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á561ñ ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

MUESTREO
Con el fin de reducir el efecto de la desviación sistemática de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es
necesario asegurar que la composición de la muestra usada sea representativa de la partida de material que está siendo
examinada. Los procedimientos de muestreo siguientes son el mínimo que se considera aplicable a artículos de origen vegetal.
Algunos artículos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos más rigurosos que involucren el muestreo de más envases o
de más muestras por envase.
Muestra Bruta
Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homogénea, tomar
muestras individuales del número de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuación. Cuando la partida
no se puede considerar homogénea, dividirla en subpartidas que sean tan homogéneas como sea posible y, a continuación,
muestrear cada una como una partida homogénea. Cuando el número de envases en la partida (N) es 11 o más y cada envase
de la partida está marcado en orden con un número o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero,
intermedio y último.
N.º de Envases N.º de Envases

en la Partida (N) que Deben Ser Muestreados (n)
l
1–10 Todos
11–19
>19
(Redondear “n” al siguiente número entero más alto.)

ia 11
n = 10 + (N/10)
fic
Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar está formado
por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensión, y en el caso de todos los materiales molidos o en
polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del
envase, tomando no menos de dos centros desde ángulos diferentes. Para materiales con partes componentes de más de 1 cm
en cualquier dimensión, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben
tomar a una profundidad de 10 cm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las capas
interiores.
O
Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo
cuidado de no aumentar el grado de fragmentación ni de afectar significativamente el contenido de humedad.
Para artículos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las
pruebas. Para artículos en envases que contienen 1–5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del
envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras y
retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen más de 5 kg, retirar tres muestras, de modo
que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las muestras y
retirar una porción suficiente para realizar las pruebas.
Muestra de Laboratorio
Preparar la Muestra de Laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta.
[NOTA—La reducción de muestra por cuarteo consiste en la distribución pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en
la forma de un cuadrado, y la posterior división por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes
opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite según sea necesario hasta obtener la cantidad requerida.]
La Muestra de Laboratorio debe ser de un tamaño suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.
Muestra de Prueba
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la
Muestra de Prueba según se indica a continuación.
Reducir por cuarteo el tamaño de la Muestra de Laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
continúe siendo representativa. En el caso de artículos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de
modo que pase a través de un tamiz de malla estándar N.º 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede
moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo haciéndolo rodar sobre un papel o paño de muestreo,
extenderlo hasta formar una capa delgada y retirar la porción para analizar.
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MÉTODOS DE ANÁLISIS
Materia Orgánica Extraña

MUESTRA DE PRUEBA
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, pesar las cantidades siguientes de la Muestra de
Laboratorio, teniendo cuidado de que la porción tomada sea representativa (reducir la muestra por cuarteo si fuera necesario).
Raíces, rizomas, corteza y hierbas 500 g
Hojas, flores, semillas y frutos 250 g
Cortar los fármacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g) 50 g
Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgánica extraña tanto como sea posible.
Pesar y determinar el porcentaje de materia orgánica extraña en el peso del artículo tomado.
Cenizas Totales
Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba que represente 2–4 g del material e incinerar,
suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 ± 25°, hasta que no quede carbón y determinar el
peso de la ceniza. [NOTA—Para productos botánicos, se debe usar un material que cumpla con la prueba de Pérdida por Secado
l
en las monografías individuales.] Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, extraer la masa carbonizada con agua
ia
caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro sin cenizas, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la ceniza
quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporarlo hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de 675
± 25°. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, enfriar el crisol, agregar 15 mL de alcohol, deshacer la ceniza
con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 ± 25°. Enfriar en un desecador,
pesar la ceniza y calcular el porcentaje de cenizas totales con referencia al peso del artículo tomado.
fic
Cenizas Insolubles en Ácido
Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 mL de ácido clorhídrico
3 N durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro sin cenizas, lavar con agua caliente,
incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en ácido calculada con referencia al peso del artículo tomado.
Cenizas Solubles en Agua

O
Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica en Cenizas Totales con 25 mL de agua durante 5 minutos. Recoger
la materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro sin cenizas. Lavar con agua caliente e incinerar
durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450°. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en Cenizas
Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra según se determinó en Cenizas
Totales.
Extractos Solubles en Alcohol

MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE)
Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapón de vidrio. Agregar 100 mL de alcohol y pesar el matraz. Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un
condensador de reflujo al matraz y calentar a ebullición suave durante 1 hora, enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original
con alcohol. Agitar y filtrar rápidamente a través de un filtro seco. Transferir 25 mL del filtrado a una cápsula tarada de fondo
plano y evaporar en un baño de agua hasta sequedad. Secar a 105° durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30
minutos y pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba.
MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)

Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapón de vidrio. Agregar 100 mL de alcohol, tapar el matraz y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante
las primeras 8 horas y, a continuación, dejar en reposo. Filtrar rápidamente, procurando no perder alcohol. Evaporar 25 mL del
filtrado hasta sequedad en una cápsula tarada, poco profunda y de fondo plano, y secar a 105° hasta peso constante. Calcular
el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba.
(EST)
3
Extractos Solubles en Agua

MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE)
Proceder según se indica en el Método 1 (Método de Extracción en Caliente) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que
se debe usar agua en lugar de alcohol.
MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)

Proceder según se indica en el Método 2 (método de extracción en frío) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se
debe usar agua en lugar de alcohol.
Fibra Cruda
Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del material, con éter. Agregar
200 mL de ácido sulfúrico diluido en ebullición (1 en 78) al residuo agotado con éter, en un matraz de 500 mL, y conectar el
matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego
pasar a través de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente
ya no sea ácido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 mL de solución de hidróxido de sodio en ebullición,
ajustada a 1,25% por valoración volumétrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante 30
minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rápidamente a través de un filtro tarado, lavar el residuo con agua
hirviendo hasta que el último lavado sea neutro y secar a 110° hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso
constante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 110° y el de la
l
ceniza representa el peso de fibra cruda.
[NOTA—La ebullición con ácido y álcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momento
ia
en que el líquido (que se enfría por debajo del punto de ebullición al agregarlo al matraz frío) vuelve a alcanzar su punto de
ebullición. Después de llevar la solución al punto de ebullición, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la
ebullición. Durante la ebullición, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solución toda
partícula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la operación
de ebullición ayuda a evitar la formación excesiva de espuma.]
fic
Contenido de Almidón
MÉTODO 1
El siguiente es un procedimiento general para todos los azúcares reductores y se puede utilizar para determinar el contenido
de almidón en artículos botánicos.
O
Extracto de Malta: Usar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar. Preparar
el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g de malta
molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTA—Si se usa un mezclador eléctrico, mezclar durante
20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la infusión.
Solución de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 10 mL
de éter, usando un filtro que retenga completamente el gránulo de almidón más pequeño. Dejar evaporar el éter del residuo y
lavar con 250 mL de solución de alcohol acuosa (10 en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un vaso
de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60° (evitando, si es posible,
gelatinizar el almidón) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr una
disolución completa de los azúcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco de
agua tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora.
Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el
precipitado con porciones sucesivas de 50 mL de solución de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a través de un
filtro adecuado hasta que los lavados estén exentos de azúcar. [NOTA—Para comprobar la presencia de azúcar, transferir unas
gotas de los lavados a un tubo de ensayo y agregar 3 ó 4 gotas de una solución de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por
disolución de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede
uniforme, dejar fluir entre 2–4 mL de ácido sulfúrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posición
vertical. Si hay presencia de azúcar, la interfase de los dos líquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar toda
la solución se torna violeta azulado.]
Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua.
Sumergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice
todo el almidón. Enfriar el vaso de precipitados a 55°, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura
durante 1 hora. Volver a calentar a ebullición durante algunos minutos, enfriar a 55°, agregar 20 mL de Extracto de Malta y
mantener a esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado
en el examen microscópico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar.
Procedimiento general: Transferir 200 mL de la Solución de prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo,
agregar 20 mL de ácido clorhídrico y calentar en un baño de agua hirviendo durante 2,5 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro
con hidróxido de sodio SR, completar la neutralización con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y
filtrar. El volumen de la alícuota tomada depende del contenido de almidón de la muestra en análisis (ver la Tabla 1). La alícuota
debería contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de 400 mL
resistente a los álcalis, agregar 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y
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calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la ebullición
durante 2 minutos exactos. Pasar la solución caliente de inmediato a través de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar
minuciosamente el precipitado de óxido cuproso con agua aproximadamente a 60°, luego con 10 mL de alcohol y finalmente
con 10 mL de éter.
Tabla 1. Determinación de la Alícuota Óptima

Contenido de Almidón Esperado Alícuota
(%) (mL)
60 25
50 35
40 50
30 50
20 50
Para soluciones de azúcares reductores de relativamente alta pureza, proceder según se indica en el Método 1A para
determinar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el óxido cuproso seco. Para soluciones de azúcares reductores que
contienen grandes cantidades de impurezas orgánicas, incluida sacarosa, proceder según se indica en el Método 1B para
determinar la cantidad de cobre reducido obtenido por valoración volumétrica con tiosulfato de sodio.
Método 1A: Secar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 110 ± 2°, enfriar a
temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg,
correspondiente al peso del óxido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidón
l
por la siguiente fórmula:
ia
Porcentaje de dextrosa = (peso de dextrosa en mg × 0,1 × 500)/(peso de la muestra en g × alícuota en mL)
Contenido de almidón = % de dextrosa × 0,9
Tabla 2. Cálculo de Dextrosa [Aplicable cuando se pesa directamente Óxido Cuproso (Cu2O)] (Expresado en mg)
fic
Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa
Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco-
(Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa)
10 4,0 90 38,9 170 75,1 250 112,8 330 152,2 410 193,7
12 4,9 92 39,8 172 76,0 252 113,7 332 153,2 412 194,7
14 5,7 94 40,6 174 76,9 254 114,7 334 154,2 414 195,8
O
16 6,6 96 41,5 176 77,8 256 115,7 336 155,2 416 196,8
18 7,5 98 42,4 178 78,8 258 116,6 338 156,3 418 197,9
20 8,3 100 43,3 180 79,7 260 117,6 340 157,3 420 199,0
22 9,2 102 44,2 182 80,6 262 118,6 342 158,3 422 200,1
24 10,0 104 45,1 184 81,5 264 119,5 344 159,3 424 201,1
26 10,9 106 46,0 186 82,5 266 120,5 346 160,3 426 202,2
28 11,8 108 46,9 188 83,4 268 121,5 348 161,4 428 203,3
30 12,6 110 47,8 190 84,3 270 122,5 350 162,4 430 204,4
32 13,5 112 48,7 192 85,3 272 123,4 352 163,4 432 205,5
34 14,3 114 49,6 194 86,2 274 124,4 354 164,4 434 206,5
36 15,2 116 50,5 196 87,1 276 125,4 356 165,4 436 207,6
38 16,1 118 51,4 198 88,1 278 126,4 358 166,5 438 208,7
40 16,9 120 52,3 200 89,0 280 127,3 360 167,5 440 209,8
42 17,8 122 53,2 202 89,9 282 128,3 362 168,5 442 210,9
44 18,7 124 54,1 204 90,9 284 129,3 364 169,6 444 212,0
46 19,6 126 55,0 206 91,8 286 130,3 366 170,6 446 213,1
48 20,4 128 55,9 208 92,8 288 131,3 368 171,6 448 214,1
(EST)
5
Tabla 2. Cálculo de Dextrosa [Aplicable cuando se pesa directamente Óxido Cuproso (Cu2O)] (Expresado en mg)
(continuación)
Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa
Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco- Cuproso (D-Gluco-
(Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa) (Cu2O) sa)
50 21,3 130 56,8 210 93,7 290 132,3 370 172,7 450 215,2
52 22,2 132 57,7 212 94,6 292 133,2 372 173,7 452 216,3
54 23,0 134 58,6 214 95,6 294 134,2 374 174,7 454 217,4
56 23,9 136 59,5 216 96,5 296 135,2 376 175,8 456 218,5
58 24,8 138 60,4 218 97,5 298 136,2 378 176,8 458 219,6
60 25,6 140 61,3 220 98,4 300 137,2 380 177,9 460 220,7
62 26,5 142 62,2 222 99,4 302 138,2 382 178,9 462 221,8
64 27,4 144 63,1 224 100,3 304 139,2 384 180,0 464 222,9
66 28,3 146 64,0 226 101,3 306 140,2 386 181,0 466 224,0
68 29,2 148 65,0 228 102,2 308 141,2 388 182,0 468 225,1
l
70 30,0 150 65,9 230 103,2 310 142,2 390 183,1 470 226,2
72 30,9 152 66,8 232 104,1 312 143,2 392 184,1 472 227,4
74
76
78
31,8
32,7
33,6
154
156
158
67,7
68,6
69,5
234
236
238
105,1
106,0
107,0ia 314
316
318
144,2
145,2
146,2
394
396
398
185,2
186,2
187,3
474
476
478
228,3
229,6
230,7
fic
80 34,4 160 70,4 240 108,0 320 147,2 400 188,4 480 231,8
82 35,3 162 71,4 242 108,9 322 148,2 402 189,4 482 232,9
84 36,2 164 72,3 244 109,9 324 149,2 404 190,5 484 234,1
86 37,1 166 73,2 246 110,8 326 150,2 406 191,5 486 235,2
O
88 38,0 168 74,1 248 111,8 328 151,2 408 192,6 488 236,3
Método 1B
SOLUCIÓN DE TIOSULFATO DE SODIO: Transferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico
de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO: Disolver 42 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua.
SOLUCIÓN DE ACETATO DE SODIO: Disolver 5,74 g de acetato de sodio en 10 mL de agua.
SOLUCIÓN DE COBRE: Transferir aproximadamente 0,3 g de cobre electrolítico puro, pesados con exactitud, a un matraz de
250 mL, agregar 5 mL de ácido nítrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 mL de agua y calentar a ebullición
para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y calentar a ebullición hasta eliminar completamente
el bromo. Enfriar, agregar 10 mL de Solución de acetato de sodio seguidos de 10 mL de Solución de yoduro de potasio y valorar
con la Solución de tiosulfato de sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidón SR para producir un
marcado color azul y continuar con la valoración. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de potasio y
mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoración hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un mL de
Solución de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 10 mg de cobre. [NOTA—Es esencial que la concentración de la
Solución de yoduro de potasio se regule cuidadosamente. Si la solución contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la
volumetría, agregar 4,2–5 g de yoduro de potasio para obtener una solución total de 100 mL. Si hay presentes cantidades
mayores de cobre, agregar lentamente Solución de yoduro de potasio desde una bureta con agitación constante en cantidades
proporcionalmente mayores.]
PROCEDIMIENTO: Lavar con agua el precipitado de óxido cuproso obtenido en el Procedimiento general, cubrir este filtro con
un vidrio de reloj y disolver el óxido cuproso con 5 mL de ácido nítrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj.
Recoger el filtrado en un matraz de 250 mL, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz.
Calentar a ebullición el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y
calentar a ebullición hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder según se indica en Solución de cobre
comenzando donde dice “agregar 10 mL de Solución de acetato de sodio”. A partir del volumen de Solución de tiosulfato
de sodio consumido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicándolo por 1,1259 para obtener el peso, en mg, de óxido
cuproso. Basándose en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de óxido cuproso. El
contenido de almidón equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinación con un
blanco usando 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR y 50 mL de Extracto de malta. Si el peso del óxido cuproso así obtenido
excede 0,5 mg, corregir el resultado de la determinación de forma adecuada. [NOTA—El tartrato cúprico alcalino SR se deteriora
en reposo y la cantidad de óxido cuproso obtenida en la determinación con un blanco aumenta.]
(EST)
6
MÉTODO 2
El método siguiente es específico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede explicar las
diferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no varían en
más de 2%.
Solución de glucoamilasa: Preparar una solución de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales (UI)/
mL. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra de
prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI.
Solución amortiguadora de acetato: Disolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 mL de agua, agregar 12,0 mL de ácido
acético glacial y mezclar. El pH de esta solución es 4,8.
Solución amortiguadora de fosfato: Disolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobásico de
sodio en 50,0 mL de agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37°, diluir con agua hasta 100,0 mL y
mezclar. [NOTA—El pH del medio de la solución amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH deseado a
la temperatura que se utilizará durante la incubación.]
Solución enzimática: Disolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo II de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo I de rábano
picante) y 10 mg de ferrocianuro de potasio en 100 mL de Solución amortiguadora de fosfato. [NOTA—Esta mezcla se puede
almacenar en un refrigerador durante un período de hasta 10 días.]
Ácido sulfúrico 18 N: Agregar lentamente, mezclando, 54 mL de ácido sulfúrico a 102 mL de agua, dejar que se enfríe a 25° y
mezclar.
Soluciones estándar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solución que
contenga 1,0 mg/mL de ER Dextrosa USP. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solución en agua para obtener
las Soluciones Estándares A, B, C, D y E, con concentraciones conocidas de 10, 20, 25, 40 y 50 µg/mL de ER Dextrosa USP,
respectivamente. [NOTA—Esperar 4 horas para que termine la mutarrotación antes de usar.]
l
Soluciones de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25 mL
de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en una estufa de aire a 105° durante
ia
aproximadamente 8 horas. [NOTA—Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibirá la glucoamilasa.] Enfriar y
transferir el matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de
prueba, pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 mL de agua y ajustar con ácido fosfórico a un pH
entre 5,0–7,0; si fuera necesario. Calentar a ebullición la suspensión durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a
un autoclave y calentar a 135° durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura próxima a 55° y agregar
fic
2,5 mL de Solución amortiguadora de acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solución a 45 ± 1 g. Sumergir el
matraz en un baño de agua mantenido a 55 ± 1° y agregar 5 mL de Solución de glucoamilasa. Agitar el matraz por rotación
suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrólisis, pasar a través de un papel de filtro a un matraz volumétrico
de 250 mL, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con agua a
volumen y mezclar. Transferir 1 mL de una alícuota que contenga entre 20–60 µg de D-glucosa a cada uno de cinco tubos de
ensayo. [NOTA—Para obtener el intervalo de concentración de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente con agua a
volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 mL de Solución Enzimática a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colocarlos en la
oscuridad a 37 ± 1° durante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 minutos, agregar
O
2 mL de Ácido sulfúrico 18 N a cada uno de los tubos de ensayo para detener la reacción y mezclar.
Solución control: Transferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidón a un matraz tarado
previamente y proceder según se indica en Soluciones de prueba, comenzando donde dice “agregar 25 mL de agua y ajustar el
pH con ácido fosfórico”.
Procedimiento: Determinar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones estándar y las Soluciones de prueba a la
longitud de onda de absorbancia máxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando la
Solución control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones estándar en función
de la concentración, en µg/mL, de dextrosa, y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A partir
de la gráfica, determinar la concentración, C, en µg/mL, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba y calcular la
concentración promedio, en µg/mL, de la solución en análisis. El porcentaje del contenido de almidón en el peso de la muestra
de prueba tomada se calcula por la fórmula:
(0,9C/106) × V1 × (250/V0)(100/E)(100/W) = 2,25CV1/V0EW
C = concentración promedio de dextrosa en las Soluciones de prueba (µg/mL)

V1 = volumen de la Solución de prueba si se realiza una dilución adicional (mL) (ver Nota 2 en Soluciones de prueba)
V0 = volumen de la alícuota tomada del matraz volumétrico de 250 mL (mL)
E = peso de la muestra de prueba (g)
W = porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba
[NOTA—V0 es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilución adicional.]
Determinación de Aceite Volátil

Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magnético.
Introducir en el matraz una barra de agitación magnética de forma ovoide y acoplar un condensador de camisa fría por agua y
una trampa para aceite volátil apropiada del tipo que se ilustra (ver la Figura 1).
(EST)
7
l
ia
fic
O
Figura 1. Trampas para Aceite Volátil
Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del material para producir 1–3 mL de aceite volátil. Normalmente no es
necesario triturar semillas, frutos pequeños u hojas partidas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no fuera
posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrín purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del
artículo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecuado.
Calentar a ebullición el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullición suave durante
2 horas, o hasta que el aceite volátil se haya separado completamente del material y ya no se recoja en el tubo graduado del
separador.
Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite volátil en el tubo graduado del separador, se puede leer en décimos de
1 mL, y se puede calcular el volumen de aceite volátil por cada 100 g de material usando el peso del artículo tomado para el
análisis. Las graduaciones en el separador “para aceites más pesados que el agua” se colocan de manera que el aceite
permanezca por debajo del condensado acuoso que fluye automáticamente de regreso al matraz.
Contenido de Agua
Para materiales sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 10 g de la Muestra de Laboratorio
cortando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los
frutos más pequeños de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar que
no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparación y que la porción tomada sea representativa de la
Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua según se indica en Determinación de Agua á921ñ, Método III
(Gravimétrico), Procedimiento para Artículos de Origen Botánico.
(EST)
8
PRUEBA DE AFLATOXINAS
[PRECAUCIÓN—Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales
que contienen aflatoxinas.]
Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para aflatoxina B1 (AFB1) y no más de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2). Se puede
usar un enfoque basado en el riesgo de contaminación para determinar el alcance de la prueba. Al determinar el cumplimiento,
se considera la presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan los siguientes procedimientos analíticos para determinar
el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método I. Si la aptitud del
sistema no cumple con los requisitos, usar el Método II o el Método III.
Método I
La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 en cualquier material de origen
vegetal.
REACTIVO DE ACETATO DE CINC–CLORURO DE ALUMINIO

Disolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua suficiente para obtener 100 mL.
SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO
l
Disolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua.
ia
SOLUCIÓN DE PRUEBA 1
Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximadamente 50 g pesados
con exactitud de material en polvo a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3).
Agitar mecánicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA—Si la solución contiene pigmentos
vegetales que interfieren, proceder según se indica para la Solución de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del filtrado y
fic
recoger la porción siguiente de 40 mL. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 40 mL de Solución de
Cloruro de Sodio y 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa
inferior a un segundo embudo de separación. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separación, cada vez con
25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica
inferior y recoger las capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Evaporar el disolvente orgánico en un
baño de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de
agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica para Procedimiento de limpieza en
O
Solución de Prueba 2. De lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y
acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si fuera necesario.
Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 mL. Agregar 20 mL de Reactivo
de Acetato de Cinc–Cloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g de un
coadyuvante de filtración adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar los primeros 50 mL del
filtrado y recoger la porción siguiente de 80 mL. Proceder según se indica para la Solución de Prueba 1, comenzando donde
dice “Transferir el filtrado a un embudo de separación”.
Procedimiento de limpieza: Colocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapón de lana de vidrio en el
fondo de un tubo cromatográfico de 10 mm × 300 mm. Preparar una suspensión espesa de 2 g de gel de sílice con una mezcla
de éter etílico y éter de petróleo (3:1), verter la suspensión espesa en la columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de
disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de
sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar
el matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una velocidad
de no más de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de éter de petróleo, 3 mL de éter etílico y 3 mL de cloruro
de metileno; eluir a una velocidad de no más de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una mezcla
de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no más de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda de vacío.
Recoger este eluato en un vial pequeño, agregar una perla de ebullición si fuera necesario y evaporar hasta sequedad en un
baño de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si
fuera necesario.
Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC en Solución de Prueba
en Método II.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE AFLATOXINAS

[PRECAUCIÓN—Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.]
(EST)
9
Preparar una Solución Estándar de Aflatoxinas que contenga AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 a 2,0; 0,50; 2,0 y 0,50 µg/mL,
respectivamente, en acetonitrilo, según se indica a continuación. Preparar primero soluciones madre de
aflatoxinas AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 individuales en acetonitrilo, cada una con una concentración nominal de 10 µg/mL.1
Determinar la concentración de cada solución madre de aflatoxinas midiendo la absorbancia (A) a una longitud de onda de
máxima absorción cerca de 360 nm y usando la ecuación:
Aflatoxina (µg/mL) = (A × Mr × 1000)/ε
A = absorbancia
Mr = peso molecular
ε = absortividad molar (ver la Tabla 3)
Tabla 3. Pesos Moleculares y Absortividades Molares de Aflatoxinas

Peso Molecular Absortividad Molar
Aflatoxina (Mr) Disolvente (ε)
AFB1 312 Acetonitrilo 20700
AFB2 314 Acetonitrilo 22500
AFG1 328 Acetonitrilo 17600
AFG2 330 Acetonitrilo 18900
Por último, para obtener la Solución Estándar de Aflatoxinas, transferir un volumen exacto de cada solución madre de
l
aflatoxinas al mismo matraz volumétrico y diluir con acetonitrilo a volumen. Calcular la concentración de cada aflatoxina en la
Solución Estándar de Aflatoxinas:
CAF
C′AF
ia
CAF = C′AF × VTS/VAF
= concentración de la aflatoxina pertinente en la Solución Estándar de Aflatoxinas

= concentración de la aflatoxina pertinente en la solución madre correspondiente, según se determinó anteriormente
fic
VTS = volumen del matraz volumétrico usado para preparar la Solución Estándar de Aflatoxinas final
VAF = volumen de cada solución madre de aflatoxinas individual transferida al matraz volumétrico usado para preparar
la Solución Estándar de Aflatoxinas
Almacenar en un refrigerador. Equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso.
SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS
O
Diluir la Solución Estándar de Aflatoxinas con acetonitrilo para obtener una solución con una concentración de 0,4 µg/mL
de AFB1 y de AFG1, y 0,1 µg/mL de AFB2 y de AFG2.
Procedimiento
Aplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 10 µL de la Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 10 µL de la Solución de Prueba 1,
Solución de Prueba 2, o Solución de Prueba 3 a una placa para TLC adecuada (ver Cromatografía á621ñ) recubierta con una capa
de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm. Superponer 5 µL de la Solución de Aflatoxinas a una de las tres
aplicaciones de 10 µL de la Solución de Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma en una cámara
no saturada que contenga una fase móvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y alcohol isopropílico (85:10:5)
hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 15 cm desde el origen. Retirar la placa de la cámara de desarrollo,
marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Localizar las manchas en la placa bajo luz UV a 365 nm.
APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas
claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que coincide en tono y ubicación con aquéllas de la
Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de
menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente.
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
Ninguna mancha de las aplicaciones de la Solución de Prueba corresponde a las manchas obtenidas con las aplicaciones de
la Solución de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solución de Prueba, comparar la ubicación de cada
mancha fluorescente de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxina presente.
La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solución de Prueba, cuando se compara con la de la aflatoxina
correspondiente en la Solución de Aflatoxinas representa la concentración aproximada de aflatoxina en la Solución de Prueba.
para AFB1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2, a menos que se especifique algo diferente.
1 Sepueden obtener estándares de aflatoxinas individuales adecuados en Romer Labs, número de catálogo 001012, 001013, 001014, 001015; y en
Sigma-Aldrich, número de catálogo A6636, A9887, A0138, A0263.
(EST)
10
Método II
SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO
Ver el Método I.
SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar una solución amortiguadora de fosfato 10 mM que contenga cloruro de sodio 0,138 M y cloruro de potasio
0,0027 M en agua, y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4.2
COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD
Antes de acondicionar, equilibrar la columna de inmunoafinidad (IAC, por sus siglas en inglés) a temperatura ambiente. Para
acondicionar, aplicar 10 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a través de la columna
por gravedad a una velocidad de 2–3 mL/min. Dejar 0,5 mL de la Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la parte superior
de la columna hasta que se aplique la Solución de Prueba.
SOLUCIÓN DE PRUEBA
Extracción de la muestra: Transferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exactitud, a
un matraz con tapón de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3). Agitar mecánicamente en forma
vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de
l
4 mL. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 4 mL de Solución de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano y
agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separación.
ia
Extraer la capa acuosa en el embudo de separación dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando durante
1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica inferior, y recoger las capas orgánicas combinadas
en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. Evaporar el disolvente orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un
tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias en el
residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo obtenido
fic
anteriormente en 200 µL de acetonitrilo y agitar mecánicamente, si fuera necesario.
Procedimiento de limpieza con IAC: Disolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metanol y agua (6:4) y luego diluir con
5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 10 mL de Solución Salina
Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metanol. Evaporar el eluato con nitrógeno y disolver el residuo en 200
µL de acetonitrilo.
SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS
O
[PRECAUCIÓN—Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.]

Diluir la Solución Estándar de Aflatoxinas con acetonitrilo para obtener una solución que contenga 0,04 µg/mL de AFB1 y
de AFG1, y 0,01 µg/mL de AFB2 y de AFG2.
Análisis
Aplicar por separado 5; 7,5 y 10 µL de Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 10 µL de la Solución de Prueba a una placa
para HPTLC adecuada (ver Cromatografía á621ñ) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 200
µm. Superponer 5 µL de Solución de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 10 µL de la Solución de Prueba. Dejar que
las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cámara saturada que contenga una fase móvil constituida por
una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 72 mm
desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase
móvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa mediante el barrido de la densidad
de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicación de cada mancha fluorescente de la Solución de
Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La concentración de aflatoxinas en
la Solución de Prueba se puede calcular a partir de la curva de calibración obtenida de los datos de barrido con Solución de
Aflatoxinas.
APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente.
Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que coincida en tono y ubicación con las de Solución de
Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de menor
intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente. La recuperación media de la cantidad agregada conocida
de AFB1 y AFG1 es no menos de 70%.
2 Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-3813.
(EST)
11
Método III
Se proporciona este método de prueba como un ejemplo para la detección de la presencia posible de AFB1 y de aflatoxinas
totales (AF: suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2). Se ha demostrado que este método es adecuado para ginseng y jengibre en
polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artículos de origen botánico.
SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO 0,1 M

Disolver 8,69 g de fosfato disódico anhidro y 4,66 g de fosfato monosódico anhidro o 5,36 g de fosfato monosódico
monohidrato en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4, agregar 10 mL de polisorbato 20, y diluir
con agua hasta 1 L.
SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar según se indica en el Método II.
SOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO DE AFLATOXINAS

Preparar seis soluciones diluyendo volúmenes adecuados de Solución Estándar de Aflatoxinas con metanol y agua (1:1). Las
concentraciones finales de aflatoxinas en cada Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas se presentan en la Tabla 4. Almacenar
en un refrigerador y equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las soluciones en el día de su uso.
Tabla 4. Preparación de Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas
l
Soluciones Concentración Final de Aflatoxinas de la Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas (ng/mL)
Estándar de
Trabajo de
Aflatoxinas
1
2
Solución Estándar de Aflato-
xinas (µL)
0
12,5
AFB1
0,25 ia AFB2
0,0625
AFG1
0,25
AFG2
0,0625
ΣAF
0
0,625
fic
3 25 0,5 0,125 0,5 0,125 1,25
4 50 1 0,25 1 0,25 2,5
5 100 2 0,5 2 0,5 5
6 200 4 1 4 1 10
COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD3
O
Usar una IAC que contenga anticuerpos monoclonales de reactividad cruzada con AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2. Las columnas de
inmunoafinidad tienen una capacidad mínima de no menos de 100 ng de aflatoxinas totales y proporcionan una recuperación
de no menos de 80% para AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 cuando se aplican 5 ng de AFB1, de AFB2, de AFG1 y de AFG2 en 10 mL de
metanol al 10% en Solución Salina Amortiguada con Fosfato (v/v).
SOLUCIÓN DE PRUEBA
Extracción: Pesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrífuga de 50 mL. Agregar 1 g de cloruro de
sodio y 25 mL de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (7:3). Mezclar en un mezclador de vórtice hasta que
las partículas de muestra y el disolvente de extracción se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 10 minutos. Centrifugar
durante 10 minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s2) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos firme.
Pipetear y transferir de inmediato 7 mL a un tubo de centrífuga de 50 mL, agregar 28 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato
0,1 M, mezclar y filtrar a través de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 mL del filtrado (equivalente a 1 g de la muestra
de prueba) en una probeta graduada de 25 mL y proceder inmediatamente con la cromatografía de IAC.
Limpieza mediante IAC: [NOTA—Para la limpieza mediante IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente
durante al menos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente.
Retirar la tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermético). Dejar que el líquido
pase a través de la columna hasta dejar aproximadamente 2–3 mm de líquido por encima del lecho de la columna. Transferir
los 25 mL del filtrado, obtenido en Extracción, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a través de la columna por
gravedad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar
aproximadamente 2 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de
solvente, lavar la columna con 3 mL adicionales de Solución Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 mL de agua (se puede
agregar 5 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan otras
técnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facilidad).
Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 mL de aire a través de la columna con una jeringa. Eluir con 1 mL de metanol y
recoger los analitos en un matraz volumétrico de 3 mL, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la columna se seque.
Dejar en reposo durante 1 minuto, luego eluir con 1 mL adicional de metanol, y recoger en el mismo matraz volumétrico. Dejar
3 Columna de AflaOchraTest (G1017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
(EST)
12
que la columna se seque y forzar 10 mL de aire a través de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen. Usar esta dilución
como la Solución de Prueba y realizar el análisis de aflatoxinas de inmediato.
SOLUCIÓN DE APTITUD DEL SISTEMA

Preparar una muestra adicionada, agregando 5 mL de Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g,
repitiendo el procedimiento para la Solución de Prueba, usando 20 mL en lugar de 25 mL de la mezcla de metanol y bicarbonato
de sodio al 0,5% (700:300).
SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Detector: Fluorescencia; longitud de onda de excitación (Ex) a 362 nm y longitud de onda de emisión (Em) a 440 nm.
Columna: 4,6 mm × 15 cm; relleno L1 de 3 µm
Velocidad de flujo: 0,8 mL/minuto
Fase móvil: Isocrática
Para derivatización post-columna con celda fotoquímica:4 Agua, metanol y acetonitrilo (60:25:15).
Para derivatización post-columna con celda electroquímica:5 Una solución preparada mezclando 1 L de una mezcla de agua,
metanol y acetonitrilo (60:25:15); 350 µL de ácido nítrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio
Sistemas de derivatización post-columna (PCD, por sus siglas en inglés)
Celda PHRED: Celda fotoquímica para derivatización post-columna
Celda Kobra: Celda electroquímica, celda de bromación para derivatización post-columna.
ANÁLISIS
l
Derivatización post-columna para aflatoxinas: Usar una celda fotoquímica o electroquímica. Inyectar 50 µL de blanco de
ia
reactivo (Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 1), las Soluciones Estándares de Trabajo de Aflatoxinas 2–6 o la Solución de
Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solución de Prueba comparando los tiempos de retención
con los de los estándares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG2, AFG1, AFB2 y AFB1. Después de pasar a través de
la celda fotoquímica o electroquímica, AFG1 y AFB1 han derivatizado para formar AFG2a (derivado de AFG1) y AFB2a (derivado
de AFB1). [NOTA—Las estructuras químicas de los derivados que resultan de bromación electroquímica y fotólisis no son iguales.
fic
Las estructuras de los productos de fotólisis de AFB1 y AFG1 no se han definido.] Los tiempos de retención
de AFG2, AFG2a, AFB2 y AFB2a están entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoquímica; los tiempos de
retención usando la celda electroquímica resultan en períodos de tiempo más breves. Los picos se deben resolver hasta la línea
base. Construir una curva estándar para cada aflatoxina. Determinar la concentración de cada aflatoxina en la Solución de
Prueba a partir de la curva de calibración.
Curvas de calibración de aflatoxinas: Se preparan las curvas de calibración para cada una de las aflatoxinas usando las
Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el intervalo
de 0,25–4 ng/mL para AFB1 y AFG1, y el intervalo de 0,0625–1 ng/mL para AFB2 y AFG2. Construir las curvas de calibración
O
antes de su análisis según la Tabla 4, y verificar la linealidad de la gráfica. Si el área de respuesta de la porción de prueba se
encuentra fuera (más alto) del intervalo de la calibración, entonces la Solución de Prueba debe diluirse con una mezcla de
metanol y agua (1:1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC.
Cuantificación de Aflatoxinas: Se realiza la cuantificación de aflatoxinas midiendo las áreas de los picos a cada tiempo de
retención de aflatoxina y comparándolos con la curva de calibración correspondiente.
APTITUD DEL SISTEMA

La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB1 (2 µg/kg) y de aflatoxinas totales (5 µg/kg) es no menos
de 68% y 70%, respectivamente. La desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) es no más de 10% para AFB1 y
para aflatoxinas totales.
CÁLCULOS
Graficar el área del pico (respuesta, eje y) de cada estándar de toxina en función de la concentración (ng/mL, eje x) y
determinar la pendiente (S) y la intersección con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente fórmula:
Toxina (µg/kg) = {[(R – a)/S] × V/W} × F

R = área del pico de la Solución de Prueba
a = intersección con el eje y de la curva de calibración
S = pendiente de la curva de calibración
V = volumen final de la Solución de Prueba inyectada (mL)
W = 1 g de la muestra de prueba pasada a través de la columna de inmunoafinidad
F = factor de dilución, 1 cuando V = 3 mL
4 Celda fotoquímica para derivatización post-columna, tipo PHRED™ Reactor Fotoquímico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar
no mirar directamente la lámpara UV.
5 Celda electroquímica para derivatización post-columna, tipo Kobra™ (R-Biopharm Inc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender
la corriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
(EST)
13
Las aflatoxinas totales son la suma de AFG2, AFG1, AFB2 y AFB1.
ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
Definición
Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominación de “plaguicida” se aplica a cualquier sustancia o mezcla de
sustancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas, hongos, o animales que provocan
daños durante la producción, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercialización de artículos puros, o
que interfieren de algún otro modo con estos procesos. La denominación incluye sustancias elaboradas para ser usadas como
reguladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o después de la
cosecha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.
Límites
Dentro de los Estados Unidos, muchos productos botánicos se tratan como suplementos dietéticos y por eso están sujetos a
las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos, pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley Federal sobre
l
Alimentos, Medicamentos y Productos Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los límites de plaguicidas en
alimentos están determinados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA - Environmental Protection
ia
Agency) según se indica en el Código de Reglamentos Federales [Code of Federal Regulations (40 CFR §180)] o el Diario Oficial
(FR - Federal Register). Además, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA - Food and Drug Administration)
establece niveles de acción para residuos inevitables de plaguicidas (21 CFR §109 y 21 CFR §509). Para plaguicidas químicos
sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA o niveles de acción de la FDA, los residuos deben estar por debajo del límite de
detección del método especificado. Los resultados con valores menores a los límites de detección de la EPA se consideran cero.
fic
Por lo tanto, los límites aquí detallados no son válidos en los Estados Unidos cuando los artículos de origen botánico están
etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los límites se pueden aplicar en otros países. A menos que se especifique algo
diferente en la monografía individual, el artículo a examinar debe cumplir con los límites provistos en la Tabla 5. Los límites de
plaguicidas, de los que se sospecha su presencia, que no se indican en la Tabla 5 deben cumplir las reglamentaciones de la EPA.
En casos en donde un plaguicida no se indica en la Tabla 5 ni en las reglamentaciones de la EPA, calcular el límite por la fórmula:
Límite (mg/kg) = AM/100B

O
en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y
la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), en mg/kg de peso corporal; M es el peso corporal, en
kilogramos (60 kg); y B es la dosis diaria del artículo, en kilogramos.
Si el artículo está destinado para la preparación de extractos, tinturas u otras formas farmacéuticas de la cual el método de
preparación modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los límites por la fórmula:
Límite (mg/kg) = AME/100B
donde E es el factor de extracción de pesticida en el método de preparación, determinado experimentalmente como la relación
entre el contenido original de plaguicida en el material botánico y el contenido final de plaguicida en la preparación; B es la
dosis diaria de la preparación en kilogramos; y A y M se definen anteriormente.
Puede concederse una exención total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los
plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de cosechar) del tratamiento de la partida y se
puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés).
Tabla 5
Límite
Sustancia (mg/kg)
Acefato 0,1
Alaclor 0,05
Aldrina y dieldrina (suma de) 0,05
Azinfos-etílico 0,1
Azinfos-metílico 1
Bromuro inorgánico (calculado como ion bromuro) 125
Bromofos-etílico 0,05
Bromofos-metílico 0,05
(EST)
14
Tabla 5 (continuación)
Límite
Sustancia (mg/kg)
Bromopropilato 3
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano) 0,05
Clorfenvinfos 0,5
Clorpirifos-etílico 0,2
Clorpirifos-metílico 0,1
Clortal-dimetílico 0,01
Ciflutrina (suma de) 0,1
λ-Cihalotrina 1
Cipermetrina e isómeros (suma de) 1
DDT (suma de o,p′-DDE, p,p′-DDE, o,p′-DDT, p,p′-DDT, o,p′-TDE y p,p′-TDE) 1
Deltametrina 0,5
Diazinón 0,5
Diclofluanida 0,1
Diclorvos 1
l
Dicofol 0,5
Dimetoato y ometoato (suma de)
Ditiocarbamatos (expresado como CS2)
Endosulfán (suma de isómeros y sulfato de endosulfano) ia 0,1
3
fic
Endrina 0,05
Etión 2
Etrimfos 0,05
Fenclorofos (suma de fenclorofos y fenclorofos-oxón) 0,1
Fenitrotión 0,5
O
Fenpropatrina 0,03
Fensulfotión (suma de fensulfotión, fensulfotión-oxón, fensulfotión-oxón-sulfona y fensulfotión

sulfona) 0,05
Fentión (suma de fentión, fentión-oxón, fentión-oxón-sulfona, fentión-oxón-sulfóxido, fentión
sulfona y fentión-sulfóxido) 0,05
Fenvalerato 1,5
Flucitrinato 0,05
τ-Fluvalinato 0,05
Fonofos 0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepóxido y trans-heptaclorepóxido) 0,05
Hexaclorbenceno 0,1
Hexaclorociclohexano (suma de isómeros α-, β-, δ- y ε-) 0,3
Lindano (γ-hexaclorociclohexano) 0,6
Malatión y malaoxón (suma de) 1
Mecarbam 0,05
Metacrifos 0,05
Metamidofos 0,05
Metidatión 0,2
Metoxiclor 0,05
Mirex 0,01
Monocrotofos 0,1
Paratión-etílico y Paraoxón-etílico (suma de) 0,5
Paratión-metílico y Paraoxón-metílico (suma de) 0,2
(EST)
15
Tabla 5 (continuación)
Límite
Sustancia (mg/kg)
Pendimetalina 0,1
Pentacloranisol 0,01
Permetrina e isómeros (suma de) 1
Fosalona 0,1
Fosmeto 0,05
Butóxido de piperonilo 3
Pirimifos-etílico 0,05
Pirimifos-metílico (suma de pirimifos-metílico y N-desetil-pirimifos-metílico) 4
Procimidona 0,1
Profenofos 0,1
Protiofos 0,05
Piretro (suma de cinerina I, cinerina II, jasmolina I, jasmolina II, piretrina I y piretrina II) 3
Quinalfos 0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina y metil pentaclorofenil sulfuro) 1
l
S-421 0,02
Tecnaceno
Tetradifona
Vinclozolina ia 0,05
0,3
0,4
fic
Análisis Cualitativo y Cuantitativo de Residuos de Plaguicidas: Emplear procedimientos analíticos
validados, p.ej. de acuerdo con la versión más actualizada de la guía de la UE sobre procedimientos analíticos de control de
calidad y de validación para el análisis de residuos de plaguicidas [NOTA—La versión vigente del Documento Núm. SANTE/
11813/2017, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/pesticides_mrl_guidelines_wrkdoc_2017-11813.pdf.] o
los principios de validación del método de la EPA (OPPTS 860.1340) que cumplan con los siguientes criterios. El método,
especialmente con respecto a los pasos de purificación, es adecuado para la combinación de residuos de plaguicidas y la
sustancia en análisis, y no es susceptible a interferencias de sustancias coextraíbles. El límite de cuantificación para cada
O
combinación de matriz de plaguicidas que se va a analizar no debe exceder el límite de tolerancia correspondiente: el método
demuestra una recuperación de entre 70% y 120% de cada plaguicida con una repetibilidad de no menos de 20% de desviación
estándar relativa [NOTA—en algunos casos, se pueden aceptar recuperaciones más bajas conforme a lo tratado en el documento
SANTE/11813/2017] ; y las concentraciones de las soluciones de prueba y de referencia, y la calibración del aparato son tales
que se obtiene una respuesta lineal del detector analítico.
LÍMITES DE IMPUREZAS ELEMENTALES
Los niveles de impurezas elementales deben restringirse conforme a lo indicado en la Tabla 6 a menos que se indique de
otro modo en la monografía individual. Ciertas monografías específicas pueden proveer diferentes límites para artículos que
por lo regular se usan en grandes cantidades.
Tabla 6. Límites de Impurezas Elementales

Límite
Elemento (µg/g)
Arsénico (inorgánico)a 2
Cadmio 0,5
Plomo 5
Mercurio (total) 1
b
Metilmercurio (como Hg) 0,2
a El arsénico puede medirse usando un procedimiento sin especiación suponiendo que todo el arsénico contenido en el suplemento se encuentra en forma
inorgánica. Cuando se excede el límite al usar un procedimiento sin especiación, se deberá demostrar el cumplimiento con el límite para arsénico inorgánico
teniendo como fundamento un procedimiento con especiación.
b La determinación de metilmercurio no es necesaria cuando el contenido de mercurio total es menor que el límite para metilmercurio.
(EST)
16
Los artículos se analizan de acuerdo con los procedimientos establecidos en Impurezas Elementales—Procedimientos á233ñ.
Cuando se requiera especiación, se usan para el análisis los procedimientos del capítulo Contaminantes Elementales en
Suplementos Dietéticos á2232ñ.
Estándares de Referencia USP á11ñ
ER Dextrosa USP
l
ia
fic
O

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Impreso el: jue. abr. 22 2021, 10:29:29 a. m.

Oficial Vigente al 22-abr-2021 DocId: 4_GUID-E8A1366F-9657-41FC-9EDC-C20F4BE473B6_5_es-ES

á561ñ ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

N.º de Envases N.º de Envases

(Redondear “n” al siguiente número entero más alto.)

Materia Orgánica Extraña

Raíces, rizomas, corteza y hierbas 500 g

Hojas, flores, semillas y frutos 250 g

Cenizas Solubles en Agua

Extractos Solubles en Alcohol

MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)

Extractos Solubles en Agua

MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)

Tabla 1. Determinación de la Alícuota Óptima

Contenido de almidón = % de dextrosa × 0,9

(0,9C/106) × V1 × (250/V0)(100/E)(100/W) = 2,25CV1/V0EW

C = concentración promedio de dextrosa en las Soluciones de prueba (µg/mL)

[NOTA—V0 es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilución adicional.]

Determinación de Aceite Volátil

Figura 1. Trampas para Aceite Volátil

REACTIVO DE ACETATO DE CINC–CLORURO DE ALUMINIO

SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO

SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE AFLATOXINAS

Aflatoxina (µg/mL) = (A × Mr × 1000)/ε

Tabla 3. Pesos Moleculares y Absortividades Molares de Aflatoxinas

AFB2 314 Acetonitrilo 22500

AFG1 328 Acetonitrilo 17600

AFG2 330 Acetonitrilo 18900

= concentración de la aflatoxina pertinente en la Solución Estándar de Aflatoxinas

Almacenar en un refrigerador. Equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso.

APTITUD DEL SISTEMA

SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

[PRECAUCIÓN—Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.]

APTITUD DEL SISTEMA

SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO 0,1 M

SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

SOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO DE AFLATOXINAS

Tabla 4. Preparación de Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas

4 50 1 0,25 1 0,25 2,5

5 100 2 0,5 2 0,5 5

SOLUCIÓN DE APTITUD DEL SISTEMA

APTITUD DEL SISTEMA

Toxina (µg/kg) = {[(R – a)/S] × V/W} × F

Las aflatoxinas totales son la suma de AFG2, AFG1, AFB2 y AFB1.

ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS

Límite (mg/kg) = AM/100B

Límite (mg/kg) = AME/100B

Aldrina y dieldrina (suma de) 0,05

Bromuro inorgánico (calculado como ion bromuro) 125

Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano) 0,05

Ciflutrina (suma de) 0,1

Cipermetrina e isómeros (suma de) 1

DDT (suma de o,p′-DDE, p,p′-DDE, o,p′-DDT, p,p′-DDT, o,p′-TDE y p,p′-TDE) 1

Dimetoato y ometoato (suma de)

Ditiocarbamatos (expresado como CS2)

Endosulfán (suma de isómeros y sulfato de endosulfano) ia 0,1

Fenclorofos (suma de fenclorofos y fenclorofos-oxón) 0,1

Fensulfotión (suma de fensulfotión, fensulfotión-oxón, fensulfotión-oxón-sulfona y fensulfotión

Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepóxido y trans-heptaclorepóxido) 0,05

Hexaclorociclohexano (suma de isómeros α-, β-, δ- y ε-) 0,3

Lindano (γ-hexaclorociclohexano) 0,6

Malatión y malaoxón (suma de) 1

Paratión-etílico y Paraoxón-etílico (suma de) 0,5