TEMA III

ESPECTROMETRIA DE MASAS
Sistema de Vacío
El sistema de vacío en un espectrómetro de masas es una parte
fundamental del instrumento. Conseguir un medio ausente de colisiones con los
iones procedentes del aire es de capital importancia y, dependiendo del tipo de
analizador, el grado de vacío reinante es crítico. En sistemas cuadrupolares,
tiempo de vuelo y trampas iónicas se toleran valores del nivel de vacío dentro del
rango de 10-4 a 10-6 torr, mientras que para sistemas de sector magnetico y FTMS
se requieren valores de entre 10-7 y 10-9.
Este alto nivel se consigue mediante la utilización de dos tipos básicos de
bombas de alto vacío,(asistidas por bombas de vacio previo o rotatorias), como son
las bombas difusoras y las bombas turbomoleculares, aunque existen otras varias
pero su uso es mucho menos frecuente (sublimación, iónicas, etc). La elección de
un tipo u otro presentan ventajas e inconvenientes en cuanto a duración, costo,
mantenimiento, velocidad de evacuación, etc.
BOMBA TURBOMOLECULAR
Funcionamiento.- Las paletas
móviles ,al girar a velocidades
de entre 30.000 y 90.000
r.p.m obligan a las moléculas
de gas a caer ,siendo
evacuadas finalmente por una
bomba rotatoria.

BOMBA DIFUSORA
Funcionamiento.- El aceite
es calentado y asciende por las
toberas.
Al alcanzar las chimeneas es
forzado a caer y arrastra a las
moléculas de gas que son
evacuadas con la ayuda de una
bomba rotatoria.
Para entender el proceso
de ionización, resulta muy
útil el observar el
resultado de la colisión
entre un electrón y una
molécula diatómica .
A excepción de la simple
excitación molecular, en
los demás casos se
originan procesos que
dan lugar a diversos tipos
de iones, bien positivos o
negativos, e incluso
múltiple ionización.
Independientemente de la
técnica que se utilice, los
métodos genéricos de
ionización son:
-Ionización directa con o
sin fragmentación
-Ionización indirecta por
formación de aductos
(Ionización Química).
Existen muy diversos
métodos de Ionización
para E. de Masas en
Química Orgánica.La
elección viene
determinada
fundamentalmente e base
a sus propiedades fisicas y
quimicas tales como su
estado de agregación,
solubilidad,volatilidad,
labilidad térmica,
estabilidad, peso
molecular, etc. Podemos
destacar, de entre los más
utilizados :
En la práctica ,los métodos de ionización mas comunes son: IMPACTO ELECTRÓNICO ó
ELECTROIONIZACIÓN (EI+/EI-)
En esencia consiste en el “bombardeo” de las sustancias que alcanzan la fuente a través de los sistemas de
introducción de muestras, con un haz de electrones de alta energía (usualmente 70eV). Este enorme energía
es suficiente para producir, por un lado, la ionización del compuesto entero (formación del ión molecular) y
además generar un cierto grado de fragmentación del mismo, lo que nos va a suministrar una
valiosa información acerca de su estructura .

El rango de pesos moleculares analizados mediante esta técnica de ionización alcanza hasta
aproximadamente 650 Da, puesto que moléculas mayores tienden a degradarse durante la vaporización.

IONIZACIÓN QUÍMICA (CI+ /CI-)

Su uso primario esta dirigido a potenciar la abundancia del ión molecular en aquellas sustancias en las que
su presencia en el espectro de EI es escasa o no aparece.

La Ionización química utiliza un gas ionizable (gas reactante) como el Metano, Isobutano, Amoniaco, etc,
como paso intermedio del proceso de ionizacion de los analitos. Como la relacción de gas presente a
muestra es muy elevada, la ionización se producirá preferente sobre aquel y posteriormente, debido a la alta
presión, a partir de reacciones ion-molécula se consigue la ionización de la muestra mediante reacciones de
transferencia protónica o reacciones de adición. Se obtiene asi una abundante cantidad de iones (M+H)+ .

Gráficamente, la diferencia entre estos dos procesos, se puede apreciar observando el siguiente esquema :
expresado en términos de
reacciones fisico-
quimicas lo podriamos
resumir como :
Los espectros obtenidos
para un mismo compuesto
por EI y CI difieren
considerablemente.
Mientras que por el
primer método se obtiene
una cierta fragmentación,
que será muy útil para el
análisis
estructural, con el
segundo, el experimento
se dirige a promover un
incremento sustancial de
la intensidad del ión
molecular del mismo.
La técnica FAB es un método de
ionizacion de los denominados blandos
(soft ionization). La ionización se
produce por intermedio de un haz de
alta energía a partir de átomos
acelerados de Xe ó Cs+ a 15 Kv. La
muestra se introduce en la fuente sobre
una sonda y mezclada con una matriz de
un material poco volátil, generalmente
gricerol, para facilitar la ionización y
que además sirve como amortiguador
de la alta energía incidente desde la
fuente de átomos rápidos.
En la ionizacion MALDI el analito es primero
co-cristalizado con un gran exceso de una
matriz, generalmente un ácido orgánico
débil, sensible a la luz UV. Cuando el haz
láser pulsante incide sobre la mezcla se
producen una serie de hoquedades sobre la
matriz que conducen a la vaporización de la
muestra. Una vez en fase gaseosa se
producen iones radicales de la matriz, que
actúa a su vez como fuente donadora de
protones o electrones, dependiendo del tipo
de ionización positiva o negativa que se haya
seleccionado.
En la ESI, los iones se generan directamente desde soluciones acuosas, orgánicas o
mezclas de ambos, mediante la formación de un spray de gotas muy pequeñas (asistido o
no neumáticamente con un gas auxiliar como He o Nitrógeno) en presencia de un fuerte
campo eléctrico, (valores entre 3 y 8 Kv son normales). Al disminuir las gotas de
tamaño, la densidad de carga eléctrica en su superficie aumenta. La mutua repulsión
entre cargas de igual signo en la superficie llega a ser tan grande que se superan las
fuerzas de cohesión superficial y los iones dejan las gotas en la forma que se conoce
como “cono de Taylor”, siendo dirigidas hacia el analizador mediante la aplicación de
vacíos crecientes, que van desde presion atmosférica en la introducción de la muestra,
hasta valores de vacío de 10-9 en la zona del analizador-detector. La vaporización de
estas gotas cargadas da lugar a la producción de iones con una o varias cargas pero
ahora ya en fase gaseosa (imprescindible para que “vuelen” hacia el analizador).
El número de cargas retenidas por un analito depende de factores como la composición
y pH del solvente sometido a electrospray y, por supuesto, de la naturaleza química de la
muestra (moléculas con centros de alta afinidad protónica, tenderán a retener mayor
número de cargas, como es el caso de péptidos y proteinas que pueden llegar a retener
100 o más cargas). Esto es una ventaja añadida, porque como un espectrómetro de
masas mide la relacción m/z, una proteina p.e., con un peso molecular de 200.000
Daltons, con 100 cargas, sería vista dentro del intervalo de entre 1 y 3000 uma, que es
un rango de masas muy corriente en casi todos los espectrómetros. Para pequeñas
moléculas, por el contrario, de menos de 2000 Daltons, la ESI genera iones con simple o
doble carga.
Se obtienen así señales que corresponden a iones del tipo (M+nH)n+ (obviamente
estamos hablando de soluciones acidificadas, que es lo usual, con porcentajes de entre
0.1 a 2% de un ácido como el AcH, HCOOH, etc, que suministran la carga protónica al
medio)
Similar a la electrospray , el efluente
líquido se introduce en a través de una
interfase muy similar a la utilizada allí. La
diferencia estriba en que el liquido
procedente del sistema
cromatográfico pasa a través de un
vaporizador calentado que facilita la rápida
desolvatación/vaporización de las gotas.
Las moléculas de analito y disolvente
atraviesan una región donde mediante una
corona de descarga se facilitan las
reacciones ión-molécula entre el analito y
los iones formados desde el disolvente en
fase vapor a presión atmosférica, con un
alto grado de eficiencia.
La transferencia protónica (protonación
[M+H]+ ) se produce en el modo de ApcI
positiva y la transferencia electronica (M –
H)- en el modo de APcI negativa. La
ionización por APcI se utiliza ampliamente
en la industria farmacéutica para el análisis
de compuestos no volátiles y de relativa
baja polaridad de hasta 1200 Daltons y
para aplicaciones en general, en sistemas
combinados CL-EM, con sustancias puras o
mezclas de características como las
descritas.
 Como su propio nombre indica,la fuente de ionización, es la parte del instrumento donde se produce la transformación
de las moléculas neutras en iones.

En el modo de ionización por impacto electrónico o electroionización, esto se lleva a cabo mediante un haz de electrones
de alta energía ( 12 a 70 eV ) producido por un filamento incandescente.

Una placa (trap) situada frente al origen del haz, y a tension positiva se encarga de recoger la corriente de electrones y
dos pequeños imanes, situados a ambos lados del haz, evitan que se produzca dispersión del mismo dentro de la fuente
dando lugar a un haz homogéneo.
Cuando las moléculas entran en la fuente son ionizadas y fragmentadas,para posteriormente ser obligadas a salir
mediante la aplicación de un tensión de signo opuesto a una placa (repeller) que se sitúa perpendicularmente al campo
producido por los imanes (regla de la mano derecha). Este puzzle de iones es acelerado y dirigido hacia el analizador
mediante la aplicación de una tensión (1 a 8 Kv) entre la fuente y una rendija de amplitud variable situada a cero voltios.
Una serie de placas intermedias, a tensiones variables y ajustables, se encargan de dirigirlos hasta la entrada del
analizador donde serán separados en función de su relacción masa/carga (óptica electrónica) Además, dependiendo
de que la tension aplicada a la optica de extracción sea positiva o negativa, extraeremos los iones positivos o los negativos
(modo EI+ ó EI-)

EI+ El haz de electrones producido por el filamento

incide sobre la molécula. Este choque origina así un
segundo electrón, produciendo un ión, además de una
cierta energia adicional.
Esta energía adicional producida va a dar lugar a
vibraciones,rotaciones así como a ciertos tipos de
reordenamientos. El resultado final es la
fragmentación de la molécula.
CI+ Si introducimos una gran cantidad de
un gas reactante
(metano,amoníaco,isobutano,etc) junto
con la muestra, el proceso de EI se
producirá preferentemente sobre el gas.
Como consecuencia de esto se obtiene un
plasma de iones de gas reactante. Estos
iones pueden reaccionar con las
moléculas neutras, (M) dando lugar a
la formación de aductos de M con los
iones del gas. El resultado es un espectro
de masas con una muy baja
fragmentación y alta proporción de iones
(M+X)+
ANALIZADORES DE MASAS
Inmediatamente después del proceso de ionización, los iones en fase gaseosa
entran en la región del analizador, que es la zona del instrumento en donde
los iones, dentro del rango de masas seleccionado, son separados en base a
su relacción masa/carga. Esta parte del instrumento juega un importante
papel en cuanto a la precisión y exactitud de las masas a medir.
Los iones son aquí separados por campos magnéticos, eléctricos, de
radiofrecuencia, combinaciones de varios de ellos, o por medida del tiempo
de desplazamiento de los iones a lo largo de una distancia fijada
previamente.
Las propiedades físicas en que se basan los analizadores para medir las
masas están relaccionadas con laacción que ejerce un campo magnético,
eléctrico, de radiofrecuencia o combinaciones de varios de ellos sobre una
partícula cargada . Las modificaciones introducidas en su energía cinética ,
velocidad de desplazamiento, frecuencia de resonancia inducida, etc, son las
claves para el entendimiento de los procesos de separación de los iones.
Los analizadores mas ampliamente utilizados hoy día son los siguientes:
-Analizador de Cuadrupolo
El analizador de cuadrupolo consiste en cuatro
rodillos paralelos a los que se aplica una corriente
contínua (DC) sobre la que se superpone un
potencial de radiofrecuencia (RF). El campo creado
en los rodillos actúa a modo de filtro y determina
que iones alcanzarán el detector. Los iones, en esta
región de campo variable, oscilarán dependiendo
del campo de radiofrecuencia aplicado asi como de
su relación masa/carga, por lo que solo
determinados iones alcanzaran el detector. De este
modo, un espectro de masas se conseguirá
barriendo (scanning ) el campo RF dentro de un
rango de frecuencias.
El analizador de cuadrupolo es uno de los mas
extendidos hoy día.A su relativa sencillez se une una
alta tolerancia a vacíos relativamente pobres, rango
de masas de hasta 3000 Da que le hace muy
adecuado para ser acoplado a interfases de
cualquier tipo, incluida la ESI, para el análisis de
proteínas y biomoléculas y lo que es mas
importante, su relativo bajo costo. Su principal
desventaja es la imposibilidad de realizar análisis de
alta resolución, masas exactas,etc, así como su
limitación en cuanto a rango de masas.
Trampa Iónica (Quadrupole Ion Trap)
-

Concebido al mismo tiempo que el analizador de

cuadrupolo y por la misma persona (Wolfgang Paul,
Premio Nóbel ) su física es muy similar. Los iones
generados en la fuente son “atrapados”, durante un
cierto tiempo, en un campo de radiofrecuencia dentro
de un anillo toroidal situado entre dos electrodos
hiperbólicos.
Mediante la aplicación simultanea de corrientes DC y
RF se consigue “atrapar” y mantener dentro del anillo
central los iones procedentes de la fuente de iones. Una
vez allí, dichos iones pueden ser extraídos a voluntad
aplicando corrientes de radiofrecuencia variables hasta
valores de resonancia y expulsados a traves del anillo
de salida. La posición de los anillos exteriores puede ser
modificada para una mayor eficiencia de transmisión.
Un espectro de masas completo se obtiene mediante el
barrido de un rango de radiofrecuencia determinado.
Las trampas iónicas tienen usos y utilizaciones
similares a los cuadrupolos y está muy extendido su uso
como detectores de masas en sistemas CG-EM. Otra
aplicación muy extendida es la posibilidad de
utilizarlos en la técnica de masas-masas (MSn), puesto
que permite la extracción de iones individuales
(Parents Ions) que posteriormente pueden ser
fragmentados para análisis estructural ( Daughter Ions)
-Analizadores de Sector Magnético y Doble enfoque
Los analizadores de sector magnético y doble enfoque se basan en el
efecto que sobre una partícula cargada tienen un campo eléctrico y
un campo magnético. El primero, actúa sobre el haz de iones a modo
de filtro energético y es independiente de la masa del ión o de su
relacción masa/carga. Mediante este analizador se consigue colimar
los haces iónicos que emergen de la fuente en haces monoenergéticos
uniformes. Una vez conseguido esto, estos haces iónicos son
dirigidos a la entrada de un campo magnético sectorial . El campo
magnético sirve para separar los iones en base a su masa/carga y el
radio de curvatura descrito por ellos es una función del campo
magnetico (B) aplicado. Este campo magnético es generado por una
corriente de intensidad variable. Solo aquellos iones cuyo radio de
curvatura descrito coincida con el del sector magnetico alcanzarán el
detector. Un espectro de masas se consigue variando la intensidad (I)
aplicada al electroimán.
Se consigue asi, mediante la combinación de estos dos sectores, un
incremento del poder de resolución considerable, en contraposición
al pobre poder de resolución de sistemas con solo sector magnético.
Resoluciones del orden de 10.000 pueden ser obtenidas casi en
trabajos de rutina en los modernos instrumentos. Valores de
resolución de entre 30.000 y 50.000 son posibles en condiciones
óptimas de trabajo.
-Analizador de Transformada de Fourier (FTMS)
El analizador de Transformada de Fourier esta basado en la
acción que un campo magnético ejerce sobre una partícula
cargada (ión) girando en un campo de radiofrecuencia.
Mediante el primero, los iones son dirigidos al interior de una
caja donde giran decribiendo una orbita de diámetro reducido y
mínima frecuencia. Por aplicación de una señal de
radiofrecuencia (RF) los iones son excitados a describir órbitas
espirales de amplitud creciente. Llega un momento en que la
orbita descrita es tal que alcanza el diámetro igual a la distancia
de separación de dos electrodos detectores, momento en el cual
son detectados originando una imagen de corriente, que es
función directa de su relacción masa/carga. Esta imagen de
corriente es integrada mediante una transformada de Fourier y
convertida en una señal proporcional a su intensidad. El
espectro completo se obtiene mediante un barrido del campo de
radiofrecuencia aplicado que varia entre 8 KHz y 100 MHz.
La principal ventaja de este tipo de instrumentos esta en la
altísima precisión en la medida de masas ( 0.001 % y
superiores) y un poder de resolución casi ilimitado.Por el
contrario, el nivel de vacío es un parámetro crítico y su costo es
muy elevado.
-Analizador de Tiempo de Vuelo
(Time of Flight)
El analizador de tiempo de vuelo es, en cuanto a
fundamento, uno de los analizadores mas simples de los que se
utilizan hoy en día.
Se basa en la medida del tiempo que tardan los iones generados
y acelerados con igual energía en la fuente de iones,en alcanzar
un electrodo colector situado a una distancia prefijada. Como
los iones poseen la misma energía pero diferentes masas
alcanzarán el colector a diferentes tiempos, dependiendo de su
masa, carga y energía cinética.
En el pasado, y debido a las limitaciones de tipo electrónico
y de software, su uso fue muy limitado debido a su escaso poder
de resolución y rango de masas. No es de extrañar que durante
años este analizador estuviera poco menos que olvidado. Sin
embargo, en la última década, y debido precisamente a los
enormes avances en el campo de la microelectrónica y el
software ha recibido un increíble impulso,hasta el punto de que
actualmente, junto con los analizadores de cuadrupolo, es el
analizador más ampliamente utilizado
DETECCIÓN DE IONES
Tras la separación de los iones en el analizador, el último paso de la espectrometría
de masas consiste en la detección de los iones que proceden de aquél mediante la
conversión a señales eléctricas medibles que nos indiquen la presencia de los iones
así como su intensidad.
En términos generales la detección se basa fundamentalmente en la medida de la
intensidad o corriente generada por los electrones secundarios producidos por el
choque de los iones incidentes sobre superficies de materiales especificos (dínodos)
o la conversión de estos a señales lumínicas (fotones) . Los sistemas de detección
mas comúnmente empleados en espectrometría de masas son :

-Copa de Faraday:

La Copa de Faraday se basa en el principio de que si sobre una superficie incide una
partícula cargada el resultado es un flujo de electrones y por tanto se crea una
corriente. Un ión, al chocar sobre la superficie de un dínodo (material emisor de
particulas secundarias como el BeO, GaP ó CsSb) induce la emisión de electrones
secundarios de manera temporal. Esta emisión origina una corriente en la copa y da
lugar a una pequeña señal que puede ser amplificada. Este detector es
relativamente sensible pero muy robusto y de fácil diseño.
-Multiplicador de electrones
El multiplicador de electrones es uno de los detectores mas comúnmente empleados en
espectrometría de masas. Basado en el mismo principio que la copa de Faraday, consta
de una serie de dínodos dispuestos en cascada, de forma que cada emisión de
electrones de un dínodo es llevada al siguiente, con lo que se generan nuevos electrones
y así sucesivamente. El resultado es una corriente que se va amplificando hasta obtener
valores de ganancia de señal de hasta un millón de veces.
-Dínodos de alta energía
Los dínodos de alta energía usan un campo electrostático previo a un multiplicador
electrónico. Una vez que los iones entran en el campo, son acelerados en el
multiplicador, lo que produce mas electrones secundarios, los cuales, al ver
incrementada su energía originan una mayor intensidad de la señal de amplificación, lo
que se traduce en un aumento muy elevado de su sensibilidad.
-Detectores Diode Array
Un detector Diode Array es, esencialmente, un grupo de detectores dispuestos
paralelamente, de forma que permiten la detección simultánea de varios iones con
diferente relación m/z, después de salir del analizador magnético, que no necesita ser
barrido (scanning). Es un detector muy útil en trabajos que requieren alta sensibilidad,
aunque por el contrario, solo puede ser usado en un pequeño rango de masas.
-Detectores Inductivos
-Fotomultiplicadores
 El espectro de masas se presenta habitualmente como un gráfico de barras, en la
que cada una de ellas corresponde a un ión. La información proporcionada incluye
la relación m/z y la intensidad relativa de cada señal. A la más intensa, denominada
pico base, se le asigna el valor 100. Como la mayor parte de los iones formados
tiene carga unidad, las relaciones m/z se correspondes con sus masas. El ión
molecular es el ión que resulta tras la pérdida de un electrón por parte de la
molécula.
Espectro de masas del n-decano
 Espectro de masas del alcohol bencílico

En este caso el pico correspondiente al ión molecular es intenso (m/z=108). La

pérdida del grupo -OH explica el pico de m/z=91(muy común en los alquilbencenos).
La pérdida del grupo -CH2OH (31 unidades) explica el pico de m/z=77 (catión fenilo).
Los pequeños picos a 109 y 110 están provocados por la presencia de 13C en la muestra