) (AE 
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.066787 0.06666667
II 0.06666667 0.06666667
III 0.065 0.0675
IV 0.06684211 0.06666667
Promedio 0.06632394 0.066875
6.2. PARA LA DE DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECIFIVA.

 Se cogieron 4 tubos de ensayos y se procedió a preparar la actividad

enzimática aplicando el reactivo de biuret como se muestra en la tabla N° 03.
 Se realizó el procedimiento tal cual muestra la tabla N° 04 y se agregó al final
el reactivo de lugol para luego ser llevada al espectrofotómetro.

TABLA N° 3: Se preparó para la determinación de la actividad específica

N° TUBOS (ml) I II III IV
Preparado enzimático   0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1 0.8 0.9 0.95
Reactivo de biuret 4 4 4 4
 Luego se llevó a la incubadora del espectrofotómetro a 540 nm, obteniendo los
resultados como se muestra en la tabla N°04.

TABLA N° 4: La actividad específica conespectrofotómetro a 540 nm

  ABSORBANCIA  ABSORBANCIA
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.049 0.044
II 0.074 0.080
III 0.057 0.058
IV 0.056 0.050
Promedio 0.059 0.043

 En este caso también obtuvimos un resultado no esperado. Lo cual nos

arrojaba de forma dispareja y no ascendente.

6.2.1. Determinación de la concentración del almidón (mg/ml), multiplicando

absorbancia por factor de calibración.
Concentración  Concentración
TABLA A (mg/ml) (mg/ml)
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.49 0.44
II 0.74 0.8
III 0.57 0.58
IV 0.56 0.5
Promedio 0.59 0.58

6.2.2. Cálculo de las unidades de enzima (U):

 Unidad enzimática Unidad enzimática
 TABLA B (mg/mn) (mg/mn) 
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.327 0.293
II 0.0493 0.053
III 0.038 0.039
IV 0.0373 0.033
Promedio 0.1129 0.1045

6.2.3. Determinar mg de proteína/ml = Absorbancia X Factor

 TABLA C Proteína (mg/ml)  Proteína (mg/ml)
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.49 0.44
II 0.74 0.8
III 0.57 0.58
IV 0.56 0.5
Promedio 0.59 0.58

6.2.4. Determinación de la Actividad Específica (AE):

Actividad  Actividad
 TABLA D Específica (AE) Específica (AE)
N° TUBO TRIGO CEBADA
I 0.66734694 0.66590909
II 0.06662162 0.06625
III 0.06666667 0.06724138
IV 0.06660714 0.066
Promedio 0.21681059 0.21635012

IV. CONCLUSION

 Logramos determinar la actividad enzimática en las dos experiencias

realizadas con semillas germinadas de trigo y cebada, en los cuatro
tubos pudimos notar la formación de anillos y también la formación de
precipitado en pequeñas y grandes cantidades.

 Identificamos y obtuvimos de los índices de absorbancia con la ayuda

del espectrofotómetro y los datos nos indican un comportamiento similar
de la actividad enzimática en ambas semillas.

 Logramos determinar la actividad específica del preparado enzimático

del trigo, y esto lo pudimos notarlo por la formación de anillos de color
anaranjado oscuro y de color azul fuerte que se presentó en el primer
tubo. Aprendimos el procedimiento que se debe utilizar para extraer la
amilasa de vegetales, en nuestro caso fue con las semillas de trigo y
 cebada, donde utilizamos las raíces de las semillas adicionadas con
reactivos que permitieron obtener el preparado enzimático.

V. DISCUSION
La amilasa es una de las enzimas más estudiadas debido a su rol de
degradación del almidón, ya que permite una germinación de las semillas, el
cual es degradado por los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa) en diferentes
dextrinas, que debido a su disminución en tamaño puede ser hidrolizada por la
B-amilasa, sin embargo la α-amilasa es una enzima que se encuentra regulada
tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la temperatura y el pH,
además posee un peso molecular de 50 Kda aproximadamente .La
germinación se lleva con la hidratación y posterior liberación de giberelinas, las
cuales inducen la síntesis de las enzimas hidrolíticas, que hidrolizan el almidón
que se encuentra el endosperma, produciendo glucosa que es transportada por
difusión, para generar energía.
El alfa-amilasa se encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal,
particularmente en las semillas con reservas de hidratos de carbono como el
trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en forma pura. Su peso
molecular es alrededor de 60.000, esta se secreta al endospermo amiláceo de
las semillas de cereales por dos tejidos, el cotiledón y la capa de aleurona,
degradando las macromoléculas de amilosa y amilopectina en pequeños
fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa.
La amilosa se colorea de azul en presencia de yodo, debido a la absorción o
fijación del yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo cual solo ocurre
en frio. Es conveniente aclarar que este proceso no es una reacción química,
ya que no se producen sustancias nuevas, como reactivo para identificar el
almidón se usa una solución denominad lugol.
La prueba del Lugol se realiza para identificar la presencia de polisacáridos, si
después de añadir los digeridos a los tubos de lugol se observa que tiene un
color azul, eso significa que hay presencia de almidón por lo tanto la reacción
no tuvo lugar, por otro lado si la reacción da un color amarillo intenso, eso
quiere decir que no hay presencia de almidón por lo tanto, hay si tuvo lugar la
actividad de la enzima

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Braverman, J.B. 1980. Introducción a la Bioquímica de los alimentos. El
manual moderno. México.
 Villavicencio, M. 1993. Bioquímica. Tomo I. Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología. Lima – Perú.
 Horna, E. 1988. Enzimas. Módulo 03 de Bioquímica. Universidad Nacional
del Santa. Chimbote – Perú.
 Metzler, E.D. 1981. Bioquímica, Omega. Barcelona.