REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE MEDICINA
MAESTRÍA EN GENÉTICA
MENCIÓN GENÉTICA HUMANA
ASIGNATURA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
MARACAIBO- EDO. ZULIA

TECNICAS DE HIBRIDACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.

PROFESORA:
MgSc. LISBETH BORJAS

MAESTRANTE:
LCDA. JENNY ZAMBRANO.

MARACAIBO; ABRIL DEL 2.011

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INDICE.
INTRODUCCIÓN………………………………………………… ..… 3

I. HIBRIDACIN DE LOS ACDOS NUCLEICOS…………………….…. 4

II. SONDAS…………………………………………………………………... 4
1. SONDAS CONVENCIONALES………………………………………..… 4
2. SONDAS SINTETICAS……………………………………………...….... 4
3. MARCAJE DE LAS SONDAS……………………………………………. 4

4. GRUPOS MARCADORES E INDICADORES PARA SU DETECCION.. 8

III. FACTORES QUE CONDICIONAN LA HIBRIDACIÓN………….…. 8

IV. TECNICAS DE HIBRIDACION………………………………………... 10

1. SOUTHERN BLOT………………………………………………………... 10

2. NORTHEN BLOT…………………………………….………………….… 11

3. TRANSFERENCIA WESTERN…………………………………………… 11

4. DOT BLOT/ SLOT BLOT……………………………………………….… 12

5. SNAPSHOT………………………………………………………….……... 12

6. TEST DE LA PROTEÍNA TRUNCADA…………………………..……… 13

7. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA…………………….… 14

BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………. 23
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INTRODUCCIÓN

Durante el desarrollo de la ciencia y dentro del área de la Biología Molecular, se han producido

avances a lo largo de la historia que contribuyen con la investigación y e identificación de los

ácidos nucleícos; hecho que a su vez ha permitido avances considerables dentro de aéreas como

la genética, la medicina forense entre otras.

La propiedad de hibridación de los ácidos nucleíco permite el estudio e identificación de

secuencias especificas que proporcionan datos útiles para diagnostico de mutaciones,

descubrimiento de secuencias anormales, identificación de una secuencia de interés entre otras

aplicaciones que permiten el desarrollo de la ciencia y tecnología.

El conocimiento de las mismas proporciona conocimientos necesarios para un desarrollo integral

dentro del área de la biología molecular así como sienta las bases para un futuro desarrollo de

estas técnicas para diagnostico e investigación dentro del área de la genética.

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I. HIBRIDACIN DE LOS ACDOS NUCLEICOS

Una de las características más singulares de la molécula de ADN es la complementariedad de

bases. La doble hélice de ADN está formada por dos cadenas anti paralelas en las que las bases
nitrogenadas están apareadas de forma que una adenina (A) está siempre frente a una timina (T)
y una citosina (C) está siempre frente a una guanina(G). La unión entre las bases se establece
mediante puentes de hidrógeno.

Experimentalmente se puede separar las dos cadenas, proceso que se denomina

desnaturalización, se aplica energía en forma de calor, rompiendo los enlaces químicamente o
disminuyendo la concentración salina. Modificando estos parámetros en sentido opuesto
podremos renaturalizar dos moléculas de cadena sencilla y obtener una cadena doble. El proceso
de renaturalización dependerá fundamentalmente de la complementariedad de bases que
presenten las dos cadenas sencillas.

La hibridación es un fenómeno muy importante basada en la renaturalizacion de dos cadenas

sencillas de acido nucleíco; que da lugar a una doble hebra de gran estabilidad apareada según su
complementariedad. Las técnicas de hibridación están basada en la característica que tiene los
ácidos nucleícos de formar híbridos; lo que permite detectar la presencia de un acido nucleíco
concreto en una muestra para ello se utilizan diversas técnicas con una variedad de
requerimientos de acuerdo a su tipo.

II. SONDAS

Las sondas son un segmento de ADN o ARN utilizado para encontrar una secuencia específica de
nucleótidos, estas son complementarias a la secuencia de ADN diana a identificar; es un
componente esencial dentro de las técnicas de hibridación de los ácidos nucleícos debido a que
revelara la presencia del la secuencia de interés.

Las sondad tienen diversos métodos de clasificación que van de acuerdo a la características de las
mismas; tales como naturaleza, método de obtención tipo de producto formado entre otros. En
función de su método de preparación pueden distinguirse en sondas convencionales o sintéticas
clasificadas de acuerdo al siguiente cuadro.
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Tipo de Convencionales Sintéticas

Sonda

Material ADN de Doble Hebra ADN de Doble Hebra Nucleótidos

de Partida

Método de Clonación Clonación PCR en Clonación Celular en Síntesis química

Obtención Celular por PCR transcriptasa Vector especial
Clásica Inversa Seguida de
Transcripción

Naturaleza Fragmento de ADN Ribosonda Oligonucleótido

de la sonda Oligodesoxirribonucleotido Fragmento de ARN
formada Oligorribonucleótido

1. SONDAS CONVENCIONALES
Fueron las primeras en ser utilizadas contribuyendo al avance de la biología molecular también
son conocida como sondas genómicas, clonadas o biológicas su naturaleza puede ser de ADN o
ARN y se pueden obtener a través de la clonación celular o a través de la técnicas PCR.

2. SONDAS SINTETICAS.
La capacidad de síntesis química es un proceso de gran importancia para los avances de
investigación en los ácidos nucleícos por medio de este método se pueden obtener sondas de
menor longitud que pueden ser diseñadas con una secuencia complementaria a aquella que se
desea analizar.

3. MARCAJE DE LAS SONDAS.

El empleo de los ácidos nucleícos para la detección de una secuencia específica requiere de una
sonda la cual puede estar marcada para su detención. Este marcaje se realiza por medio de
moléculas de distinta naturaleza como es el caso de isotopos radioactivos, flourocromos o
enzimas y la forma de detectar las mismas puede realizarse de manera directa o Indirecta. Si la
sonda es sintética esta es marcada al mismo tiempo que se prepara o si nos el caso el marcaje será
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realizado una vez obtenida la sonda. El principio básico del marcaje de la sonda es la unión
química o conjugación del marcador

3.1 MARCAJE DIRECTO DE LA SONDA.

El grupo Marcador se puede unir directamente a grupos funcionales específicos con una unión
covalente, como sucede a través de bases nitrogenadas por ejemplo. Siendo los mas
representativo en este grupo el marcaje con la ADN polimerasa y el marcaje terminal
El marcaje con ADN polimerasa se basa en la síntesis enzimática de la sonda con al meno uno de
los cuatro nucleótidos marcados. Tiene dos variantes la primera conocida como Nick Traslation o
traslado de la mella en la cual

• Una DNasa I pancreática realiza rupturas aleatorias a enlaces fosfodiester dando lugar a
mellas (Nick) en las cuales se deja grupos 3OH y 5´P libres.
• La DNA polimerasa
 con su actividad exonucleasa actúa sobre los 5`P eliminando los nucleótidos de
cada mella.
 Con su actividad polimerasa remueve los nucleótidos e incorpora nucleótidos
entre ellos marcados que forma una nueva cadena.
La segunda variante es conocida como Random priming o método de iniciación o cebado al azar
• Se desnaturaliza el ADN
• Cebadores inespecíficos se unen a cadenas desnaturalizadas. Sirviendo como cebadores
ADN polimerasa
• Síntesis de nuevas cadenas con nucleótidos del medio (entre ellos marcados)

En cuanto al marcaje terminal se aplica en lugar de una síntesis una modificación enzimática de
la hebras de acido nucleíco mediante la incorporación de uno o unos pocos nucleótidos marcados
a uno o ambos extremos de la sonda de ADN o ARN. Se puede realizar a través de quinasas o
marcaje terminal por relleno

3.2 MARCAJE EXTERNO DE LA SONDA.

En este variante en vez de marcar los nucleótidos la sonda se une con otra molécula que a la vez
lleva el marcador. Se realiza mediante la unión de proteínas a través de reactivos entrecruzantes
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como formaldehido o glutaroaldehido; unirse a un marcador por interacción electroestática con al

ADN usando agentes intercalantes o de forma no covalente.

3.3 MARCAJE INDIRECTO DE LA SONDA.

Puede convenir que la sonda se una a un grupo no detectable o indicador, el cual en una segunda
etapa podrá ser reconocido por una molécula, generalmente de naturaleza proteica la cual tiene
incorporado un marcador detectable.
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4. GRUPOS MARCADORES E INDICADORES PARA SU DETECCION.

Los grupos marcadores son los componentes de diversas naturaleza utilizados para marcaje de la
sondas, estos en algunos casos por si solo no pueden muestra la presencia de la secuencia a
identificar y por este motivo se hace necesario el empleo de indicadores que como su nombre lo
dice indican o muestran la secuencia de interés. Dentro de los marcadores están los compuestos
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radioactivos que en la mayoría de los casos se realiza a través del p luego el material hibridado
es puesto sobre una película de fotografía en cuya imagen se reflejara la radioactividad. Existen
además marcadores no radioactivos generalmente enzimas que son detectadas a través de
métodos como espectrofotometría o fluorimetria y por ultimo los marcadores que necesitan
indicador en los cuales los mas comunes son la Biotina y Digoxigenina en este caso la
hibridación es detectada por proteínas o anticuerpos marcados que se unen a la biomolecula
revelando su presencia.

III. FACTORES QUE CONDICIONAN LA HIBRIDACIÓN.

TIPOS DE HÍBRIDOS
Los tipos de hibrido condicionan la reacción debido a que de acuerdo a su naturaleza estos dan
mas estabilidad al la hibridación. Siendo los mas estables los de ARN/ARN seguido de los de
ARN/ADN y por ultimo los de ADN/ADN.

LONGUITUD DE LA SONDA
Cuanto mayor sea la sonda mas estabilidad proporcionara al hibrido, su extensión debe ser
considerada también para su relación con la TM.

PORCENTAJE DE G-C
Este porcentaje condiciona la reacción debido a que la unión de G-C es a través de tres enlaces
siendo más estable; de igual forma si el porcentaje es alto requerirá una mayor TM.

CONCENTRACION DE SALES Y FORMAMIDAS.

La concentración de sales aumenta la estabilidad aporta iones positivos que minimizan las cargas
negativas de las hebras para que las mismas no se repelan: debe ser óptima de acuerdo a la
reacción. La concentración de formamidas es requerida para la desnaturalización de los híbridos.
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TEMP MELTING (TM)

Se define la temperatura de melting (Tm) como la temperatura a la cual el 50% de las cadenas
están unidas y 50% están en solución. La Tm es dependiente de la concentración de primer, la
composición de la secuencia y de la composición del solvente.
Existen en la literatura numerosas fórmulas para el cálculo de la Tm. El método más simple y
más ampliamente utilizado se basa en asignar 2°C por cada A o T y 4°C por cada G o C y,
aunque se consiguen buenas aproximaciones con él, la precisión disminuye bastante cuando se
incrementa la longitud de la cadena. Los principales factores que afectan este valor son:
concentración de sales, concentración de ADN, presencia de agentes desnaturalizantes (DMSO o
formamida), secuencia, longitud y condiciones de hibridación. La ecuación más simple para
calcular la Tm está dada por la Regla de Wallace:

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

En donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido presentes. Esta ecuación se

desarrolló para oligos 'cortos' de 14 a 20 bases que hibridizarían con sus correspondientes
complementarios unidos a una membrana con una concentración de NaCl 0.9M. Otra ecuación
familiar para ADN que también es válida para oligos mayores de 50 nucleótidos en pH's de 5 a 9
es:

Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F

En donde M es la concentración molar de cationes monovalentes, XG y XC son las fracciones

molares de G y C en el oligo, L es la longitud de la cadena mas corta en el 'duplex', y F es la
concentración molar de formamida. Esta última ecuación es la más conveniente por incluir
ajustes para dos de los agentes mas comunes que afectan las temperaturas de hibridación:
concentración de sales (a pesar de no estar definida cuando M=0) y concentración de formamida
Así, para la secuencia anterior y con M = 0.9, and F = 0:

Tm = 81.5 + 16.6 (log (0.9)) + 41(.17+.33) - 500/6 - 0.62 (0) = 17.9 °C.
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IV TECNICAS DE HIBRIDACION

1. SOUTHERN BLOT

 Para esta técnica primero se realiza la extracción del ADN, luego se realiza la digestión del
ADN con una con una endonucleasa de restricción.
 Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño
mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN,
que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de
ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las
moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor
tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de
acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor
distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
 Las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de
agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina.
 Tras la neutralización de ésta, el DNA mono catenario resultante se transfiere a la superficie
de una membrana de nailon, realizando así una copia (la traducción más literal del inglés
blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y
transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward
Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere
una réplica de la imagen del papel al secante.
 El ADN en el gel se transfiere a la membrana de nailon y conserva la distribución espacial de
los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
 Se incuba en una disolución que contiene una sonda, se utiliza una sonda capas de hibridar
(es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de
restricción concreto. La formación de la molécula bicatenaria (dúplex) depende del
emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN
presente, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la
hibridación.
 Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, las posiciones de hibridación de la
sonda sobre la membrana del ensayo.
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 Se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una

vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La
película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva.

2. NORTHEN BLOT.

En este caso el procedimiento es idéntico al anterior, difiere en que el acido nucleíco analizado es
ARN que por su tamaño menor no necesita ser analizado con endonucleasas. Esta técnica se usa
principalmente para obtener información sobre el tamaño de ARNs y sobre el modelo de
expresión de genes específicos.

3. TRANSFERENCIA WESTERN
A pesar de que en este caso no existe hibridación de los ácidos nucleícos, se describe el método
por su similitud con las técnicas anteriores. Se emplea para detectar proteínas presentes en una
muestra, estas son sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida separándose en función
de tamaño y carga y son transferidas a una membrana la detección de las bandas proteicas se
realiza gracias a la unión de un anticuerpo especifico contra la proteína que evidencia la reacción.
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4. DOT BLOT/ SLOT BLOT.

Es una técnica alternativa del Southern blot pero mucho más rápida. La muestra que no se
necesita sea purificada (por ejemplo sangre, esputo); se transfiere directamente a una membrana
de nailon o nitrocelulosa, seguido por la hibridación del Acido nucleíco con una sonda; la cual
revelara la presencia de este a través de un punto (Dot Blot) o una mancha (Slot Blot)

5. SNAPSHOT.

Se basa en el uso de cebadores específicos (sin marcar) adyacentes a la base a determinar.

Primer SNP .

Molde

Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada uno con un
fluoróforo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser
uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de SNaPshot)

Molde DNA- Primer

amplificado-
Terminadores (dideoxi), cada uno purificado
marcado con un fluorocromo
diferente (más la polimerasa,
buffer, etc.…) AmpliTaq FS
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La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el genotipo.

Color=Genotipo

Electroforesis y Análisis de Reacción de SNaPshot.

6. TEST DE LA PROTEÍNA TRUNCADA.

El test de proteína truncada PTT, del inglés "protein truncation test", como modelo de los
métodos basados en el estudio de modificaciones en el producto génico. El test PTT es un
método diseñado de forma específica para detectar mutaciones que causan la aparición de un
codón de paro prematuro en la molécula de ADN. Es un método técnicamente complejo, muy
sensible para este tipo de mutaciones pero inaplicable para la detección de otro tipo de
variaciones del ADN.

El método consiste en la amplificación mediante PCR de distintas regiones del locus a analizar,
utilizando cebadores que además de contener la secuencia homóloga del fragmento a amplificar
contienen en pauta de lectura, la secuencia del lugar de iniciación de la transcripción para la
ARN polimerasa de y un codón ATG de iniciación.

Los fragmentos amplificados se utilizan como moldes en una reacción de transcripción in vitro
utilizando la ARN polimerasa. Así se obtienen moléculas de RNA que son simultáneamente
traducidas a proteína en presencia de un aminoácido marcado. Las proteínas obtenidas son
analizadas en un gel de acrilamida-SDS que permite detectar su tamaño. La aparición de
proteínas con un tamaño inferior al esperado respecto a un control de secuencia normal, será
indicativo de la existencia de una mutación de codón de paro prematuro en la molécula analizada
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7. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

En 1983, Mullis desarrolló un procedimiento que permitía realizar copias de un fragmento de

DNA de forma rápida y económica y que se denominó reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Esta técnica supuso un gran avance para la universalización de las técnicas moleculares
en los laboratorios de microbiología, por su sencillez y facilidad de aplicación.

La PCR se basa en la repetición de tres procesos:

a. Desnaturalización térmica del DNA: en esta etapa hay calentamiento para la separación de las
dos hebras de ADN a una temperatura entre 90 y 97 oC que debe ser superior ala de la Tm de la
región a amplificar.

b. Hibridación de cebadores (oligonucleótidos) específicos al DNA de cadena sencilla: consiste

en un enfriamiento rápido por debajo de la Tm de forma que se permita la hibridación de las
hebras sencillas de interés con los oligos cebadores, generalmente se utilizan temperaturas de 50
a 65 oC.

c. Extensión enzimática del DNA: es la etapa de amplificación propiamente dicha se lleva a cabo
en una temperatura de 72 a 75 oC en la cual la ADN polimerasa elonga los cebadores, empleando
como molde las hebras originales; la elongación transcurre en dirección 5´-3´ a partir de los OH
3´de cada cebador y utilizando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura de
molde o hasta que comience un nuevo ciclo.

El proceso se lleva a cabo en un bloque térmico denominado termociclador. En cada repetición

se duplica la cantidad de DNA específico, así en una reacción típica de 30-40 ciclos se generan
230-40 moléculas del DNA de interés (amplicones). La temperatura de hibridación de los
cebadores condiciona la especificidad del proceso; cuando no se conoce perfectamente la
secuencia del DNA de interés se puede utilizar una temperatura inferior a la óptima o también se
pueden diseñar cebadores degenerados, en los que alguna de las posiciones puede estar ocupada
por más de un nucleótido.
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Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR

MATERIALES NECESARIOS PARA LA REALIZACIÓN DE UNA PCR Y

PRECAUCIONES BÁSICO

En el tubo de reacción hay que añadir un tampón de reacción adecuado, con una concentración de
Mg2+ óptima para el funcionamiento enzimático, los cebadores específicos, los
desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dGTP y dCTP; la DNA polimerasa y la muestra de
DNA. El uso de DNA polimerasas termoestables permite que la enzima no se desnaturalice en la
etapa de calentamiento.

Debido a la elevada sensibilidad de la PCR es esencial evitar contaminaciones por DNA extraño;
para ello se separan físicamente las zonas de preparación de muestras, preparación de reactivos,
amplificación y detección; además, es conveniente el uso de puntas de pipeta con filtros, guantes
desechables y pipetas diferenciadas para manipular muestras con DNA y reactivos. Es obligado
el uso de controles positivos y negativos en cada tanda de reacciones.
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a. LECTURA DE LOS RESULTADOS DE LA PCR.

En la PCR convencional, la visualización de los resultados se realiza al final del proceso. La

forma más habitual conlleva la separación electroforética de los fragmentos amplificados en un
gel de agarosa, la posterior tinción con bromuro de etidio (u otro colorante fluorescente) y la
observación final transiluminando con luz ultravioleta. Se utilizan patrones de peso molecular
conocido que permiten extrapolar el tamaño (pares de bases, pb) de los fragmentos amplificados.
Otras posibilidades de detección de los fragmentos pasan por el uso de sondas marcadas, como ya
se comentó para la hibridación, que se unan específicamente al amplicón.

b. VARIANTES DE LA PCR

Existen numerosas variantes de la técnica original de PCR, algunas de las cuales se comentan a
continuación:

 PCR asimétrica: se generan copias de cadena sencilla de ADN, añadiendo cantidades

diferentes de cebadores, de modo que uno de ellos se agota primero y solo una de sus hebras
sigue amplificándose de forma más abundante.

 PCR Heteroduplex: detecta cambios y mutaciones mediante la hibridación de una

cadena de secuencia normal, con una cadena de secuencia mutada. Estas hibridan formando
cadenas homoduples (dos cadena de secuencia normal o dos cadenas de secuencia mutada) y
cadenas heteroduplex que al ser analizadas en un gen y por presentar los errores en su
apareamiento dan un patrón de bandas anómalos.
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 PCR SSCP (conformación de polimorfismos de Cadena Simple): detecta Cambios en

la conformación entre dos cadenas sencillas de ADN que difieren en un solo nucleótido, se
observa en un gel por un patrón de bandas diferencial.

G
C M A
T

G A
Cadenas sencillas
SNP
Patrón de Bandas

C T No > 300pb
S > 100%

 PCR con retrotranscripción (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR): Se utiliza

cuando el molde es RNA, que primero se copia a DNAc (DNA complementario al RNA)
mediante una transcriptasa inversa. En microbiología alimentaria, por ejemplo, se usa para la
detección de aquellos virus cuyo material genético está constituido por RNA (véase el capítulo
correspondiente de este mismo curso).

 PCR Gradiente de desnaturalización: Se baza en la movilidad electroforética de una

molécula de ADN de doble cadena a traves de concentraciones decrecientes de temperatura o
agentes desnaturalizantes como urea y formamidas. Si hay una hibridación mal efectuada la
desnaturalización se realizara con mayor rapidez; observando un patrón anormal en el revelado
de la técnica.
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· PCR múltiple (multiplex PCR): Se pueden incluir en la misma reacción diversos pares de
cebadores que amplifiquen fragmentos diferentes de DNA; de esta forma se pueden detectar
genes diversos de un mismo organismo o detectar diferentes organismos al mismo tiempo. Los
cebadores deben de tener una estabilidad térmica similar y puede ser necesario modificar algunas
condiciones de la reacción para evitar interacciones entre los cebadores.

· PCR anidada (mester PCR): En esta modalidad, se amplifica un fragmento y a continuación

se usa este amplicón como molde para una segunda reacción empleando cebadores que hibriden
con una secuencia interna del primer fragmento. De esta forma se aumentan la sensibilidad y la
especificidad de la reacción, ya que se pueden usar condiciones menos específicas en la primera
amplificación y más específicas en la segunda.
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 PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o
células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una
primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ
convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar
específicamente una población de secuencias de menor representación.

 PCR en tiempo real (real time PCR) o PCR cuantitativa

Una modificación de las técnicas de amplificación que puede solucionar algunos de los
inconvenientes de las técnicas es la PCR en tiempo real, también denominada PCR cuantitativa.
Se basa en detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento específico durante la
amplificación. Existen diversos formatos de detección que, en teoría, se pueden utilizar con todos
los equipos de PCR en tiempo real, aunque cada fabricante recomienda el formato más adecuado
para su(s) sistema(s).

Alternativas para el seguimiento del proceso de amplificación: formatos de realización de la

PCR en tiempo real

El formato más sencillo es el que usa moléculas fluorescentes que se intercalan en el DNA de
cadena doble, siendo la más utilizada SYBR® Green (menos tóxica que el bromuro de etidio)

Esquema del mecanismo de acción de SYBR Green

El uso de intercaladores fluorescentes, sin embargo, presenta algunos inconvenientes, como que
cualquier producto amplificado (específico o inespecífico) producirá fluorescencia o que no se
puede utilizar para detectar productos múltiples, aunque hay técnicas para solventarlos.
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El resto de formatos de detección se basan en la hibridación de sondas internas con el fragmento

amplificado, existiendo diversos sistemas de generación de la señal fluorescente. Dentro de estos
sistemas, los más conocidos son los siguientes: Sondas Taqman®. Diseñadas por Applied
Biosystems, hacen uso de la actividad 5' exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) DNA
polimerasa. Estas sondas tienen un marcador fluorescente en el extremo 5' y una molécula que
absorbe ("quencher") la fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda
hibrida con el fragmento específico (si está presente) y, a medida que se sintetiza la hebra
complementaria al fragmento, la sonda se va degradando por la acción exonucleasa, liberando el
marcador que ahora sí emite fluorescencia.

• Cebadores fluorescentes ("Molecular Beacons"). En estos tipos, la molécula fluorescente y la

molécula que absorbe la fluorescencia se mantienen próximas mediante la formación de una
horquilla de hibridación. Esta horquilla se abre durante la amplificación, aumentando la emisión
de fluorescencia, como se muestra en la figura.
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• Doble sonda marcada o sondas de hibridación (sondas "LightCycler"). En este caso se emplean
dos sondas marcadas con moléculas fluorescentes en posición 5' (sonda A) y 3' (sonda B) y que
hibridan en regiones adyacentes del DNA diana. Cuando se produce la hibridación, la primera
sonda emite fluorescencia que excita al colorante de la segunda sonda, produciendo una señal
detectable.

Principio de funcionamiento de las dobles sondas marcadas; la fluorescencia emitida por la sonda
A excita al fluorocromo de la sonda B, que a su vez emite fluorescencia.

Lectura e interpretación de los resultados de una PCR en tiempo real

La visualización de los resultados se consigue mediante la integración de la señal fluorescente y

se refleja en una curva de amplificación, considerándose que hay un resultado positivo cuando la
señal emitida es superior al umbral establecido; el ciclo en que se considera que se obtiene la
señal positiva está relacionado con la cantidad inicial de DNA molde.

Ejemplo de gráfica obtenida en un experimento

de PCR en tiempo real.
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c. APLICACIONES DE LA PCR

La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de

detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada,
como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.

 La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido
a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los
fragmentos de ADN de interés.
 Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que contienen una
secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido.
 Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso.
 En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del patógeno en el
ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la
determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.5
 La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de
donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones
peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de
incubación.
 El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma.
 Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología forense
se han visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas ellas construyen
con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas
de seres vivos.
 En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener
pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u
otros restos de tejidos.
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Bibliografía.

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1997.

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Panamericana; 2007.

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5. Nussbaum L, Roderick R, Huntington F. Thompson &Thompson. Genética en Medicina.

7ma ed. Madrid: Elsevier; 2008.