PROPAGACIÓN MÁSIVA DE YEMAS LATERALES DE PIÑA

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE INGENIERIA AGRONÓMICA
PROGRAMA INGENIERIA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2014

1
 PROPAGACIÓN MÁSIVA DE YEMAS LATERALES DE PIÑA

Trabajo presentado como requisito parcial para obtener una nota en la

asignatura de Cultivo de Tejidos u Órganos Vegetales In Vitro

DOCENTE DEL ÁREA

DARIO GARAVITO GARAVITO

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE INGENIERIA AGRONÓMICA
PROGRAMA INGENIERIA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2014

2
 CONTENIDO

INTRODUCCION 5
RESUMEN 6
1. ANTECEDENTES 7
2. OBJETIVOS 8
2.1. OBJETIVO GENERAL 8
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 8
3. METODOLOGÍA 9
3.1. UBICACIÓN 9
3.2. MATERIALES 9
3.2.1. VIDRERIA 9
3.2.2. REACTIVOS 9
3.3. EQUIPOS 9
3.4. OTROS 10
3.5 PROCEDIMIENTO 10
4. RESULTADOS 13
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 14
6. CONCLUSIONES 15
7. RECOMENDACIONES 16
8.ANEXOS 17
9. BIBLIOGRAFÍA 22

3
 LISTA DE FIGURAS.

Figura 1. Soluciones madres. 17

Figura 2. pesando la sacarosa 17
Figura 3. Desinfección de la corona de piña 18
Figura 4.Medio de cultivo ebullición 18
Figura 5.Medio de cultivo en los frascos. 19
Figura 6. .Corte al material vegetal 19
Figura 7. Siembra de explantes. 20
Figura 8. Inicio de brotes laterales 20
Figura 9. Brotes laterales en crecimiento 21
Figura 10. Brotes laterales. 21

4
 INTRODUCCIÓN

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más

generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un
fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia
uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El
explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas
vegetativas de las plantas

La piña Ananas Comosus (L) Merr, es un cultivo de gran importancia comercial

por la demanda de su fruto. Esto ha conducido a la búsqueda de nuevos
métodos de propagación que permitan acelerar la producción de propágulos
para la plantación en el campo y entre éstos, cabe señalar, el cultivo in vitro de
yemas que permite mejorar sustancialmente el proceso de multiplicación.

La aplicación de la micropropagación como alternativa in vitro en el cultivo de

piña mejorará la capacidad de producción comercial, puesto que el empleo de
vitroplantas manejadas con un alto grado de asepsia garantizará el cultivo de
plantas selectas libres de inóculo inicial de patógenos, a la vez que los
productores medianos y pequeños podrán contar con material de propagación
homogéneo en desarrollo, crecimiento, producción y calidad. 1

RESUMEN
1
Silvia Gicela Saucedo Aguiar. Pág. 01. Disponible file:///C:/Users/AMBIENTAL/Downloads/Dialnet-
PropagacionClonalInVitroDePinaAnanasComosusLMerrVa-4045256.pdf.

5
La siembra de yemas laterales de piña se realizó en el laboratorio de
agronomía del Centro de Investigación Santa Lucia del Instituto Universitario de
la Paz, para esto se dispuso de un medio de cultivo compuesto de la hormona
AIA (Ácido indolacetico (perteneciente al grupo de las auxinas), estimulan la
elongación, división celular y el enraizamiento, de esta hormona se tomaron 0.5
ppm equivalen a 1.2 ml (en la botella ámbar, esta hormona se encontraba a
una concentración de 60 ppm), para una solución de 140ml. Para la
dosificación de las soluciones madres se empleó 4.2 gr de sacarosa y 1.05 gr
de agar.

En cuanto la desinfección de la vidriería se empleó 500 ml de NaCIO al 1%, y

se procedió a realizar minutos antes de que el medio del cultivo llegara a su
punto de ebullición, (en ese momento se le adicionó el agar, siempre con la
ayuda de un agitador para mantener el medio en movimiento). Después de la
desinfección se añadió aproximadamente unos 20 ml del medio a la vidriería,
de inmediato se sellaron con papel aluminio para evitar la contaminación del
medio.

La siembra de yemas laterales de piña se realizó 30 minutos después, cuando

los medios ya estaban frescos y solidificados. El material vegetal (los explantes
que contenían las yemas laterales de piña) se sometió durante 10 minutos en
una solución al 1% de hipoclorito de sodio (NaCIO) en agua (H2O); se
desinfectó el mesón del laboratorio, se encendieron los mecheros y se procedió
a deshojar la corona de piña para extraer las yemas laterales y realizar la
siembra de manera inmediata y nuevamente sellar con papel aluminio.

1. ANTECEDENTES

6
El cultivo in vitro es una alternativa biotecnológica que permite la propagación
masiva de plantas de piña libres de enfermedades y en tiempos relativamente
cortos. El método de micropropagación ha sido utilizado por diferentes autores,
obteniéndose diversos protocolos para el establecimiento de cultivo in vitro de
la piña (Casale y De García 1987; Sripaoraya al 2003, Mogollón al 2004; De
García al 2008; Saucedo al 2008). Además permite la obtención de plantas
mediante procesos organogénicos y embriogénesis somática (Sripaoraya 2003,
Firoozabady y Gutierrson 2003, Amín 2005).2

La técnica de micropropagación in vitro de plantas a través de yemas o

meristemos, es una estrategia que permite la multiplicación masiva de plantas,
las cuales además de ser genéticamente uniformes e idénticas a la planta
madre, tienen la ventaja de ser plantas libres de patógenos.

El desarrollo de la biotecnología aplicada a la propagación “in Vitro” o

micropropagación ha originado importantes impactos en la frutihorticultura,
especialmente en piña, bananos y fresa, y se ha utilizado para la regeneración
de plantas sanas en algunas especies cítricas y frutales caducifolias. 3

2. OBJETIVOS

2
Héctor A. Blanco, Teresa Edith Vargas, Eva de García. Pág. 2. Disponible
http://www.redalyc.org/pdf/339/33919418007.pdf.
3
Facundo Enrique Suárez Haro. Pág. 3. Disponible
http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/4952/1/T-ESPE-IASA%20I-004581.pdf.

7
2.1 Objetivo general.

 Desarrollar una práctica de propagación vegetativa mediante la

micropropagación in vitro de piña en medios sólidos a partir de explantes
obtenidos de yemas laterales.

2.2 Objetivo específicos.

 Realizar un medio de cultivo adecuado que brinde los macro y micro

nutrientes necesarios para el crecimiento de los explantes de la corona de
piña (yemas laterales).

 Aplicar la hormona AIA para promover la multiplicación celular y el

crecimiento vegetal.

 Hacer seguimiento del desarrollo de los materiales para recoger la

información

3. METODOLOGÍA

8
3.1 Ubicación

La práctica se realizó en el Centro de Investigación Santa Lucia del Instituto

Universitario de la Paz, situado en el Km 14 Vía Bucaramanga Vereda el
Zarzal, cuenta con una temperatura promedio de 30º - 35ºC y con 75 MSNM y
con una Latitud de 5.50.793 y de Longitud de -72.67.217.

3.2 Materiales

3.2.1 Vidriería

 7 Recipientes de vidrio
 1 Beaker de 1000 ml
 7 Pipetas
 1 Agitador
 2 Cajas de petri

3.2.2 Reactivos

 Hormona BAP
 NaOH (1N)
 HCL (1N)
 Soluciones madres:
 NH4NO3 / KNO3 – 10 ml/L
 KH2PO4 – 10 ml/L
 CaCl2H2O – 12 ml/L
 H3BO3/NaMoO42H2O/COCl2H2O – 12ml/L
 MgSO47H2O/MnSO4H2O/ZnSO47H2O/CuSO45H2O – 2.5 ml/L
 Kl – 10 ml/L
 Na2EDTA/FeSO47H2O – 5 ml/L

3.3 Equipos

 Estufa de dos puestos

 Balanza digital
 Medidor de pH

3.4 Otros

9
 Sacarosa
 Agar
 Hipoclorito de sodio NaClo
 Recipiente plástico
 4 Mecheros
 Cuchillas Nº 11 y Nº 12
 Papel aluminio
 Marcador permanente
 Agua destilada
 Agua destilada estéril
 1 Probeta

3.5 Procedimiento

 La práctica de laboratorio fue elaborada el martes 1 de Abril del 2014, la

primera labor que se realizó fue el aseo a la infraestructura física, se trapeó
todo el laboratorio (Teniendo en cuenta que en un laboratorio no se debe
barrer debido que las partículas de polvo se esparcen ocasionando
problemas en el éxito de la práctica y que este polvo dura aproximadamente
en descender a la superficie del suelo entre 8 y 10 horas lo cual
contaminaría todo el procedimiento a realizar).

 Los mesones del laboratorio se desinfectaron con una solución de

Hipoclorito de sodio (NaClO) al 1% (cálculos que se realizaron previamente)
utilizando toallas de trapo para la esterilización de todos los materiales
inertes presentes en el laboratorio como la vidriería e instrumentos.

 La vidriería se lavó con agua y jabón, luego se esterilizaron sumergiéndolos

en agua caliente previamente calentada en una estufa.

 De las soluciones madres se sacaron 1.4 ml de cada una, estos cálculos

fueron sacados previamente.

1000 ml ------------ 10 ml de SM
140 ml -------------- x

X= 140 x 10 / 1000 = 1.4 ml de cada una de las S.M

 Se pesó la cantidad de sacarosa a utilizar.

6 gr sacarosa.

10
 Se pesó la cantidad de agar a utilizar.
7.3 gr de agar

 Se procedió a agregar los 6 gr en el agua destilada y se aforo procediendo

a colocarla en la estufa aforando hasta hervir la solución para colocar el
agar

 Con respecto al pH no se pudo hacer una medición exacta ya que se

presentaron inconvenientes con el préstamo del medidor de pH pero se
promedió de un % de 5,5.

 Luego se agregó 0.5 ml de la hormona AIA que se encontraba en la botella

ámbar a una concentración de 60 ppm. .

 Una vez listo el medio, este se colocó a hervir. Cuando se inició este
proceso, se agregó el agar y se mezcló constantemente hasta quedar
totalmente homogenizado.

 Mientras el medio hervía, se procedió a desinfectar la vidriería para lo cual

fue necesario bajar la concentración del NaClO al 1%. se realizó la
conversión de la siguiente forma:

V1 x C1= V2 x C2

Se remplazan los datos.

V1= 2000ml x 1%
= 2.22 hipoclorito
90%
2000 ml – 2.22 =197.78 de agua

Para saber la cantidad de agua destilada para la solución desinfectante:

 Antes de añadir el medio a los frascos era importante tener el papel

aluminio cortado a la medida de la abertura del frasco.

 Se procedió a añadir el medio y sellar con papel aluminio de manera

inmediata.

 Una vez listos los frascos fueron separados para que se solidificara durante
unos minutos y luego se procedió a preparar el material vegetal para la
siembra.

Para la siembra del material vegetal se llevaron a cabo los siguientes pasos:

11
1. Se desinfecto el material vegetal en este caso el explante de yemas
laterales de piña con una concentración de NaClO al 1% durante 10
minutos.

2. Después de los 10 minutos se retiró el NaClO y se realizaron dos lavados

con agua destilada estéril para retirar de la superficie las partículas de
hipoclorito de sodio.

3. Se preparó el área de siembra dándole las condiciones mínimas de asepsia

para evitar cualquier tipo de contaminación. Se desinfectó el mesón con un
trapo limpio e hipoclorito de sodio. Se colocaron tres mecheros creando un
triángulo entre ellos y en el centro fueron ubicados un frasco con alcohol
donde se introdujeron las herramientas para cortar. Igualmente se dispuso
de dos cajas de petri, que sirvieron como soporte para realizar los cortes del
material vegetal.

4. Con ayuda de las pinzas se sujetó el explante de yemas y con un bisturí se

realizaron los cortes en forma circular, teniendo precaución de no afectar las
yemas.

5. Una vez listo el material vegetal, y con ayuda de los mecheros se flameó
sobre los frascos de compota que contenían el medio de cultivo.

6. Empleando los mecheros, se sujetó un primer frasco de vidrio, se retiró la

tapa de papel aluminio y se acercó su abertura hacia el mechero para evitar
contaminar el medio, mientras se realiza otros procedimientos. Con ayuda
de una pinza se incorporaban de a 3 yemas por frasco, cuando las yemas
estaba en el medio se tapó a la mayor brevedad con papel aluminio. Se
realizó el mismo procedimiento con los demás frascos.

7. Una vez lista todas las yemas en sus respectivos medios, fueron ubicados
en la estantería.

8. Se revisaron las muestras a las 24, 48 y 72 horas y se descartaron 4 de ellas

porque estaban totalmente contaminadas.

4. RESULTADOS

12
Los días 2, 3 y 4 abril se realizo seguimiento a la siembra realizada el día 1 de
abril donde no se observó la presencia de ningún patógeno existente en el
medio.

El martes 8 de abril del presente año, 4 de las 7 muestras empezaron a

mostrar cambios significativos:

 4 de los 7 frascos presentaron una contaminación por hongos en la

parte superficial del medio del cultivo, observándose una esporulación
de color blanco, partiendo de allí se puede deducir que está se debió a
un descuido en el protocolo estipulado al momento de la siembra ya que
solo cuatro de los siete frascos mostraron resultados significativos, o que
pudo haber sido un contaminante presente en el ambiente del
laboratorio entendiéndose este como agente exógeno que pudo haber
inoculado en el momento de la siembra.

 Los tres frascos restantes a los cuales no se les observo presencia de

algún patógeno se dejaron en la estantería del laboratorio para que
continuara con su proceso evolutivo de crecimiento de brotes laterales.

El martes 15 de abril se observaron inicios de brotes en los tres frascos

presentes en la estantería, teniendo en cuenta que estuvieron bajo fotoperiodo.

 A los 3 medios en los que se observaron inicios de brotes se le ha hecho

seguimiento semanal en donde se observa que posibles cambios
puedan presentar, hasta la fecha no presenta ningún tipo de agente
patógeno y se les ha suministrado horas luz con el fotoperiodo instalado
en el transcurso del semestre.

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

13
Fue posible observar una formación de rebrotes de yemas laterales ya que en
3 de los 7 frascos se encuentran en la estantería bajo fotoperiodo y sin
presencia de patógenos en el medio, sin embargo cabe resaltar que al
momento de la siembra se introdujeron al medio hongos de carácter exógeno y
esto se pudo observar en los 4 frascos que se eliminaron a los ocho días
después de la siembra.

Las características de la contaminación de los medios infectados puede haber

sido por:

 Una insuficiente desinfección del área de trabajo y de las

herramientas utilizadas a la hora de la siembra.
 Hablar mucho en el momento de la siembra.
 Como se trabajó con dos coronas de piña de material vegetal
diferente, una de las dos pudo ser fuente de inoculo.

6. CONCLUSIONES

14
Por medio del desarrollo de la práctica de laboratorio de yemas laterales de
piña se puede concluir que:

Brindando las condiciones de asepsia necesarias y óptimas en el laboratorio de

agronomía del Centro de Investigación Santa Lucia del Instituto Universitario de
la Paz, es posible realizar prácticas de siembra de yemas laterales de piña
obteniendo medios libres de patógenos y con los macro y micro elementos
necesarios para inducir el pronunciamiento de brotes por la técnica de
propagación masiva del material vegetal.

7. RECOMENDACIONES

15
Para futuras practicas con yemas laterales de piña en el laboratorio de
agronomía en el instituto universitario de la paz Se debe mejorar el protocolo
de siembra ya que se pueden presentar problemas con patógenos de carácter
exógeno como en este caso o endógeno, esto conlleva a mejorar todo lo
concerniente con la desinfección del área de trabajo y la correcta esterilización
y manipulación de todas las herramientas que se puedan utilizar en este
proceso.

Realizar diferentes tratamientos en cuanto al porcentaje de concentración de

hipoclorito de sodio utilizado en la desinfección del material vegetal procurando
la búsqueda de mejores resultados en las futuras prácticas.

8. ANEXOS

16
 Figura # 1. Soluciones madres

Fuente: Autor

Figura # 2. Pesando la sacarosa

Fuente: Autor

Figura # 3. Desinfección de la corona de piña

17
 Fuente: Autor

Figura # 4. Medio de cultivo en ebullición.

Fuente: Autor

Figura # 5. Medio de cultivo en los frascos.

18
 Fuente: Autor

Figura # 6. Corte al material vegetal

Fuente: Autor

Figura # 7. Siembra de explantes.

19
 Fuente: Autor

Figura # 8. Inicio de brotes laterales

Fuente: Autor

Figura # 9. Brotes laterales en crecimiento

20
 Fuente: Autor

Figura # 10. Brotes laterales.

Fuente: Autor

9. Bibliografía

21
 Silvia Gicela Saucedo Aguiar. Pág. 01. Disponible
file:///C:/Users/AMBIENTAL/Downloads/Dialnet-
PropagacionClonalInVitroDePinaAnanasComosusLMerrVa-4045256.pdf

 Facundo Enrique Suárez Henao. Micropropagación in vito de piña

(Ananas comosus L. Merril) Híbrido md-2, a partir de cortes de yemas
laterales y apicales. Pág. 14-15. Disponible
http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/4952/1/T-ESPE-IASA
%20I-004581.pdf

22