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 TEMA Objetivo

El objetivo de la investigación
PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE consiste en producir lipasas fúngicas,
LIPASAS MICROBIANAS, UNA mediante la captura de esporas
ALTERNATIVA filamentosas presentes en la
superficie de un sustrato cítrico,

el Objetivo es inmovilización de
enzimas permite una mejora
significativa de su estabilidad, lo que
hace posible su empleo en la
producción industrial de productos
Inmovilización de enzimas. Fundamentos, químicos (aseo, detergentes,
métodos y aplicaciones
desengrasantes), farmaceúticos,
alimentos; en el tratamiento de
residuos; en el diagnóstico y
tratamiento de enfermedades, y
otras muchas aplicaciones.
 Evaluar el efecto de dos
Efecto de la concentración de jabón concentraciones de jabón Bolívar a
doméstico a diferentes temperaturas cinco temperaturas de incubación,
sobre el desarrollo de Pseudomonas en un medio mínimo de sales, sobre
aeruginosa el crecimiento de Pseudomonas
aeruginosa aislada de aguas

ELABORACIÓN DE UN DETERGENTE Elaborar un detergente enzimático

ENZIMÁTICO PARA LA REMOCIÓN DE
FOULING EN LAS MALLAS DE LAS para la remoción del fouling de las
PISCIGRANJAS DE LA LAGUNA DE mallas de las piscigranjas de la
laguna de Chacacancha.
CHACACANCHA
 Evaluar la incorporación de enzimas
Evaluación de la Incorporación de
proteasas en la formulación de un
Enzimas Proteasas en un Detergente
detergente líquido para la remoción
Líquido para la Remoción de Manchas de
de manchas de sangre en fibras
Sangre, Aplicando la Metodología de
textiles de algodón poliéster a escala
Diseño de Productos Químicos
laboratorio en Saint Germain Ltda.

Aislamiento de cepas de Bacillus Aislar una cepa del genero Bacillus y

productoras de proteasas con potencial estudiar una proteasa proveniente
uso industrial. de esta.

Formulaciones Detergentes
Biodegradables.
Obtener una formulacion de
detergente que utilice tensoactivos
provenientes naturales como
alquilpoliglucosidos y alcoholes
grasos etoxilados y que sean
facilmente biodegradables y que no
produzcan productos de degradacion
toxicos.

Las lipasas: enzimas con potencial para el Desarrllar biocatalizadores

desarrollo de biocatalizadores inmovilizados por absorcion
inmovilizados por adsorción interfacial interfacial en la enzima lipasa
  Reducir el consumo energético
Estudio de formulaciones detergentes y del proceso de limpieza, y
métodos para la limpieza del almidón en aumentar la protección de las
la industria alimentaria utilizando superficies y la biodegradabilidad
micro/nanopartículas, enzimas y de las aguas de lavado utilizando
tensioactivos microparticulas de enzimas y
tensioactivos.

Inhibidores de enzimas microbiales en la      Aislar los cultivos microbianos

biodegrabilidad de detergentes. productores de proteasas alcalinas
 Metodo

Aislamiento

Inmovilizacion
Aislamiento

incorporacion
incorporacion

Aislamiento
incorporacion

Inmovilizacion
Iincorporacion

Aislamiento
 Metodologia d ela muestra

Aislar las esporas de hongos presentes en el aire, en un sustrato cítrico. El hongo de interés
Aspergillus níger es inoculado en medio sólido de agar Sabouraud a 27ºC durante 7 días, entre
tanto puede realizarse las correspondientes observaciones de las características morfológicas
del hongo. Para posteriormente dosificar las esporas obtenidas en un caldo de cultivo contenido
en un matraz Erlenmeyer de 1L, al respectivo caldo se le suministra aire con una bomba de aire
filtrado, con el propósito de que haya suficiente oxígeno en el biorreactor. Manteniendo el
control constante de temperatura, pH y tras el conteo diario de formación de esporas, se tiende
a elaborar una gráfica que permite establecer el momento idóneo para comprobar la presencia
de lipasa, luego de haber sido purificada e inmovilizada. Hallando resultados 0.687 mg/L de
lipasa a 0.334A generando 86.67 µmol de ácidos grasos por 1 ml en 1 min. Otros métodos de
comprobación de la actividad, mediante titulación y aplicando a diferentes medios de grasas
animal y vegetal encontrando mayor cambio en los de origen animal.

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una

región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad
catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.El proceso de inmovilización se lleva a
cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se
inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo
químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los
geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el
segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra
sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos.
P. aeruginosa puede ser aislada de una gran variedad de ambientes tanto acuáticos como
terrestres, por lo que es considerada ubicua. Esta bacteria tiene diversas aplicaciones
biotecnológicas, sobre todo en el área ambiental. Produce biosurfactantes útiles para la
limpieza de suelos contaminados con compuestos orgánicos. Las bacterias para utilizar los
tensoactivos como fuente de carbono y de energía requieren de condiciones fisicoquímicas y
nutricionales óptimas(Nitrógeno inorgánico, fósforo, azufre, vitaminas y otros . El crecimiento
bacteriano en presencia de tensoactivos se cuantifica por diversas técnicas como: recuento en
placa, espectrofotometría y otros. El recuento en placa determina microorganismos viables
presentes en una muestra utilizando un medio de cultivo y condiciones de incubación
adecuadasempieza una formación abundante de enzimas que lo lleva a una degradación alta del
jabón y que luego se hace constante a partir de los cuatro días, debido a que también se
producen por el metabolismo degradativo, sustancias tóxicas que neutralizan la producción de
enzimas, además de los sistemas de autorregulación enzimática de los cultivos, después que han
alcanzado su fase logarítmica y sólo se mantiene una fase estacionaria hasta el agotamiento del
sustrato

Las muestras de mallas de las piscigranjas de la Laguna de Chacacancha son recolectadas por
cronograma es decir se toma en consideración que la muestra varia de acuerda al tiempo
expuesto en la laguna, para la investigación todas las muestras de mallas estuvieron sumergidas
en el agua de la laguna dos meses (condiciones críticas).
La intención de incorporar enzimas proteolíticas en composiciones detergentes se debe, en
esencia, a la eficacia que estas tienen para descomponer materiales de naturaleza proteica que
se encuentran sobre textiles sucios.En el presente caso de estudio, se parte de la sustancia
activa a evaluar la enzima, específicamente proteasas de tipo Serina, conocidas también como
Serin-Proteasas. Estas enzimas de origen bacteriano, tienen la característica de hidrolizar o
degradar proteínas y aminoácidos insolubles adheridos a las fibras textiles, facilitando su
remoción de dichas fibras, sin afectar su calidad o resistencia de las mismas, donde uno de los
parámetros importantes a tener en cuenta para el buen rendimiento de lasenzimas es el pH,
siendo un pH 8 el valor donde la enzima presenta mejores rendimientos y un pH de 10 para la
enzima.

Para el aislamiento de las cepas bacterianas, se procedió a tomar 3 muestras de suelo de un

área agrícola, para lo cual se limpió el área superficial y se procedió a colectar 250 g de suelo
aproximadamente y se colocaron en una bolsa de plástico, se sellaron y etiquetaron para
posteriormente ser trasladadas al laboratorio para su procesamiento. Las muestras fueron
almacenadas a temperatura ambiente (22ºC) y utilizadas para la búsqueda de las cepas de
Bacillus
La metodologia a implementar consiste en en tomar conjuntament y apartir de una realizacion
de un numero minimo de experimentos e identificar la concentracion optima, la temepratura y
el ph elcual es el necesarimanete requerido para la aplicación de un detergente que pemita
buscar un tensoactivo ya se anionico o o ionico que permita cojugar con laenzima para evaluar
la diferentes variables de la detergancia.En los ensayos de lavado realizados con el tensioactivob
y el acido oleico como suciedad se modificara el caudal de circulacion y las variables de
operacion.

La actividad esterasa más general puede determinarse empleando como sustratos los ésteres
de cadena acílica del p-nitrofenol o del α/β-naftol, siguiendo la liberación de la base alcohólica
por métodos espectrofotométricos. Deben considerarse los distintos coeficientes de extinción
del p-nitrofenol a diferentes valores de pH, la ausencia de absorbancia a pH ácido, y la
ocurrencia de hidrólisis espontánea a pH básico.en procesos que requieren condiciones de
reacción suaves, en términos de pH, temperatura y presión, debido a la labilidad de la mezcla.
Estas moléculas se requieren en cantidadespequeñas, pueden distinguir entre grupos
funcionales de reactividad similar y son capaces de modificar un sustrato dado dentro de una
mezcla compleja, llegando a discriminar incluso entre dos isómeros ópticos en el caso de
compuestos quirales. En la literatura especializada puede encontrarse abundante
documentación sobre el empleo de enzimas en la obtención de principios activos
Para estudiar la eficacia de lavado del almidón seco con fórmulas detergentes que contienen las
partículas S50 se llevó a cabo un diseño factorial completo 23 donde los factores considerados
fueron la concentración de partículas, el pH y el caudal. Este diseño se aplicó a tres
formulaciones de lavado diferentes: suspensión acuosa de S50 a pH constante, suspensión
acuosa de S50 a pH constante con AE 1 g/L y suspensión acuosa de S50 a pH constante con APG
1 g/L. Se modelizó la detergencia a tiempo final del ensayo (45 minutos). Se observó que en los
tres diseños de experimentos la detergencia se ajusta a un modelo empírico lineal con
interacción de factores y adición de un término cuadrático de pH.e realizaron también ensayos
de actividad de la α-amilasa mediante el método DNS utilizando condiciones experimentales
que reproducen las utilizadas en los ensayos de lavado con soluciones enzimáticas en el
dispositivo BSF (pH 7, 60 ºC). Se ha encontrado que la enzima mantiene su actividad en
presencia de todos los tensioactivos antes mencionados. Este resultado permite considerar su
incorporación a estas soluciones de tensioactivos y estudiar su eficacia de lavado sobre el
almidón seco.

Se seleccionaron muestras de tierras de los campos de cultivos de la Cooperativa Cartavio

teniendo en cuenta el cuartel de caña chica, se sacaron muestras de sus 4 lados más uno del
centro de 15 cuarteles que hacen un total de 75 muestras de campo Cartavio más 25 muestras
que se tomaron de biohuertos que hay en el Colegio Mixto Cartavio; estas muestras de 10 gr
más o menos, se guardaron en bolsas de polietileno.
 Condiciones experimentales Microorganismos utilizados
La inoculación del hongo Aspergillus níger debe
realizar a temperaturas inferiores a 40ºC ya que
por encima de esta la proliferación del mismo no
es muy eficiente.

Asegurarse de no haya existencia de bacterias en

las colonias de hongos, para evitar la presencia de
Lipasa
las mismas en el caldo de cultivo y a su vez no
causen un efecto no beneficioso en la producción
de enzimas.  Tener bien controlada la
temperatura, la agitación del caldo de cultivo y el
pH ya que de no ser así se daría la
desnaturalización de la enzima.

El metodo es Resistencia microbiana inclusion en

membranas y atrapamiento y reticulado El proceso
de inmovilización se lleva a cabo mediante la
suspensión de la enzima en una solución del
monómero. Se inicia la polimerización por un
cambio de temperatura o mediante la adición de Pectina
un reactivo químico.La enzima queda atrapada en
el interior de un gel, mientras que en el segundo
caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las
microcavidades de una fibra sintética, la enzima no
sufre ninguna alteración en su estructura.
El cultivo caracterizado de P. aeruginosa fue
purificado por resiembra en caldo glutamato,
después fue resembrado en agar glutamato más
jabón Bolívar al 1%; luego, varias colonias se Pseudomonas eruginosa
resembraron en frasquitos con agar blando
glutamato para su conservación. Todas las
incubaciones se hicieron a 37 ºC por 18 ò 24 horas.

En este trabajo se utilizara el método de Taguchi

como alternativa estadística para el diseño de
nuestro experimento, permitiendo evaluar tres
factores con tres niveles cada uno. A continuación
se muestran los niveles de las variables en las
experiencias : 20%, 30%, 40% : Son las
composiciones del surfactante
2%, 3%, 4% : Son los porcentajes de las enzimas 75 Proteasa
rpm, 92 rpm, 128 rpm : Son las velocidades de
agitación en el mezcladoMezclar la enzima
proteasa y el cloruro de calcio, formando una
solución acuosa, para así agregar al mezclador con
la mezcla a una temperatura ambiente, con un
tiempo de cinco minutos y medir el pH.
Para llevar a cabo la preparación de las
formulaciones, la adición de las materias primas se
hizo componente por componente, midiendo el
tiempo en que cada componente se mezcla
homogéneamente, las enzimas deben ser
estabilizadas antes de ser adicionadas a la mezcla
detergente, motivo por el cual, éstas se agregaron
en último lugar, disueltas en una solución
compuesta por una parte de la cantidad total del
hidrótopo que compone la formulación y cloruro
de calcio. Cabe aclarar que, antes de agregar la Proteasa
solución estabilizada de enzima, se debe realizar el
control del pH resultante de las preparaciones
detergentes, Con el pH de las formulaciones
ajustadas a los requerimientos de la enzima, se
adicionó en última instancia la solución enzimática,
de la misma manera en la que se agregaron los
demás componentes de la formulación. Es de
resaltar que la preparación de cada formulación se
realizó por duplicado, es decir, se preparó una
formulación principal y una réplica.
Aislamiento de las cepas bacterianas productoras
de proteasas. Bajo condiciones de esterilidad se
pesaron 2g de suelo y con ayuda de una espátula
de acero inoxidable fueron colocados en un tubo
de ensayo que contenía 10 mL. de medio de
cultivo infusión cerebro corazón (ICC) previamente
esterilizado. Posteriormente, los tubos fueron
Proteasa
colocados en baño de agua a 80ºC por 15 minutos
para eliminar bacterias y facilitar el aislamiento 25
del género Bacillus. Inmediatamente después se
tomo 1mL del sobrenadante de la dilución y se
inoculó en placas de Agar ICC bajo condiciones de
asepsia, por el método de dispersión utilizando
una espátula de Dryglasky
La variables del ensayo se realizarr con base a
temeratura, concentracion de suciedad y de
tensioactivo.La modificacion de las condicions
operacionales de lavado permite elaboracion de Lipasa
modelos mecanicos en los ue se evalua
detergencia y concentracion de productos de
hidrolisis enzimatica

Las condiciones tecnicas a tener en cuenta son el

pH-stat se ha empleado para cuantificar la
actividad lipasa en plantas, suero, plasma y
secreción duodenal. El ensayo presenta un límite
de detección en el orden de 0,1 µmol/min y solo
Lipasa
puede desarrollarse en un intervalo restringido de
valores de pH, los que deben igualar o exceder el
valor aparente de pKa de los ácidos grasos
liberados, ya que éstos deben encontrarse
parcialmente ionizados
Los ensayos de lavado realizados con
soluciones que incorporan enzimas han
mostrado que la detergencia depende
fuertemente de la temperatura y concentración
de enzima utilizadas. Las formulaciones Amilasa
enzimáticas permiten buenos resultados de
detergencia a valores neutros de pH y una
temperatura de 60ºC. La incorporación de
partículas S50 a la formulación enzimática no
mostró tener efecto sobre la detergencia.

Las características de las colonias se estudiaron en

agar glucosa a 25°c. La forma celular y la
reproducción asexual se investigó en caldo
sacarosado al 1% observándose a las 48, 72 y 96
horas.
El tamaño celular se investigó en agar glucosa a las
48 horas, utilizando para la medición, objeto y
ocular micrométrico
La formación de cepas proteolíticas se averiguó a
los 5 y 6 días.Se utilizó la cepa bacillus subtilis Proteasa
como cepa patrón.Para investigar la fermentación
de proteínas se utilizó la caseína y agua peptonada
en soluciones, la concentración final fue del 1%
anotándose los resultados en la tabla Na 14. Todas
las sustancias se usaron en estado puro,
cristalizadas en papel filtro watman impregnadas
con las respectivas soluciones saturadas. La
siembra se hizo según la técnica de estría,
incubando a 25 SC por 3 días.
 Conclusiones

Mediante la producción de lipasas a partir de

Aspergillus níger se llegará a disponer de una
alternativa, que resulta ser amigable con el
medio ambiente y relativamente rentable
económicamente por su método de producción y
eficiencia. Los datos logrados permiten contestar
la hipótesis, de poder obtener enzimas utilizando
esporas aisladas del aire con un sustrato cítrico, y
de que estas, sirvan como complemento en la
producción de jabones y detergentes.

La inmovilización de enzimas es un proceso en el

que se confina o localiza a la enzima en una
región definida del espacio, para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad
catalítica a lo que este método se
pueden encapsular simultáneamente una gran
variedad de enzimas, células o biomoléculas,
permitiendo
que se lleven a cabo determinadas reacciones
que suceden en múltiples pasos dando como
resultado la inmovilizacion de la enzima pectina.
P. aeruginosa , aislada de las aguas Incrementa
significativamente su desarrollo a los dos días a
las concentraciones a diferente concentraciones
del jabón Bolívar y a las temperaturas de 20 a
40ºC. - Presenta un crecimiento
significativamente mayor a 800 mg/L y a 20, 25,
30 y 35ºC que a 400 mg/L y a 40ºC. ºC. – Es
posible utilizarla eficazmente en los procesos de
biorremediación de aguas contaminadas con
jabón doméstico a las temperaturas de 20 a 35ºC.

En la elaboración del detergente enzimático para

la remoción del fouling de las mallas de las
piscigranjas de la Laguna de Chacacancha se usa
el alcohol laurico etoxilado en un 20%, proteasa
2%, glicerina 35%, cloruro de calcio 0,04%,
propilenglicol 1%, trietanolamina 1%, carbonato
de sodio 0.5%, agua 40.46 % y el grado de
agitación del mezclador a 92 Rpm para obtener
mayor rendimiento en la remoción.
Se determinó mediante experimentación, que la
enzima proteasa de pH neutro-alcalino es la
enzima que presenta mejores resultados en la
remoción de sangre logrando mayor estabilidad
al momento de potenciar la función detersiva de
la matriz de sustancias activas, logrando un
porcentaje de remoción del 98% a una
concentración del 2%

La proteasa producida por la cepa de estudio,

mostró actividad hemolítica, con uso potencial en
la industria de los detergentes, debido a su
compatibilidad con un detergente iónico fuerte y
tolerancia a pH 10 y temperatura de 80ºC
Los resultados muestranque las temperaturas
inferiores a 40ºC la detergencia incrementa la
concentracion de la enzima utilizada y con la
concentracion de suciedad, para temeraturas
superores a 40ºC (punto de fusion de la grasa) se
consigue una mayor eficacia de lavado utilizando
concentraciones de la enzima de menores y
mayores temperaturas.Los efectos delavado se
consiguen a bajas temperaturas a
concentraciones de enzimas altas o atas
temperaturas y cncentraciones bajas de
tensioactivo.

La activación en interfaces, una especificidad de

sustrato amplia y una selectividad basada en
múltiples determinantes estructurales, una
sensibilidad de la actividad enzimática muy rica
frente a numerosos y variados efectores, la
posibilidad de inmovilización con altas
retenciones de la actividad funcional, la
estabilidad operacional de los biocatalizadores
inmovilizados, la estabilidad en solventes
orgánicos, y la capacidad de desarrollar la
catálisis en medios con baja actividad de agua,
son algunos de los aspectos más atractivos de las
lipasas que han determinado su papel
protagónico en numerosos procedimientos de la
tecnología enzimática
En el proceso de electrolimpieza la presencia
de tensioactivos en la solución de lavado (en
concentración 1 g/L). Se demostró que los
siete tensioactivos estudiados mejoraban la
detergencia en ensayos realizados en las
condiciones óptimas de lavado descritas
anteriormente. Los tensioactivos no iónicos
estudiados (a excepción del APG) son los
que proporcionaron una mayor detergencia,
alcanzándose valores próximos al 90%.

Es posible obtener cultivos de Bacillus Subtilis

que producen un alto rendimiento enzimático,
los cuáles pueden ser usados en la industria de
fermentación semisólida del afrecho de trigo
para a fabricacion de detergentes-