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Venenos de Serpiente
Venenos de Serpiente
Introducción.
Las bacterias grampositivas y negativas son patógenos peligrosos que pueden causar
enfermedades de infección humana, especialmente en vista de la resistencia a los
antibióticos, que se está convirtiendo en un problema clínico alarmante [1, 2]. Para
encontrar nuevos compuestos antimicrobianos, se han explorado múltiples fuentes de
antibióticos en la naturaleza. Entre ellos, los venenos de los animales constituyen una de
las fuentes más ricas de sustancias farmacológicamente activas, ya que estos
compuestos pueden producirse por autodefensa, siendo útiles para el desarrollo de
fármacos inusuales [1].
Por otro lado, no solo se han obtenido propiedades perjudiciales del veneno. Esta
secreción puede utilizarse como una herramienta farmacológica, y representa un enorme
campo potencial para el descubrimiento de nuevas moléculas que pueden curar
enfermedades, incluso aquellas que no responden a las terapias actuales [4]. Con este
fin, esta revisión se centrará en los compuestos antimicrobianos aislados de venenos de
serpiente que pueden utilizarse como nuevos fármacos contra enfermedades infecciosas
y como herramientas biotecnológicas que podrían ayudar a resolver problemas de salud.
Fosfolipasas A2
Las fosfolipasas A2 (PLA2) son miembros de una superfamilia de enzimas que se ha
dividido en 11 grupos de acuerdo con la fuente, tamaños moleculares, efectos
patológicos, similitudes de secuencias de aminoácidos, homología estructural y patrón
de puente disulfuro [5]. Debido a estas características, los PLA2 también se han
clasificado como enzimas que hidrolizan los fosfolípidos en la posición sn-2 de una
manera dependiente del calcio, liberando ácidos grasos y lisofosfolípidos [6].
Las PLA2 de veneno de serpiente son proteínas con una longitud de 120- 130 residuos
de aminoácidos que están reticulados por siete enlaces disulfuro. Pueden clasificarse en
el grupo IA, representado por serpientes elapid, y el grupo IIA, caracterizado por
serpientes viperida y Crotalid [7, 8]. El último grupo (IIA) también se puede subdividir
en dos subgrupos principales. El primero presenta un ácido aspártico en la posición de
aminoácido 49 (Asp49), que tiene una carga negativa que potencia la unión de Ca2 + y
contribuye a la hidrofobicidad de Asp49 y, en consecuencia, a su actividad catalítica. El
otro subgrupo es Lys49, que tiene una lisina en la posición 49 y muestra una carga
positiva que impide la unión de Ca2 +, que muestra baja o nula hidrofobicidad, pero
también presenta actividad catalítica [8]. Además de su actividad catalítica, los PLA2
IIA también pueden poseer actividades biológicas adicionales, como hemolítica [9],
anticoagulante [10], agregación plaquetaria [11], neurotoxicidad [12] y miotoxicidad
[13]. Además, algunos estudios han demostrado que los múltiples efectos
farmacológicos, como las actividades antitumorales [14] y antimicrobianas, también
pueden correlacionarse con las actividades de veneno de serpiente de PLA2.
Además de los subgrupos Lys49 y Asp49, algunos estudios han sugerido que otros
subgrupos de IIA PLA2 se pueden encontrar en la naturaleza. Wei et al. [7] estudiaron
un nuevo subgrupo conocido como promutoxina, que contiene un Arg en la posición 49
(R49 PLA2) (Fig. 2a, b). Esta enzima se purificó en primer lugar a partir del veneno de
serpiente Protobothrops mucrosquamatus mediante el uso de métodos de cromatografía
líquida seguida de la determinación de la masa molecular SDSPAGe y MALDI-TOF.
La enzima se desafió adicionalmente contra bacterias Gram-positivas y negativas [7]. El
análisis de masa molecular mostró una banda única de 15 kDa en condiciones
reductoras y dos bandas de 15 y 24 kDa en condiciones no reductoras. El análisis
MALDI-TOF mostró un solo pico con una masa molecular de 13.656 kDa. Por otra
parte, los estudios estructurales que involucraron una combinación de diferentes
tecnologías como MALDI-TOF, edman secuenciación N-terminal y la clonación
molecular también se realizaron para determinar la estructura primaria de la
promutoxina [7]. Se realizaron ensayos antimicrobianos contra bacterias Gram-positivas
y negativas que muestran que R49 PLA2, a 250 μg mL-1, pudo controlar Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium (Tabla 1) [7]. En estudios
realizados con una fosfolipasa A2 homodimérica del veneno de serpiente Bungarus
faciatus (BFPA), Chunhua Xu et al. [15] purificado y caracterizado s-PLA2-I (BFPA),
mostrando 15 medias-cisteínas [15]. También desafiaron a BFPA contra
Staphylococcus aureus y Escherichia coli, mostrando una actividad más fuerte contra
bacterias Gram-positivas que Gram-negativas [15]. Estos resultados pueden explicarse
por las propiedades catiónicas generales de BFPA, que facilita la penetración de la
pared celular bacteriana Gram-positiva aniónica [16]. Parece que la actividad reducida
hacia bacterias Gram-negativas podría estar relacionada con la ausencia de proteína
bactericida / de penetración creciente (BPI), una proteína capaz de unirse y penetrar
lipopolisacáridos producidos por bacterias Gram-negativas [17, 18].
Metaloproteinasas.
Aunque las SvMP son conocidas por sus capacidades de adhesión proteolítica, de matriz
celular y célula-célula, solo unos pocos estudios han relacionado estas enzimas para
dirigir las actividades antimicrobianas. Samy et al. [26] informó el aislamiento y la
caracterización de una metaloproteinasa de Agkistrodon halys (AHM), con el objetivo
de comprender cómo la permeabilidad de la membrana y las funciones antimicrobianas
podrían estar relacionadas con dichas proteinasas [26]. Se aplicaron métodos de
aislamiento y purificación basados en filtración en gel seguidos por HPLC de fase
inversa, MALDITOF y SDS-PAGe, dando como resultado una purificación de AHM
que mostró una masa molecular de 23 kDa. AHM mostró actividades inhibitorias contra
Bacillus pseudomallei, Proteus vulgaris y S. aureus (Tabla 1) [26]. De lo contrario,
AHM no mostró ninguna actividad perjudicial contra E. coli, P. aeruginosa o
Enterobacter aerogenis (Tabla 1) [26]. Además, se realizaron estudios de ultraestructura,
utilizando microscopía electrónica de barrido (SeM) y microscopía electrónica de
transmisión (TeM), para demostrar los daños celulares ocasionados por AHM, como
perforación celular y rugosidad de la pared celular sobre bacterias Gram positivas y
negativas.
Para clasificar esta enzima, Samy et al. [26] también realizó un estudio comparativo de
la estructura primaria de AHM frente a otros SvMP como contortrostatin, bothrostatin y
elegantin-2a, que reveló altos niveles de similitud debido a un dominio conservado
constituido por dominios disintegrina / cisteína que son típico de la clase P-III SvMP.
Esta clase parece mostrar una acción bactericida mediante el reconocimiento de sitios
aniónicos bacterianos y también la degradación enzimática de las membranas de
fosfolípidos, por su perforación seguida de procesos de disrupción de la membrana,
eventos que se producen preferentemente en bacterias Gram-positivas [26].
L-Amino oxidasas
Okubo et al. [29] demostraron que los LAAO del veneno de Bothrops mattogrosensis
(Bm-LAAO) (figura 2c, d) presentaban actividad antimicrobiana contra múltiples
bacterias, mostrando una probable función protectora inusual. Con el objetivo de
identificar y aislar Bm-LAAO, se utilizó la cromatografía de filtración en gel, que dio
como resultado tres fracciones con actividades antimicrobianas. La fracción con la
actividad más alta se aplicó sobre un cromatógrafo de HPLC de fase inversa,
produciendo una especie de enzima Bm-LAAO purificada. Bm-LAAO mostró la mayor
actividad antimicrobiana, con CMI entre 2 y 8 μg mL-1 cuando se enfrentaba a
bacterias Gramnegativas como Klebsiella pneumoniae, E. coli y P. aeruginosa y MIC
entre 8-32 μg mL-1 cuando era desafiado Gram-positivas bacterias tales como S. aureus
y Streptococcus pyogenes (Tabla 1] [29].
Otros estudios han demostrado que LAAO es una enzima que es capaz de catalizar la
oxidación de una gran cantidad de aminoácidos [29], generando aminoácidos y peróxido
de hidrógeno, H2O2. Esta habilidad parece estar esencialmente involucrada en la
actividad antibacteriana. Con el objetivo de comprender el mecanismo de acción
bactericida H2O2, Zhang et al. [33] demostraron que LAAO del veneno de serpiente de
A. halys (AHP-LAAO) fue capaz de inhibir el crecimiento bacteriano tanto Gram-
positive como-negative debido a la producción mejorada de H2O2 [33]. Para relacionar
la presencia de H2O2 y la actividad antimicrobiana, AHP-LAAO fue desafiado contra
S. aureus y E. coli, en presencia y ausencia de catalasa, una enzima que cataliza la
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Curiosamente, los
efectos inhibidores cesaron tras la adición de catalasa. La catalasa fue capaz de destruir
el H2O2 producido durante las reacciones enzimáticas AHP-LAAO, lo que sugiere que
la actividad antimicrobiana de AHP-LAAO podría atribuirse directamente al H2O2
producido [33].
Péptidos antimicrobianos.
Los péptidos antimicrobianos se definen como moléculas que tienen una defensa crítica
contra todo tipo de microorganismos, protegiendo al huésped de la invasión de
bacterias, hongos y virus [34]. Además, los péptidos antimicrobianos se han enfocado
como un nuevo enfoque para el desarrollo de fármacos contra infecciones [35]. Son
parte del sistema inmunitario innato y juegan un papel en la defensa contra la infección
por microorganismos. También son capaces de inactivar agentes infecciosos y son un
fuerte candidato para combatir la resistencia a los medicamentos [36].
Desafortunadamente, solo un número seleccionado de AMP se ha descrito como
adecuado para aplicaciones farmacológicas [37]. Una de las mayores dificultades en el
diseño de AMP útiles es la comprensión poco clara de sus determinantes estructurales
para el reconocimiento de compuestos de membrana [38]. La estructura, la
hidrofobicidad, el plegamiento, las cargas y los ángulos de enlace dinámico y AMP
parecen ser factores cruciales que pueden influir en su selectividad y actividades [39,
40]. En este contexto, una amplia variedad de estudios bioquímicos y biofísicos han
reportado mecanismos de biodisponibilidad, alteración de la membrana y actividades
sinérgicas de estas moléculas [41].
En otro estudio, Porcelli et al. [63] mostró que la pardaxina sintética, llamada P4a,
demuestra una curva-hélice-hélice en presencia de dodecilfosfocolina sódica. P4a podría
inducir un trastorno en DMPC y en un núcleo bicapa hidrofóbico. Además, la pardaxina
C-terminal hélice adopta una conformación transmembrana en DMPC bicapa. De lo
contrario, en las bicapas de POPC, la pardaxina mostró una orientación de la superficie
lipídica y no una orientación transmembrana. Estos datos sugieren que P4a altera la
dinámica del grupo principal. Bhunia et al. [39] desarrollaron un estudio que explica un
P4a formador de poros en micelas de LPS, demostrando su eficacia en la
permeabilización del exterior además de la membrana interna. Este estudio también
demuestra que P4a asume conformaciones aleatorias en el tampón acuoso, pero esta
conformación se modificó a estructuras helicoidales en presencia de una micela de LPS.
La RMN y la espectroscopía infrarroja confirmaron que P4a muestra la presencia de
hélices y lazos / vueltas y conformaciones extendidas en los extremos en un entorno de
micelas de LPS. Ramamoorthy et al. [38] mostró que la dinámica de la pardaxina se
volvió desordenada en presencia de colesterol. Este mismo estudio también mostró que
una reducción en la temperatura podría reducir la movilidad de la hélice pardaxina.
Además, la presencia de colesterol disminuye el trastorno de hélice C-terminal, ya que
el colesterol aumenta el orden de las cadenas de acilo en bicapas; en consecuencia, el
aumento de las cadenas de acilo es una de las causas de la reducción de la motilidad de
la hélice C-terminal de pardaxina. Estos resultados implican que el colesterol puede
influir en la formación de barriel-stave realizada por pardaxina.
Un trabajo previo desarrollado por wang et al. [36] aislaron y caracterizaron un péptido
antimicrobiano catelicidina del veneno de B. fasciatus. La familia de catelicidina se
caracteriza por sus dominios de catelinina, que son un dominio conservado aniónico con
una secuencia N-terminal conservada para aproximadamente 100 residuos [64, 65]. El
precursor de catelicidina muestra un dominio de catelin altamente conservado
compuesto de 100 residuos de aminoácidos, que está flanqueado por un fragmento de
péptido señal con aproximadamente 30 residuos en el extremo N y también un péptido
antimicrobiano en el péptido antimicrobiano catiónico C-terminal [65]. La catelicidina
aislada por wang et al. [36] se denominó catelicidina-BF con una masa molecular de
3,637.5 Da y punto isoeléctrico a 11.79. Esta catelicidina está compuesta de 30 residuos
de aminoácidos, incluidos 12 residuos básicos (9 lisinas y 2 argininas), 5 fenilalaninas y
un solo residuo ácido (16 ácido glutámico) [36]. Los elementos de la estructura
secundaria se predijeron mediante espectroscopia de CD, lo que indica una
conformación altamente α-helicoidal, aunque no se elucidó una estructura
tridimensional [36]. Sin embargo, los datos de CD indicaron que la porción N-terminal
de catelicidina-BF adopta una conformación anfipática α-helicoidal como la de
cualquier otra catelicidina [36]. El péptido antimicrobiano catelicidina-BF demostró
fuertes actividades antimicrobianas contra varios microorganismos, siendo más eficiente
frente a bacterias Gram-negativas, y también contra bacterias resistentes a fármacos
clínicamente aisladas, incluyendo K. pneumoniae, E. coli y aislados clínicos de
Salmonella typhi (Tabla 1). ) Cathelicidin-BF también fue efectivo contra los patógenos
fúngicos Candida albicans ATCC2002 y Pichia pastoris (Tabla 2). Además, algunos
hongos saprófitos también se vieron afectados por este péptido, incluidos Aspergillus
terreus, A. niculans y Haetomium globosum (Tabla 2) [36].
Por otra parte, Gomes et al. [69] informó el aislamiento y la caracterización de un nuevo
péptido (PepBj) de Bothropos jararaca veneno de serpiente. PeBj fue desafiado aún más
contra diferentes hongos. Los métodos de purificación se basaron, en primer lugar, en la
cromatografía de filtración en gel, que dio como resultado la separación del veneno
crudo en ocho fracciones. Se analizaron varias fracciones contra Colletotrichum
lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae y C. albicans, pero
solo una fracción mostró actividad antifúngica significativa (Tabla 2) [69]. Esta fracción
se aplicó además en un cromatógrafo de fase inversa, produciendo el PepBj purificado.
El análisis de espectrometría de masas mostró un pico principal con una masa molecular
de 1.370 Da. Además de los ensayos antifúngicos, Gomes et al. [69] realizó microscopía
óptica y de barrido electrónico, que muestra que PepBj indujo varias alteraciones
morfológicas de las hifas junto con la formación de pseudohifas en hongos evaluados.
Además, utilizando el ensayo verde SYTOX, se observó que PepBj también podía
inducir la permeabilidad de la membrana hifal, mostrando una fuerte fluorescencia
verde SYTOX en el citosol y el núcleo [69], sugiriendo que las acciones del péptido se
basan en daños intercelulares.
También se ha demostrado que los fragmentos peptídicos de las proteínas del veneno
superior son eficaces para controlar los microorganismos. Okudo et al. [29] demostraron
que los fragmentos de Bm-LAAO también podrían mostrar actividad antimicrobiana
contra múltiples bacterias. Se identificaron tres fragmentos, llamados Bm-LAOf1 (Fig.
2g), Bm-LAOf2 (Fig. 2h) y Bm-LAOf3 (Fig. 2i), y se sintetizaron y evaluaron
adicionalmente contra bacterias grampositivas y negativas, contra las cuales mostró
actividad (Tabla 1). Los análisis de modelado molecular sugirieron que Bm-LAOf1
presentó una región de hélice α con una carga neta de +3 así como una conformación de
la bobina con secuencias C-terminales hidrófobas y catiónicas (Fig. 2g) [29]. Bm-
LAOf2 estructuralmente presentó una conformación hélice hidrofóbica con una carga
negativa de -1 y una definición de una hélice dipolo (Fig. 2h) [29]. Además, Bm-LAOf3
presentó estructuralmente una conformación de la bobina debido a la presencia de dos
residuos de prolina, que dificultan la formación de la hélice (figura 2i) [29]. También se
observaron residuos hidrófobos en el N-terminal y el C-terminal, lo que podría
contribuir a la interacción péptido-lípido en los tres péptidos evaluados aquí. Sin
embargo, cuando se comparó con la proteína natural BmLAAO (figura 2c, d), los tres
fragmentos peptídicos mostraron inhibiciones de desarrollo microbiano más bajas [29],
a pesar de los claros beneficios de las masas moleculares inferiores.
Con el fin de completar las lagunas en el conocimiento sobre proteínas y péptidos donde
no existe una estructura derivada experimental, las metodologías que se centran en la
predicción de la estructura tridimensional impulsada por el cálculo se han utilizado con
éxito. Sin embargo, cuando existe una estructura determinada experimentalmente, los
métodos in silico también pueden ser útiles para predecir las superficies de unión de
otras moléculas, estimar la energía de unión y predecir los movimientos y la flexibilidad
que se requieren para algunos eventos, incluido el mecanismo de acción [95]. ] Muchas
estrategias de modelado han usado ab initio para predecir algunas estructuras de
proteínas. Ab initio consiste en caracterizar una estructura de proteína 3D utilizando
solo la secuencia primaria de la proteína como entrada [95]. De lo contrario, además de
ab initio, se ha realizado un modelo de homología, utilizando similitudes estructurales y
evolutivas por medio de una plantilla, que es una estructura de proteína, previamente
elucidada, con identidad para el objetivo de proteína. En contraste, los métodos de
enhebrado pueden ser utilizados por modelos que no están evolutivamente relacionados
porque usan proteínas que tienen el mismo pliegue, pero no necesariamente tienen
proteínas homólogas [95]. La construcción de modelos implica en primer lugar
identificar la mejor plantilla para la alineación. Las plantillas se eligen según la mayor
identidad / homología entre el objetivo y la plantilla [95]. Algunos enfoques para la
conservación de secuencias también se pueden utilizar, y para un refinamiento, las
estructuras de bucle y las cadenas laterales se pueden refinar mediante la dinámica
molecular [20, 95]. En resumen, a pesar de algunas limitaciones, como un costo
computacional elevado para cachear el espacio energético y también la complicación de
seleccionar con precisión la estructura nativa de una amplia gama de conformaciones
alternativas, estos análisis in silico también son prometedores para predicciones de
proteínas y péptidos derivados de los venenos de serpiente.
Con el fin de examinar cómo los AMP interactúan con LPS, Bhunia et al. [48] utilizaron
RMN para evaluar cómo el péptido MSI-594 interactúa con las micelas de LPS. El
estudio determinó la estructura tridimensional MSI-594 en un complejo con LPS y
también en una forma libre. En primer lugar, MSI-594 en solución gratuita está
completamente desestructurado. Sin embargo, en presencia de E. coli y S. typhimurium,
los LPS de los espectros tridimensionales Tr-NOeSY mostraron una gran cantidad de
conectividad NOe, lo que indica una estructura de plegado de péptidos.
Sorprendentemente, el MSI-594 LPS indujo estructuras de hélice corta (I2-K10) y
largas hélice C-termini (I13-L24) que estaban conectadas por un circuito corto (K11-
G12). Esta nueva estructura parece ayudar al MSI-594 a cruzar la barrera LPS de la
membrana externa [48]. Al usar una estrategia similar, Bhunia et al. [39] elucidado las
interacciones de LPS y pardaxin (Pa4). Este estudio se utilizó para la elucidación de la
estructura tridimensional de Pa4 en el complejo con LPS, que muestra la capacidad de
Pa4 para romper la membrana externa. Durante este proceso, Pa4 adopta una
conformación helicoidal clara. La estructura proporcionada en las micelas de LPS
mostró dos residuos catiónicos (Lys8 y Lys16) en el medio de la hélice N-terminal y al
comienzo del extremo C, que puede interactuar con el grupo de bisfosfato de lípido A
en LPS. Estas interacciones facilitan que los residuos hidrofóbicos entren en contacto
con las cadenas de acil LPS, lo que facilita la alteración de la membrana [39]. Además,
con el objetivo de evaluar la selectividad de AMP, un péptido sintético llamado MSI367
[(KFAKKFA) 3-NH2], que se formuló en silico, fue sintetizado por Thennarasu et al.
[96]. MSI-367 tiene ~ 48% de propensión helicoidal que pliega un máximo de cinco
vueltas helicoidales en condiciones favorables. Además, MSI367 tiene nueve lisinas
cargadas positivamente que posiblemente se unen a lípidos cargados negativamente en
las membranas bacterianas. Los datos de 31P NMR indicaron modificaciones en la
orientación de los lípidos y bicapas causadas por la unión del péptido MSI-367. Los
datos de RMN, también obtenidos en presencia de lípidos de E. coli, mostraron la
presencia de interacciones electrostáticas de lípidos-péptidos, que abarcaban el péptido
en la interfaz lípido-agua y proporcionaban la base para la selectividad de las células
bacterianas [96].
En resumen, la técnica de RMN podría arrojar algo de luz sobre cómo se comportan los
péptidos en las membranas bacterianas y eucariotas, mostrando qué tipo de
interacciones pueden desarrollar los AMP con estas bicapas lipídicas. Mediante el uso
de prototipos de veneno animal, los estudios con RMN han demostrado una mejora real
en la caracterización de los AMP derivados de los venenos de serpiente. Esta tecnología
también podría demostrar los tipos de modificaciones que los péptidos de veneno de
serpiente pueden causar en las membranas celulares de mamíferos, proporcionando
nuevos conocimientos sobre la especificidad de los péptidos. Sin embargo, por el
momento, los péptidos derivados de los venenos de serpiente no han sido ampliamente
evaluados por RMN en fase sólida, lo que también hace que esta técnica sea
prometedora para estudios de péptidos ofidios.
Parece cada vez más probable que muchos problemas de infección bacteriana se puedan
resolver con el uso de propiedades terapéuticas que pueden proporcionarnos los
compuestos proteínicos de serpiente, y la producción puede resolverse usando nuevas
tecnologías de síntesis química y expresión heteróloga. Por lo tanto, se deben realizar
más estudios para comprender mejor los mecanismos de acción de estos componentes y
cómo actúan realmente en el cuerpo humano, de modo que puedan mejorarse como
nuevos fármacos para combatir las infecciones resistentes a los microorganismos.