Cultivos y productos industriales 154 (2020) 112675

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Cultivos y productos industriales

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Aplicación potencial de uva ( Vitis vinifera L.) extractos de tallo en las industrias cosmética y
farmacéutica: Valorización de un subproducto

Carla Leal un , Irene Gouvinhas un , * , Rafaela A. Santos un , Eduardo Rosa un , segundo , Amélia M. Silva un , C ,
María José Saavedra un , re , Ana IRNA Barros un , mi
un Centro de Investigación y Tecnología de Ciencias Agroambientales y Biológicas (CITAB-UTAD), Universidad de Trás-os-Montes y Alto Douro (UTAD), 5000-801 Vila Real, Portugal

segundo Departamento de Agronomía, Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias, UTAD, Quinta De Prados, 5000-801 Vila Real, Portugal
C Departamento de Biología y Medio Ambiente, Facultad de Ciencias de la Vida y Medio Ambiente, UTAD, Quinta de Prados, 5001-801 Vila Real, Portugal
re Departamento de Ciencias Veterinarias, Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias, UTAD Quinta de Prados, 5000-801 Vila Real, Portugal
mi Departamento de Química, Facultad de Ciencias de la Vida y Medio Ambiente, UTAD, Quinta de Prados, 5001-801 Vila Real, Portugal

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: Los desechos de la industria del vino pueden causar problemas de manera sostenible, por lo que requieren su reutilización. De esta forma, a través de estos residuos se pueden generar

Tallo de uva nuevos productos, lo que brinda ventajas ambientales, sociales y económicas. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue determinar la composición fenólica de seis variedades de
Actividades biologicas extractos de tallo de uva mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento y evaluar sus actividades biológicas (antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatoria y antienvejecimiento). Los
Resistencia bacteriana
resultados mostraron que los extractos de tallos de uva confirman ser una fuente potencial de compuestos fenólicos, siendo la catequina el compuesto más abundante en todas las
Inflamación
variedades (0,44 ± 0,02–2,03 ± 0,08 mg / g de peso seco). Los extractos de tallo de uva también presentaron actividad antioxidante, alcanzando valores de hasta 0,84 ± 0,06, 0,64 ± 0,05 y
Anti-envejecimiento
1,03 ± 0,06 mmol Trolox / g peso seco para ABTS, DPPH, y ensayos FRAP, respectivamente. En cuanto a la actividad antimicrobiana, los extractos presentaron alta eficacia frente a las
Industrias cosmética / farmacéutica
úlceras de las heridas del pie por bacterias Gram-positivas. Además, los extractos presentaron capacidad antiinflamatoria demostrando inhibiciones de la producción de Óxido Nítrico, por

macrófagos estimulados por lipopolisacáridos, hasta un 35,25%, y revelaron, por primera vez, efecto anti-envejecimiento al inhibir la anti-tirosinasa (∼54 %) y actividades anti-elastasa (∼98%).

Por tanto, el tallo de la uva ha demostrado su potencial biológico, siendo de interés para las industrias cosmética, farmacéutica y alimentaria. por macrófagos estimulados por

lipopolisacáridos, hasta 35,25%, y reveló, por primera vez, efecto anti-envejecimiento al inhibir las actividades anti-tirosinasa (∼54%) y anti-elastasa (∼98%). Por tanto, el tallo de la uva ha

demostrado su potencial biológico, siendo de interés para las industrias cosmética, farmacéutica y alimentaria. por macrófagos estimulados por lipopolisacáridos, hasta 35,25%, y reveló, por

primera vez, efecto anti-envejecimiento al inhibir las actividades anti-tirosinasa (∼54%) y anti-elastasa (∼98%). Por tanto, el tallo de la uva ha demostrado su potencial biológico, siendo de

interés para las industrias cosmética, farmacéutica y alimentaria.

1. Introducción
El uso eficiente de los recursos mediante la minimización de los residuos, la retención de valor a
largo plazo, la reducción de los recursos primarios y los ciclos cerrados de productos dentro de los
límites de la protección ambiental y las ventajas socioeconómicas puede definirse como Economía
Circular. Este modelo económico mejora el desarrollo sostenible al tiempo que disminuye las
consecuencias negativas de la falta de recursos y la degradación ambiental ( Morseletto, 2020 ).
Diversas actividades del sector agropecuario generan grandes cantidades de subproductos y
desechos, donde estos desechos pueden causar problemas de sustentabilidad por las grandes
cantidades producidas en un período de tiempo limitado y por el contenido de materia orgánica ( Coderoni
y Perito, 2019 ). Una de estas actividades es la producción de uva, alcanzando 73,3 millones de
toneladas en 2017. Se estima que el 52% de
esta producción se destina a la industria del vino ( OIV, 2018 ), donde se generan grandes cantidades
de subproductos, como orujo de uva, semillas, pulpa, hollejos, hojas, tallos y lías de vino ( Gouvinhas
et al., 2019 ). La recuperación de estos subproductos / residuos se ha vuelto cada vez más
importante, aportando múltiples beneficios ambientales, económicos y sociales, ya que su
reutilización genera la producción de nuevos productos agregados, como consecuencia de este
enfoque circular ( Coderoni y Perito, 2019 ). El tallo de uva, que representa el 25% del total de
subproductos, es el menos caracterizado y valorado de todos los subproductos generados ( Barros et
al., 2014 ). Este subproducto es una rica fuente de compuestos fenólicos, celulosa, hemicelulosas y
ligninas ( Gouvinhas et al., 2019 ). Sin embargo, generalmente se destina a la producción de bebidas
espirituosas, fibra dietética, concentrados de proteínas vegetales, fertilizantes ( Domínguez-Perles et
al., 2014 ) y piensos ( Sahpazidou et al., 2014 ).

• Autor para correspondencia en: Centro de Investigación y Tecnología de Ciencias Agroambientales y Biológicas, Universidad de Trás-os-Montes y Alto Douro, (CITAB-UTAD), Quinta de Prados, 5000-801

Vila Real, Portugal.

Dirección de correo electrónico: igouvinhas@utad.pt (I. Gouvinhas).

https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112675
Recibido el 13 de marzo de 2020; Recibido en forma revisada el 3 de junio de 2020; Aceptado el 6 de junio de 2020 0926-6690 / © 2020

Elsevier BV Todos los derechos reservados.

C. Leal y col.
En los últimos años, los compuestos bioactivos presentes en los subproductos han llamado la
atención por sus beneficios para la salud, lo que ha generado un creciente interés de la comunidad
científica por la exploración de estos residuos ( Gouvinhas et al., 2018 ). Los compuestos fenólicos
son metabolitos secundarios producidos por plantas que demostraron tener varios beneficios para la
salud, actuando como antioxidantes, antimicrobianos, anticancerígenos, antidiabéticos, entre otros ( Gouvinhas Los compuestos radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (% DPPH), sal diamonio del ácido
et al., 2019 ). En cuanto a la composición polifenólica de los tallos de uva, se identificaron varios
compuestos fenólicos, como los flavonoles ( p.ej quercetina-3- O- rutinosido, kaempferol- 3- O- glucósido), 7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox), persulfato de potasio, 2,4,6-Tris (2-piridil) -s-triazina
flavanoles ( p.ej catequina, epicatequina), antocianinas ( p.ej
malvidina-3- O- glucósido, malvidina-3- O- ( 6- O- cafeoil) -glucósido), ácidos fenólicos ( p.ej ácidos
gálico, cafeico y caftárico), estilbenos ( p.ej trans-resveratrol, Ɛ-viniferina) y procianidinas (p. ej. gramo.
procianidina B2 y B3) ( Anastasiadi y col., 2012 ; Barros et al., 2014 ; Dias et al., 2015 ;
Domínguez-Perles et al., 2016 ; Gouvinhas et al., 2018 ; Sahpazidou et al., 2014 ).
El cuerpo humano, cuando se expone a condiciones externas (por ejemplo, contaminantes,
radiación y patógenos) produce una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que
provoca estrés oxidativo y también puede inducir inflamación ( Zhang y Tsao, 2016 ). Los compuestos
fenólicos previenen o inhiben la producción de ROS, suspendiendo los procesos de oxidación y
reparando las deficiencias de los tejidos ( Baenas et al., 2018 ). Además, aunque los antiinflamatorios
no esteroideos son los más utilizados en el mundo para combatir la inflamación, tienen efectos
secundarios indeseables, por ejemplo en los riñones y el sistema cardiovascular, lo que limita su uso.
Así, se están realizando nuevos estudios para identificar compuestos naturales que puedan aplicarse
como agentes antiinflamatorios o en el desarrollo de nuevos fármacos ( Aouey et al., 2016 ). Además, el
2018, en Quinta do Pinto, Alenquer (Lisboa). Después de la cosecha, se lavaron los tallos de la uva y
estrés oxidativo y la inflamación también están relacionados con los procesos de envejecimiento ( Martín-Ortega
y Campos, 2019 ), donde los cambios en la actividad biosintética de las células de la piel, a saber,
algunas proteínas de la matriz constitutiva y extracelular ( p.ej colágeno y elastina), así como en una
modulación de la actividad simultánea de varias enzimas relacionadas con el envejecimiento ( p.ej elastasa, análisis.
tirosinasa) ( Aguilar-Toalá et al., 2019 ; Taghouti et al., 2018 ). La enzima tirosinasa (también llamada
monofenol monooxigenasas), en los seres humanos, es responsable de la síntesis de melanina en los
melanocitos, pero cuando se produce una sobreproducción de melanina en la piel, se producen
trastornos de la pigmentación, como hiperpigmentación, exceso de bronceado, manchas de la edad y
melasma ( Liyanaarachchi et al., 2018 ). La elastasa es una enzima que hidroliza la elastina, influyendo
en las propiedades mecánicas de los tejidos conectivos, por lo que cuando se observa una alta
actividad de esta enzima, o se produce menos elastina, la piel pierde firmeza y elasticidad ( Aguilar-Toalá
et al., 2019 ). La resistencia a los antibióticos es un problema de salud pública en todo el mundo, que
tiene un impacto en las tasas de morbilidad y / o alta mortalidad, especialmente en los países en
desarrollo ( Lima et al., 2019 ). Microorganismos específicos como
Listeria monocytogenes y Escherichia coli están presentes con frecuencia en los alimentos procesados,
lo que constituye un riesgo para la salud ( Gutiérrez-del-Río et al., 2018 ). Además, una de las
principales causas de hospitalización a nivel mundial son las infecciones por úlceras del pie diabético,
en su mayoría causadas por Staphylococcus aureus ( Zenão et al., 2017 ). Para combatir la resistencia
bacteriana, se deben buscar y desarrollar antibióticos alternativos para superar la efectividad de los que
están disponibles actualmente ( Lima et al., 2019 ).
Por lo tanto, para reemplazar las drogas sintéticas / antibióticos con compuestos naturales más
efectivos, existe una demanda creciente de encontrar compuestos naturales que puedan usarse en el
desarrollo de nuevos productos. El tallo de la uva puede integrarse en esta demanda por su
contenido polifenólico, potenciando así el desarrollo sostenible, con ventajas tanto para el medio
ambiente como para la economía empresarial. De esta forma, el objetivo de este estudio fue evaluar
la actividad depuradora y la actividad antimicrobiana de los extractos de tallo de uva, frente a
bacterias de heridas gastrointestinales y del pie diabético. Además, la actividad antiinflamatoria y
anti-envejecimiento, permite comprobar si este subproducto será una buena apuesta para producir
nuevas formulaciones. Esta investigación permitió determinar, por primera vez, no solo las
actividades anti-tirosinasa y anti-elastasa de los tallos de uva,
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2. Material y métodos
2.1. Quimicos
2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS% +), 6-hidroxi-2,5, Ácido
(TPTZ), cloruro férrico y las enzimas tirosinasa, elastasa y reactivos para todas las actividades
enzimáticas se adquirieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Se adquirieron agua salina
(NaCl al 0,9%), metanol y sulfanilamida de Merck (Merck, Darmstadt, Alemania). Todos los medios
de cultivo y antibióticos utilizados en la actividad antimicrobiana se adquirieron de Oxoid (Oxoid
Limited, Thermo Fisher Scientific Inc.). Se obtuvo agua ultrapura utilizando un sistema de purificación
de agua Millipore. El ácido clorhídrico se adquirió de Fluka Chemika (Neu-Ulm, Suiza). Medio de
Eagle modificado de Dulbeco (DMEM), ® ( AB) se obtuvieron de Invitrogen (Alfagene, Portugal).
2.2. Muestreo
Para la realización de este trabajo la muestra estuvo constituida por seis uvas ( Vitis vinifera L.)
variedades de tallos: Tinta Roriz, Touriga Nacional, Castelão, Syrah (variedades tintas), Arinto y
Fernão Pires (variedades blancas). Estas variedades fueron recolectadas durante la temporada
posteriormente se secaron en estufa (Memmert, Schwabach, Alemania) durante 72 ha 40 ° C. Luego,
las muestras se trituraron y almacenaron a temperatura ambiente protegidas de la luz hasta el
2.3. Preparación de extractos de tallo de uva
Para la preparación del extracto, 40mg del previamente molido
se pesó tallo de uva y 1,5 ml de MeOH / H 2 Se añadió una mezcla de O (70:30, v / v). Luego, las
muestras se agitaron y agitaron durante 30 min.
a temperatura ambiente, para la extracción de los compuestos fenólicos, y después de centrifugar a
10.000 rpm durante 15 min, a 4 ° C (Sigma, Steinheim, Alemania), recogiendo el sobrenadante ( Leal
et al., 2020 ). Este procedimiento se repitió 3 veces para cada muestra de tallo de uva. Los
sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de PVDF de 0,45 µm (Millex HV13, Millipore, Bedford,
MA, EE. UU.) Y se almacenaron a 4 ° C hasta su análisis.
2.4. Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos por HPLC
El perfil fenólico de las muestras de tallos de uva se evaluó mediante Fase Inversa -
Cromatografía líquida de alto rendimiento - Detector de matriz de diodos (RP-HPLC-DAD), con una
columna C18 (250 × 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 μm; ACE, Aberdeen, Escocia) , como el
método expuesto por Queiroz y col. (2017) . En este trabajo, el método HPLC de fase inversa se basa
en un móvil polar
fase con la mezcla de disolvente A: H 2 O / HCOOH (99,9: 0,1, v / v) y
disolvente B: CH 3 CN / HCOOH (99,9: 0,1, v / v) y una fase estacionaria con características no
polares. Se utilizó el siguiente esquema de gradiente lineal (t
en min; % B): (0; 5%), (15; 15%), (30; 30%), (40; 50%), (45; 95%), (50; 95%) y (55; 5 %). A los 55
minutos, vuelva al 5% de B para estabilizar y preparar la columna para la siguiente muestra. El
análisis se realizó a temperatura ambiente, 25 ° C, con un caudal de 1,0 ml / min y un volumen de
inyección de muestra de 20 μL. Todas las muestras se inyectaron por triplicado. El equipo constaba
de una bomba LC (SRVYR-LPUMP), un muestreador automático (SRVYR-AS) y un detector de
matriz de fotodiodos (SRVYR-PDA5) en serie (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EE. UU.).
Para los compuestos identificados a 280 nm, se utilizaron estándares de epicatequina, ácido caftárico
y ácido elágico para cuantificar flavonoides, ácidos hidroxicinámicos y ácidos hidroxibenzoicos,
respectivamente. Para los compuestos reconocidos a 330 nm, los estándares de
C. Leal y col.
ácido caftárico, quercetina-3- O- El rutinósido y el resveratrol se utilizaron para cuantificar,
respectivamente, ácidos hidroxicinámicos, flavonoles y estilbenos. Finalmente, para la cuantificación
de antocianinas a 520 nm una malvidina-3- O-
Se utilizó el estándar de galactósido.
2.5. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante fue determinada por ABTS · +, DPPH · y métodos FRAP. El ABTS • + y
DPPH · Los ensayos se adaptaron a microescala de acuerdo con Mena et al. (2011) . En ABTS • + ensayo,
la actividad antioxidante se evaluó midiendo la variación en la absorbancia a 734 nm después de 30
minutos de reacción, mientras que en el ensayo DPPH esta actividad se determinó midiendo la
variación en la absorbancia a 520 nm después de 15 minutos de reacción. El ensayo FRAP se
adaptó a una microescala y se realizó de acuerdo con Bolaños de la Torre et al. (2015) . La reacción
se incubó a 37 ° C protegida de la luz durante 30 min y se leyó la absorbancia a 593 nm. Los
ensayos se realizaron utilizando un lector de microplacas Multiscan FC (Thermo-Fisher Scientific,
Oporto, Portugal) y los resultados se expresaron como milimoles de Trolox por gramo de peso seco
(mmol T / g dw).
2.6. Aislados bacterianos
Se recolectaron aislamientos clínicos de muestras biológicas del segmento gastrointestinal de
humanos y úlceras del pie diabético, provistas por el Centro Hospitalario de Trás-os-Montes y Alto
Douro (CHTMAD), bajo el protocolo establecido desde 2004, perteneciente al MJS, Colecciones
MJMC y MJH. Bacterias grampositivas Staphylococcus aureus
MJS241 y Enterococcus faecalis MJS257 y bacterias gramnegativas
Escherichia coli MJS260 y Klebsiella pneumoniae MJS281 se obtuvieron del segmento
gastrointestinal clínico-humano, mientras que los aislados Gram positivos Staphylococcus aureus MJMC109muestras, se tomó un volumen de 100 μL y se esparció en placas de Petri con agar Muller-Hinton.
y Staphylococcus aureus
MJMC534B y cepas gramnegativas Klebsiella pneumoniae MJH602 y Enterobacter aerogenes MJMC534A crecimiento bacteriano. En caso de crecimiento, se consideró que la concentración mínima inhibitoria
se recogieron de úlceras de pie diabético. Los aislados bacterianos fueron previamente identificados
por métodos bioquímicos (API 20E, API 20NE, API Staphy (BioMérieux)) y por métodos moleculares,
a saber, la secuenciación parcial del gen 16S rRNA. También se utilizaron bacterias de referencia
obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC), específicamente Listeria monocytogenes
ATCC 15313 (Gram-positivo) y Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 (Gram-negativos), y de la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), a saber Staphylococcus aureus CECT 976
(Gram-positivo). Antes de las pruebas de actividad antimicrobiana, las cepas se cultivaron en agar
BHI durante 24 ha 37 ° C ( Gouvinhas et al., 2020 ).
2.7. Actividad antimicrobiana
2.7.1. Ensayo de difusión en disco
El método de difusión en disco se realizó según lo descrito por
Gouvinhas y col. (2018) . En este método las suspensiones se realizaron a partir de un cultivo puro en
NaCl al 0,9%, y la turbidez se ajustó al valor de 0,5 McFarland. A continuación, se cultivaron
suspensiones de los aislados bacterianos con un hisopo en placas de Petri (90 mm de diámetro) que
contenían 20 ml de agar Muller-Hinton. Posteriormente, se colocaron sobre las placas discos blancos
estériles (6 mm de diámetro) utilizando un dispensador de discos (OXOID) y se impregnaron con 10
μL de las diferentes muestras (disueltas en DMSO al 10%) a la misma concentración (200 mg / mL).
En las pruebas realizadas, se utilizaron antibióticos comerciales, a saber, Gentamicina 10 μg,
Gentamicina 30 μg y Ciprofloxacina 10 μg, como controles positivos y DMSO al 10% como control
negativo. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, se midieron los halos de inhibición del crecimiento
microbiano alrededor de los discos impregnados con las muestras y los antibióticos.
La actividad antimicrobiana se calculó de acuerdo con lo siguiente
ecuación: '% RIZD = (IZD muestra - IZD control negativo) / IZD antibiótico X 100% ',
donde IZD corresponde a halos de inhibición (mm) y RIZD al per-
centaje del diámetro relativo del halo de inhibición ( Gouvinhas y col.,
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2018 ). Esta ecuación considera y compensa el posible efecto de un disolvente (blanco) distinto del
agua. Además, la actividad antimicrobiana de cada extracto también se clasificó de acuerdo con lo
siguiente: Sin efecto (0): halo de inhibición = 0; Eficacia moderada (0-100): 0 <halo de inhibición
<halo de inhibición del antibiótico; Buena eficacia (> 100): halo de inhibición de antibióticos <halo de
inhibición <2 x halo de inhibición de antibióticos; Alta eficacia ( ▲): halo de inhibición> 2 x halo de
inhibición del antibiótico.
2.7.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC)
Se realizó el método de concentración mínima inhibitoria (MIC), con algunas modificaciones
según lo informado por Dias y col. (2015) . Los cultivos bacterianos se pasaron a matraces con caldo
Muller-Hinton y se incubaron a 37 ° C durante 12-18 h. Luego, la absorbancia de la suspensión
bacteriana se ajustó a 0.100 con una longitud de onda de 625 nm, para obtener una concentración
de 1 × 10 8 ufc / mL. En la primera fila de las microplacas de 96 pocillos (Frilabo, Milheirós, Portugal),
se agregaron 200 μL de cada muestra (30mg / L), previamente disueltos en DMSO al 10%, y se
agregaron los controles positivo y negativo. En los pocillos restantes, se agregaron 100 μL de caldo
Muller-Hinton y se realizaron ½ diluciones seriadas para todas las muestras y controles. Como
controles negativos se utilizaron caldo Muller-Hinton y solución de DMSO y como controles positivos
se utilizaron los antibióticos gentamicina y ciprofloxacina como controles positivos, teniendo la misma
concentración de muestras. Luego, se agregaron 20 μL de suspensión bacteriana. Finalmente, se
agregaron a cada pocillo 20 μL de solución indicadora de resazurina, preparada disolviendo una
tableta de 270 mg en 40 ml de agua estéril. Las microplacas se incubaron a 37 ° C durante 18, y
luego se evaluó visualmente el cambio de color.
Posteriormente, de cada pocillo que contenía la concentración mínima inhibitoria de las
Las placas de Petri se incubaron a 37 ° C durante 24 h, y al final de este período se observó si había
tenía acción bacteriostática, pero si no había crecimiento se consideró que tenía acción bactericida.
2.8. Ensayo de viabilidad celular y cultivo celular
La línea celular Raw 264.7 (macrófagos de ratón, tumor inducido por el virus de la leucemia
murina de Abelson, CLS, Alemania) se cultivó en matraces (Orange Scientific, Frilabo, Portugal) con
medio de cultivo DMEM, complementado con FBS al 10% (v / v), y antibióticos (100 U / mL de
penicilina y 100 μg / mL de estreptomicina) a 37 ° C en una atmósfera de 5%
CO 2 / 95% de aire con humedad controlada y manipulado según lo descrito por
Queiroz y col. (2017) .
Para el ensayo de viabilidad celular, las células se incubaron en medio de cultivo fresco libre de
FBS (control) y en medio de cultivo fresco libre de FBS que contenía los extractos de tallo de uva
(previamente resuspendidos en solución salina tamponada con fosfato (20 mg / ml)) con
concentraciones finales que oscilan entre 1,00 y 50,00 μg / mL para los extractos de Touriga
Nacional, Syrah y Fernão Pires, 5,00–75,00 μg / mL para los extractos de Tinta Roriz y Castelão, y
25,00-150,00 μg / mL para el extracto de Arinto. Las células se expusieron a extractos durante 24 hy
48 h, y después del tiempo de exposición, el medio de cultivo se reemplazó con medio libre de FBS
suplementado con 10% (v / v) Alamar Blue (AB). Después de 4 h, se leyó la absorbancia a 570 y 620
nm usando un lector de microplacas Multiskan EX (MTX Labsystems, EE. UU.). La viabilidad celular
se calculó como se informa en Andreani y col. (2014) y los resultados se expresaron como porcentaje
de control (células no expuestas).
2.9. Actividad antiinflamatoria
La actividad antiinflamatoria de los extractos de tallo de uva se realizó según lo informado por Queiroz
y col. (2017) . Las células se incubaron,
C. Leal y col. Cultivos y productos industriales 154 (2020) 112675

durante 24 h, en medio fresco libre de FBS que contenga extractos de tallo de uva, en ausencia y en
presencia de 1 μg / mL LPS (lipopolisacárido), para inducir la producción de nitrito (NO). En cada
condición se hizo un control (células no expuestas a extractos). Los extractos de tallo de uva se
aplicaron a diferentes concentraciones, a saber, 5,00, 12,50 y 25,00 μg / mL para los extractos de
Tinta Roriz, Touriga Nacional, Castelão, Syrah y Fernão Pires, y 12,50, 25,00, 50,00 y 75,00 μg / mL
para Arinto. extraer.
La producción de NO se midió colorimétricamente con el reactivo de Griess después de 24 h de
incubación. De cada pocillo, se transfirieron 50 μL de sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos
y 50 μL de reactivo de Griess (0,1% (p / v) de dihidrocloruro de N- (1-naftil) etilendiamina en agua y
Inicialmente, 50 μL de cada muestra (1 mg / mL), más 160 μL de tampón Tris-HCl (0,20 mM, pH 8) y
20 μL de N- (metoxisuccinil) -ala-ala-pro- val-4-nitroanilida ( 0,80 mM, en tampón) y se incubaron
durante 10 min a temperatura ambiente. Luego, se agregaron 20 μL de elastasa (0.40 U / mL, en
tampón Tris-HCl) para iniciar la reacción, esta se incubó por 20min a temperatura ambiente.
Posteriormente, se leyó la absorbancia a 410 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo-Fisher
Scientific, Oporto, Portugal). Se utilizó metanol como control positivo. La inhibición de elastasa se
calculó de acuerdo con la ecuación mencionada anteriormente (sección 2.9 .1).

1% (p / v) de sulfanilamida preparada en 5,0% (p / v) H 3 correos 4 ( v / v)). Las placas se incubaron a

2.11. análisis estadístico
temperatura ambiente protegidas de
luz durante 10 min, y la absorbancia se leyó a 550 nm usando un lector de microplacas Multiskan EX
Los datos de composición fenólica y actividades antioxidantes y antienvejecimiento se
(MTX Labsystems, EE.UU.). Para la cuantificación de la producción de NO se utilizó una curva
sometieron al software estadístico IBM SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.), Utilizando
estándar de nitrito de sodio (0-100 μM) y los resultados se expresaron como porcentaje de
análisis de varianza (ANOVA) y una prueba de rango múltiple (prueba de Tukey), para pags- valor
producción de NO, en relación al control.
<0,05. Los resultados de las muestras se presentan como valores medios ± desviación estándar (n =
3). Los datos de viabilidad celular y actividad antiinflamatoria se sometieron al software GraphPad
Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), Utilizando ANOVA unidireccional y
2.10. Actividad anti-envejecimiento bidireccional junto con una prueba de comparación múltiple (prueba de Tukey), para un pags- valor
<0,05. Los resultados de las muestras se presentan como valores medios ± desviación estándar (n =
2.10.1. Ensayo de inhibición de tirosinasa 4).
En este ensayo, informado por Taghouti y col. (2018) , 25 μL de cada
muestra (1 mg / mL), más 80 μL de tampón fosfato (50 mM, pH 6,8) y 40 μL de L-DOPA (2,50 mM), y
la placa se incubó durante 2 min a 37 ° C. Luego, se agregaron 40 μL de tirosinasa (40 U / mL, en
3. Resultados y discusión
tampón fosfato (50 mM, pH 6.5)) para iniciar la reacción. La reacción se incubó durante 10 min a 37 °
C y, pasado este tiempo, se leyó la absorbancia a 492 nm, en el lector de microplacas
3.1. Compuestos fenólicos identificados y cuantificados en extractos de tallos de uva
(Thermo-Fisher Scientific, Oporto, Portugal). Se utilizó metanol como control positivo. La inhibición de
la tirosinasa se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:
La identificación de compuestos fenólicos por RP-HPLC-DAD se realizó mediante comparación
con estándares puros de espectros DAD, tiempos de retención y datos de la literatura ( Anastasiadi y
col., 2009 ; Gouvinhas et al., 2018 ; Queiroz et al., 2017 ). En los extractos de tallo de uva se
'% Inhibición = (Abs controlar - Abdominales muestra) / Abdominales contro lx 100% '.
identificaron y cuantificaron once compuestos fenólicos pertenecientes a diferentes clases, a saber,
ácidos hidroxibenzoico e hidroxicinámico, flavonoles, flavonoles, estilbenos y antocianinas ( tabla 1 ).
2.10.2. Ensayo de inhibición de elastasa Al analizar el
Para la inhibición de elastasa, el Taghouti y col. (2018) se utilizó el método.

tabla 1
Compuestos fenólicos identificados en extractos de tallo de uva y su cuantificación.

Compuestos identificados λ Rt Tinta Roriz Touriga Nacional Castelão Syrah Arinto Fernão Pires pags- valor

X 0,04 ± 0,00 segundo X 0,04 ± 0,00 un X 0,05 ± 0,00 C

(1) ácido gálico 280 nm 10,93 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE **
X 0,40 ± 0,02 C X 0,12 ± 0,00 un
(2) Ácido protocatechico 280 nm 14.57 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE 0,24 ± 0,01 segundo 0,26 ± 0,00 segundo ***
X 1,62 ± 0,11 re
(3) Catequina 280 nm 18,62 2,03 ± 0,08 mi 0,44 ± 0,02 un 1,33 ± 0,02 C 0,66 ± 0,04 segundo 1,27 ± 0,03 C ***
(4) Epicatequina 280 nm 21.24 0,09 ± 0,00 segundo 0,18 ± 0,01 re 0,04 ± 0,00 un 0,11 ± 0,00 C 0,03 ± 0,00 un 0,17 ± 0,00 re ***
(5) Trans- ácido cinámico 280 nm 31,99 0,08 ± 0,00 un 0,16 ± 0,01 C 0,09 ± 0,01 un 0,08 ± 0,00 un 0,14 ± 0,00 antes de Cristo 0,13 ± 0,01 segundo ***
(6) ácido caftárico 330 nm 17,69 0,43 ± 0,01 segundo 0,98 ± 0,08 re 0,20 ± 0,00 un 0,40 ± 0,01 segundo 0,22 ± 0,00 un 0,68 ± 0,04 C ***
(7) Q-3- O- Rodera 330 nm 25,39 0,37 ± 0,01 C 0,44 ± 0,00 re 0,24 ± 0,01 segundo 0,41 ± 0,01 discos compactos 0,15 ± 0,00 un 0,44 ± 0,03 re ***
(8) Resveratrol 330 nm 29.02 0,07 ± 0,00 ab 0,14 ± 0,00 re 0,07 ± 0,00 segundo 0,06 ± 0,00 un 0,08 ± 0,00 C 0,09 ± 0,00 C ***
(9) Ɛ-viniferina 330 nm 32,50 0,07 ± 0,00 un 0,11 ± 0,01 C 0,07 ± 0,00 un 0,07 ± 0,00 un 0,07 ± 0,00 un 0,08 ± 0,00 segundo ***
(10) Mv-3- O- Glt 520 nm 18,65 0,37 ± 0,02 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE - - -
(11) Mv-3- O- Glc 520 nm 25,38 0,36 ± 0,01 re 0,10 ± 0,01 segundo 0,06 ± 0,00 un 0,19 ± 0,01 C - - ***

Q: quercetina; Rut: Rutinoside; Mv: malvidina; Glt: galactósido; Glc: glucósido; λ: longitud de onda; R t: tiempo de retención (min); ND: No detectado. Los valores se presentan como media ±
desviación estándar (n = 3). Letras diferentes indican resultados significativamente diferentes (ANOVA, p < 0,05).
Significado: no significativo, NS ( p> 0,05); * significativo en p < 0,05; ** significativo en p < 0,01; *** significativo en p < 0,001.
X Los resultados se expresan como mg / g dw.

4
C. Leal y col. Cultivos y productos industriales 154 (2020) 112675

Tabla 2 contenidos promedio presentados para las variedades evaluadas en el presente estudio.
Capacidad de barrido de extractos de tallo de uva por métodos ABTS, DPPH y FRAP. Sahpazidou y col. (2014) también cuantificaron en su trabajo los compuestos ácido gálico, catequina,
epicatequina, resveratrol y quercetina-3- O- rutinosido (o rutina), obteniendo concentraciones medias
Muestras ABTS DPPH FRAP
de 19,24, 9,49,
X 0,70 ± 0,02 re X 0,61 ± 0,03 Delaware X 0,94 ± 0,02 discos compactos
Tinta Roriz 13.05, 12.99 y 19.56mg / g dw, siendo estos valores superiores a los presentados en el tabla 1 .
Touriga Nacional 0,84 ± 0,06 mi 0,64 ± 0,05 mi 1,03 ± 0,06 mi
Castelão 0,46 ± 0,01 segundo 0,31 ± 0,01 segundo 0,56 ± 0,01 segundo
Se identificaron varios compuestos fenólicos en diferentes variedades, además de los
Syrah 0,59 ± 0,01 C 0,44 ± 0,04 C 0,85 ± 0,02 C
Arinto 0,35 ± 0,00 un 0,15 ± 0,01 un 0,35 ± 0,02 un encontrados en el presente trabajo. Por ejemplo, en variedades portuguesas de tallo de uva se
Fernão Pires 0,69 ± 0,02 re 0,55 ± 0,01 re 0,99 ± 0,02 Delaware detectaron diferentes flavonoles (quercetina, kaempferol e isoramnetina) ( Dias et al., 2015 ; Domínguez-Perles
pags- valor *** *** ***
et al., 2016 ; Gouvinhas et al., 2018 ; Queiroz et al., 2017 ), mientras que en las variedades de tallos de
uva griegas se reconocieron diferentes ácidos, a saber, los ácidos ferúlico, cumarico, cafeico y
Los valores se presentan como media ± desviación estándar (n = 3). Letras diferentes indican
siríngico ( Anastasiadi y col., 2012 , 2009 ;
resultados significativamente diferentes (ANOVA, p < 0,05). Significado: no significativo, NS ( p> 0,05);
* significativo en p < 0,05; ** significativo en p < 0,01; *** significativo en p < 0,001.
Sahpazidou et al., 2014 ).
X Los resultados se expresan como mmol T / g dw.

3.2. Actividad antioxidante de los extractos de tallos de uva

concentraciones obtenidas, se encontraron diferencias significativas entre todas las variedades. En
todas las variedades, la catequina resultó ser el compuesto principal, con una concentración que
varió entre 0,44 ± 0,02–2,03 ± 0,08 mg / g de peso seco. Por lo general, las diferencias observadas
entre variedades se pueden explicar por varios factores, a saber, características genéticas y
fisiológicas de cada cultivar, condiciones agroclimáticas (ubicación geográfica, composición del
suelo, fertilización y condiciones ambientales) y etapa de maduración ( Dias et al., 2015 ; Garrido y
Borges, 2013 ), pero en este caso, dado que todas las variedades se recolectaron en el mismo lugar,
las diferencias en el contenido fenólico se deben principalmente a características genéticas y
fisiológicas.
Respecto a otros estudios sobre compuestos fenólicos identificados y cuantificados en extractos
de tallo de uva, en el trabajo de Dias y col. (2015) , se detectaron y cuantificaron quince compuestos
en las variedades tintas (Sousão, Touriga Nacional, Tinta Barroca, Tinta Amarela), mientras que en
las variedades blancas (Fernão Pires, Viosinho, Rabigato) se cuantificaron trece compuestos. En
común con el presente estudio, se encontraron cinco compuestos, a saber, epicatequina, ácido
caftárico, quercetina-3- O- lado de rutina, Ɛ-viniferina y malvidina-3- O- glucósido. En cuanto a la
epicatecina, se encontraron concentraciones superiores (2199-3184 mg / 100 g ps) que las obtenidas
en el presente trabajo. Por el contrario, las concentraciones de ácido caftárico (5,28-13,85 mg / 100 g
de peso seco), quercetina-3- O- rutinósido (0,27–1,22 mg / 100 g ps) y Ɛ-viniferina (0,22–2,99 mg / 100
g ps) presentaron concentraciones inferiores a las obtenidas en el presente estudio, como se puede
observar en tabla 1 . Relativamente a la presencia de anto- cianinas, el contenido de malvidina-3- O- glucósido
varió entre
2,38-8,02 mg / 100 g ps, y al compararlos con el presente trabajo, fueron menores a las
concentraciones obtenidas para las variedades Tinta Roriz, Touriga Nacional y Syrah.
Adicionalmente, Domínguez-Perles et al. (2016) El estudio cuantificó diez compuestos fenólicos en los
cultivares Tinto Cão, Tinta Barroca, Malvasia Fina y Moscatel Branco, de los cuales solo cuatro
fueron identificados y cuantificados en el presente estudio, siendo el ácido caftárico, quercetina-3- O- rutinósido,
Sousão, Tinta Barroca y Syrah, respectivamente ( Gouvinhas et al., 2018 ), que resultaron ser muy
Ɛ-viniferina y malvidina-3- O-
glucósido. Las concentraciones alcanzadas para el ácido caftárico (2,18 ±
0,13–19,46 ± 1,37 mg / g de peso seco), quercetina-3- O- rutinósido (1.08 ±
0,06–3,42 ± 0,22 mg / g de peso seco), Ɛ-viniferina (2,94 ± 0,16–5,82 ±
0,37 mg / g de peso seco) y malvidina-3- O- glucósidos (18,17 ± 1,12-28,28 ± 1,80 mg / g de peso
seco) fueron significativamente más altos en comparación con los resultados presentados en tabla 1 .
Adicionalmente, Anastasiadi y col. (2012)
El trabajo mostró la presencia de varios compuestos fenólicos en extractos de tallos de uva de seis
variedades griegas rojas y blancas. En comparación con el presente estudio, se detectaron y
cuantificaron componentes comunes, a saber, ácido gálico, catequina, epicatequina, ácido caftárico,
resveratrol y Ɛ-viniferina. Los resultados mostraron que los cultivares griegos analizados tenían un
contenido promedio superior de 79,91%, 35,11% y 74,09% de ácido gálico, resveratrol y Ɛ-viniferina,
respectivamente, que las concentraciones medias obtenidas en el presente trabajo. Por el contrario,
los valores medios alcanzados para catequina, epicatequina y ácido caftárico fueron del 19,76%,
Los resultados con respecto a la actividad antioxidante por métodos ABTS, DPPH y FRAP se
presentan en Tabla 2 . Analizando los resultados, se verificaron diferencias significativas entre
variedades para los tres métodos. En los tres ensayos, la variedad Touriga Nacional mostró el mayor
poder antioxidante, alcanzando valores de 0.84 ± 0.06,
0.64 ± 0.05 y 1.03 ± 0.06mmol T / g dw, para los métodos ABTS, DPPH y FRAP, respectivamente,
mientras que el menor poder antioxidante se obtuvo para la variedad Arinto, presentando valores de
0.35 ± 0.00,
0,15 ± 0,01 y 0,35 ± 0,02 mmol T / g de peso seco para los métodos ABTS, DPPH y FRAP, en
consecuencia. Con base en estudios previos, las diferencias significativas entre variedades se
pueden explicar por diferentes contenidos fenólicos, ya que el contenido fenólico puede estar
correlacionado con la capacidad antioxidante ( Anastasiadi y col., 2012 ; Barros et al., 2014 ; Gouvinhas
et al., 2018 ; Katalinić y otros, 2010 ). En los datos de la literatura, Domínguez-Perles et al. (2014) evaluaron
la capacidad antioxidante de las variedades Touriga Nacional (tinto) y Viosinho (blanco), por el
método ABTS, utilizando diferentes extracciones para comprender los efectos de las
concentraciones de solvente, temperatura y tiempo de extracción. Domínguez-Perles et al. (2014) El
estudio alcanzó valores máximos de capacidad de barrido de 0.18 ± 0.00 y 0.05 ± 0.00 mmol T / g ps
para las variedades Touriga Nacional y Viosinho, respectivamente. Estos resultados mostraron una
capacidad de barrido mucho menor que los obtenidos para las seis variedades de tallo de uva ( Tabla
2 ). En otro trabajo,
Domínguez-Perles et al. (2016) cuantificó la capacidad antioxidante de los extractos de tallo de uva
mediante los ensayos ABTS y DPPH, utilizando dos variedades rojas (Tinto Cão, Tinta Barroca) y
dos blancas (Malvasia Fina, Moscatel), y reportaron una menor actividad antioxidante que la del
estudio actual ( Tabla 2 ). Adicionalmente, Gouvinhas y col. (2018) El estudio cuantificó la capacidad de
captación de extractos de tallo de uva tinta de las variedades Syrah, Tinta Barroca y Sousão
mediante los ensayos ABTS y DPPH durante 64 días de almacenamiento. En cuanto al ensayo
ABTS, se obtuvieron valores promedio de 4.77, 7.76 y 6.44 mmol T / g dw para las variedades
superiores a los alcanzados en el presente estudio. En el ensayo DPPH, Gouvinhas y col. (2018) presentaron
valores promedio de 0.54, 0.90 y 0.84 mmol T / g dw para las variedades Sousão, Tinta Barroca y
Syrah, respectivamente, siendo los resultados mostrados en Tabla 2 inferiores a los alcanzados por
las variedades Tinta Barroca y Syrah. Además, Anastasiadi y col. (2012) El trabajo también determinó
la actividad antioxidante de extractos de tallo de uva mediante el ensayo FRAP, utilizando cultivares
blancos (Asyrtiko, Athiri y Aidani) y rojos (Mandilaria, Mavrotragano y Voidomatis), reportando valores
más altos, en promedio, 64,92% para las variedades blancas. , al compararlo con el valor medio
obtenido en el presente trabajo (0,67 mmol T / g dw). En el caso de las variedades tintas,
presentaron valores superiores, en promedio 59,52%, cuando se comparan con el valor medio
determinado para las variedades tintas ensayadas en el presente estudio (0,85 mmol T / g dw).

También se ha demostrado que otros subproductos de la industria del vino tienen capacidad
34,95% y 81,03% menos, respectivamente, en comparación con el antioxidante. Sin embargo, los extractos de tallo de uva utilizados en

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C. Leal y col. Cultivos y productos industriales 154 (2020) 112675

Tabla 3
Actividad antimicrobiana de extractos de tallo de uva.

Antibióticos CN10 CN30 CIP10

Aislados bacterianos TR Tennesse Connecticut SH Arkansas FP TR Tennesse Connecticut SH Arkansas FP TR Tennesse Connecticut SH Arkansas FP

L. monocytogenes ATCC 15313 45 40 50 50 40 50 41 36 45 45 36 45 39 35 43 43 35 43

S. aureus CECT 976 61 56 50 56 44 56 50 45 41 45 36 45 37 34 31 34 28 34
S. aureus MJS241 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲
E. faecalis MJS257 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲
S. aureus MJMC109 53 53 53 58 47 53 48 48 48 52 43 48 37 37 37 41 33 37
S. aureus MJMC534B 47 53 47 47 47 53 41 45 41 41 41 45 90 100 90 90 90 100
P. aeruginosa ATCC 10145 100 100 100 111 89 111 75 75 75 83 67 83 43 43 43 48 38 48
E. coli MJS260 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
K. pneumoniae MJS281 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
K. pneumoniae MJH602 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E. aerogenes MJMC534A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

TR: Tinta Roriz; TN: Touriga Nacional; CT: Castelão; SH: Syrah; AR: Arinto; FP: Fernão Pires; CN10: gentamicina (10 μg por disco); CN30: gentamicina (30 μg por disco); CIP10: ciprofloxacina (10 μg por
disco); ▲: Extracto eficaz y antibiótico sin efecto.

El presente trabajo, al compararlo con algunos estudios que determinan la actividad antioxidante del
orujo, pepitas y hollejos, ha demostrado tener una capacidad antioxidante igual o superior a estos
subproductos, según la variedad ( Jara-Palacios et al., 2014 ; José Jara- Palacios et al., 2014 ; Ky et
al., 2014 ; Melo et al., 2015 ; Poveda et al., 2018 ; Rockenbach et al., 2011 ; Teles et al., 2018 ),
demostrando ser una matriz con un alto poder antioxidante.
3.3. Actividad antimicrobiana de los extractos de tallos de uva
3.3.1. Difusión de disco
Los resultados de la actividad antimicrobiana de los extractos de tallos de uva mediante el
ensayo de difusión en disco se presentan en Tabla 3 . Estos resultados mostraron que porcentajes
superiores a 100, indican que los extractos tienen un mayor poder inhibidor del crecimiento
de crecimiento bacteriano de P. aeruginosa ATCC 10145 aislado, con un% RIZD que osciló de 50 a>
100, y para E. coli MJS260 y K. pneu- moniae MJS281, no se detectó inhibición del crecimiento
bacteriano por los extractos de tallos de uva ( Gouvinhas et al., 2018 ), como también se muestra en el
presente trabajo ( Tabla 3 ).
Otros subproductos (pieles, semillas, orujo) también demostraron capacidad antimicrobiana,
inhibiendo el crecimiento de diferentes L.monocytogenes,
S. aureus, E. faecalis, y E. coli cepas Butkhup y col., 2010 ; Corrales et al., 2010 ; Zambrano et al.,
2019 ). El potencial antimicrobiano de cada extracto / subproducto puede depender del método de
extracción, el microorganismo probado ( Zambrano et al., 2019 ), y su contenido polifenólico ( Baenas
et al., 2018 ).
3.3.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC)

bacteriano que los antibióticos. Analizando los resultados, también se pudo observar que para el S. La actividad antimicrobiana de los extractos de tallo de uva también se evaluó mediante el

aureus MJS241 y E. faecalis MJS257 aislados no se presentó ningún valor ( ▲), debido a que fue ensayo de Concentración Mínima Inhibitoria, siendo los resultados presentados en Cuadro 4 .

imposible calcular el% RIZD ya que los antibióticos no mostraron ningún efecto, sin embargo los Analizando los resultados, es posible verificar que la CMI de los extractos de tallo de uva frente a

extractos han demostrado efectos beneficiosos con la inhibición del crecimiento de los aislados. aislamientos Gram positivos osciló entre 0,47 y 1,88 mg / mL, según variedad y cepa. Concerniente a S.
aureus CECT 976, S. aureus MJS241 y S. aureus

Sin embargo, el% de RIZD para los extractos probados en estos aislados fue significativamente MJMC109, todas las concentraciones de extractos de tallo de uva expuestas tuvieron efecto

mayor en comparación con los otros, lo que demuestra el potencial de esta matriz para inhibir el bactericida ( Cuadro 4 ). Con respecto a los aislados Gram negativos, los resultados obtenidos

crecimiento bacteriano. Los extractos que no mostraron ninguna inhibición del crecimiento bacteriano presentaron el mismo comportamiento observado en el ensayo de difusión en disco, solo inhibiendo

se presentaron cuando se obtuvo un% RIZD de 0. el crecimiento de P. aeruginosa

Aislamiento ATCC 10145 con CMI de 1,88 a 3,75 mg / ml, según la variedad. La CIM de los extractos

Los extractos de tallo de uva mostraron inhibir el crecimiento bacteriano debido a la acumulación de tallos de uva en los aislados Gram negativos fue superior a la alcanzada para los Grampositivos

de compuestos fenólicos presentes en los tallos de la uva, en la célula de la bicapa lipídica, aislados.

provocando cambios en la estructura y función de la membrana. Los compuestos fenólicos se infiltran

Cuadro 4
en la célula bacteriana, aplicando actividad inhibidora en el citoplasma celular, lo que lleva a la lisis y
Concentración mínima inhibitoria (CIM) de extractos de tallos de uva frente a cepas bacterianas
liberación de ATP intracelular, y también pueden causar pérdida de componentes celulares,
ensayadas.
aumentando la permeabilidad de la membrana citoplasmática ( Mattos et al., 2017 ). Sin embargo, los
extractos de tallo de uva revelaron una considerable actividad antibacteriana frente a todas las Aislados bacterianos TR Tennesse Connecticut SH Arkansas FP
X 1,88 ○ X 1,88 ○ X 1,88 ○ X 1,88 ○ X 1,88 ○ X 1,88 ○
bacterias Gram-positivas, lo que puede indicar que los compuestos fenólicos actúan específicamente L. monocytogenes ATCC
15313
contra la pared celular Gram-positiva, ya que tienen una capa de peptidoglicano mucho más gruesa
que las Gram-negativas. bacterias. Los lipopolisacáridos de la membrana externa de las bacterias S. aureus CECT 976 0,94 • 0.47 • 0,94 • 0,94 • 0,94 • 0,94 •
gramnegativas les dan una resistencia adicional contra los antibióticos y otros compuestos como los S. aureus MJS241 0,94 • 0,94 • 0,94 • 0,94 • 0,94 • 0,94 •

compuestos fenólicos ( Pisoschi et al., 2017 ). E. faecalis MJS257 0,94 • 0,94 • 0,94 ○ 0,94 ○ 1,88 ○ 0,94 ○
S. aureus MJMC109 1,88 • 0,94 • 0,94 • 0,94 • 1,88 • 1,88 •
S. aureus MJMC534B 0,94 • 0.47 ○ 0,94 • 0,94 • 0,94 • 0,94 •
P. aeruginosa ATCC 10145 1,88 • 1,88 • 1,88 ○ 3,75 ○ 3,75 • 1,88 ○
Los resultados obtenidos en el presente trabajo concuerdan con los reportados por Gouvinhas y E. coli MJS260 DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE

col. (2018) , donde se probó la actividad antibacteriana de extractos de tallo de uva de las variedades K. pneumoniae MJS281 DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE

K. pneumoniae MJH602 DAKOTA DEL NORTE

DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
Syrah, Tinta Barroca y Sousão frente a los mismos aislamientos utilizados en el presente trabajo. En
E. aerogenes MJMC534A DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
DAKOTA DEL NORTE
relación a las bacterias Gram-positivas, se observó el mismo comportamiento para

TR: Tinta Roriz; TN: Touriga Nacional; CT: Castelão; SH: Syrah; AR: Arinto; FP: Fernão Pires;
S. aureus MJS241 y E. faecalis MJS257 aislados, ya que los antibióticos no tuvieron ningún efecto sobre la inhibición Concentración bacteriostática: ○; Concentración bactericida: •;
del crecimiento bacteriano, a diferencia de los extractos de tallos de uva. En cuanto a las bacterias Gram negativas, ND: No detectado.
X Los resultados se expresan en mg / mL.
los extractos también exhibieron una inhibición

6
C. Leal y col.
posiblemente porque las bacterias Gram negativas tienen una capa de lipopolisacárido en la
membrana externa que dificulta la penetración de los compuestos fenólicos, como se mencionó en el
punto anterior. Sin embargo, para las bacterias Gram negativas restantes, las concentraciones
ensayadas no fueron suficientes para inhibir su crecimiento bacteriano.
Hay pocos datos en la literatura sobre la actividad antimicrobiana de los tallos de uva por el
método MIC, sin embargo Dias y col. (2015) determinaron la actividad antimicrobiana de extractos de
tallo de uva de siete variedades portuguesas (Sousão, Touriga Nacional, Tinta Barroca, Tinta
Amarela, Fernão Pires, Viosinho y Rabigato), utilizando los mismos aislamientos utilizados en el
presente trabajo, e informaron que ambas Gram positivas ( L. mono- cytogenes ATCC 15313, S.
aureus MJS241 y E. faecalis MJS257) y Gram-negativos ( P. aeruginosa ATCC 10145, E. coli MJS260
y K. pneumoniae MJS281) tenían CIM que oscilaban entre 66,70 y>
134,00 mg / mL, según los cultivares analizados. Estas concentra- ciones son muy altas,
comparadas con las presentadas en Cuadro 4 , pero en el caso de E. coli MJS260, K. pneumoniae MJS281,
K. pneumoniae
MJH602 y E. aerogenes Los aislamientos de MJMC534A pueden significar que pueden ser
necesarias concentraciones más altas que las probadas en el presente trabajo para inhibir su
crecimiento. Además, otros subproductos (pieles, semillas, orujo) también presentados tuvieron
actividad antimicrobiana frente a aislados bacterianos de L. monocytogenes, S. aureus, E. faecalis, P.
aeruginosa, E. coli,
y K. pneumoniae especies, con MIC que oscilan entre 0,24 y> 20,00 mg / ml ( Katalinić y otros, 2010 ; Oliveira
el contenido fenólico de las seis variedades.
et al., 2013 ; Peixoto et al., 2018 ). Una vez más, estas variaciones entre extractos / subproductos se
deben principalmente a las distintas preparaciones de los extractos, el desempeño de los ensayos
microbiológicos, las distintas cepas bacterianas y las diferencias en la composición fenólica de cada
extracto, como se mencionó anteriormente.
Los tallos de uva han demostrado ser una matriz eficaz en la inhibición de bacterias
grampositivas, es decir, patógenos bacterianos del segmento gastrointestinal y úlceras del pie
diabético, siendo un subproducto que podría aplicarse en el futuro para reemplazar a los antibióticos
o en sinergia con ellos, combatiendo contra la resistencia a los antibióticos que existe actualmente, y
también puede ser una matriz utilizada en el desarrollo de un producto innovador y eficaz para curar
las heridas del pie diabético. A pesar de que los tallos de las uvas no son efectivos contra las
bacterias Gram-negativas, debido a su capa de lipopolisacáridos en la membrana externa, los datos
de la literatura muestran que probar concentraciones más altas en el futuro puede conducir a una
mejor inhibición de los aislados Gram-negativos ( Dias et al., 2015 ; Peixoto et al., 2018 ).
3.4. Toxicidad celular y actividad antiinflamatoria de los extractos de tallo de uva
Antes de realizar el ensayo antiinflamatorio, se realizó un efecto de los extractos de tallo de uva
sobre la viabilidad / toxicidad celular. Se probó la toxicidad de los extractos para que la viabilidad
celular no se vea comprometida y, por lo tanto, no pueda interferir con los resultados relacionados
con la actividad antiinflamatoria. En este sentido, se ensayaron diferentes concentraciones de
extractos siendo los resultados (expresados como porcentaje de control) presentados en Figura 1 . Al
observar los resultados se encontraron diferencias significativas, principalmente entre la
concentración más alta ensayada y los controles, y entre las 24 hy 48 h de exposición a la
concentración más alta. Como era de esperar, los extractos fueron más tóxicos a concentraciones
más altas, tanto de exposición de 24 h como de 48 h, mostrando un efecto dependiente de la
concentración y del tiempo. Sin embargo, para la variedad Tinta Roriz, observamos un efecto de
concentración no lineal, lo que puede reflejar el hecho de que, al trabajar con extractos (mezclas
complejas de compuestos bioactivos), diferentes tipos de moléculas antagonistas y sinérgicas, sobre
la viabilidad celular. En este extracto pueden estar presentes los mecanismos de proliferación /
proliferación. Este efecto se observó en ambos periodos de incubación, ya que los ensayos se
realizaron por separado, refuerza la teoría explicada anteriormente.
Tras probar la toxicidad celular de cada variedad, se eligieron concentraciones para la
evaluación de la actividad antiinflamatoria del tallo de la uva, es decir, concentraciones en las que la
viabilidad celular estaba por encima del 90%. De esta forma, se aplicaron extractos de tallo de uva a
concentraciones de 5,00,
12,50 y 25,00 μg / mL, excepto el extracto de variedad Arinto donde se probaron concentraciones de
12,50, 25,00, 50,00 y 75,00 μg / mL. los
7
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Los datos obtenidos sobre la actividad antiinflamatoria de los extractos de tallos de uva se presentan
en Figura 2 . Para todos los extractos, se observaron diferencias significativas en comparación con
los controles y entre las concentraciones probadas. A diferencia de los controles, donde la
producción de NO fue del 100%, los extractos de tallos de uva pudieron inhibir la producción de NO
estimulada por LPS en todas las concentraciones probadas. En presencia de los extractos, la
producción de NO varió entre 64,75% y 83,48% del control, lo que significa que indujeron inhibiciones
de producción de NO entre 16,52% y 35,25%, lo que indica actividad antiinflamatoria. En general,
analizando cada variedad, se puede verificar que la inhibición de la producción de NO fue
dependiente de la concentración, excepto para la variedad Fernão Pires, donde
25,00 μg / mL produjeron una producción de NO (78,29%) ligeramente superior a
12,50 μg / ml (75,97%) ( Figura 2 F). La razón de este comportamiento puede explicarse, nuevamente,
por los diferentes compuestos presentes en el extracto y en su capacidad para modular las vías de
producción de NO inducidas por LPS.
En cuanto a los extractos de tallo de uva más eficaces, la variedad Arinto mostró una mayor
capacidad para inhibir la producción de NO, con
35,25% de inhibición ( Figura 2 MI); sin embargo, los extractos de esta variedad se probaron a
concentraciones más altas. Por tanto, los resultados obtenidos para los extractos de las seis
variedades a 25,00 μg / mL, al comparar, mostraron que a esta concentración es la variedad Syrah la
que presenta mayor capacidad de inhibición de la producción de NO (32,99%) ( Figura 2 RE). Las
distintas eficiencias en la inhibición de la producción de NO pueden explicarse por las diferencias en
Con respecto a los datos de la literatura, hasta donde sabemos, solo Queiroz y col. (2017) probaron
la actividad antiinflamatoria de extractos de tallo de uva en la línea celular Raw 264.7, utilizando
extractos de la variedad Sousão, obteniendo una inhibición en la producción de NO del 37,20%. Las
diferencias observadas entre este estudio y el presente trabajo ( Figura 2 ), puede deberse a las
diferentes concentraciones de extractos aplicados, pero principalmente a la diferente composición
fenólica de los extractos. Con respecto a otros subproductos, en Harbeoui y col. (2019) El trabajo
estudió la capacidad de inhibición del NO de las semillas de uva de los cultivares Syrah, Merlot y
Carignan (en
5.00 μg / mL) en la línea celular Raw 264.7, presentando valores de inhibición de
37,05%, 35,12% y 31,32%, respectivamente.
En el presente estudio, la producción de NO fue estimulada por la adición de LPS
(lipopolisacárido), ya que el LPS hace que los macrófagos activen la producción de cantidades
excesivas de mediadores proinflamatorios, como NO ( vía iNOS (óxido nítrico sintasa inducible,
enzima responsable de la síntesis de NO) modulación) y citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β,
IL-6) ( Harbeoui et al., 2019 ). Sin embargo, los extractos de tallo de uva fueron capaces de inhibir la
producción de NO debido a su contenido polifenólico, atribuyéndose a los compuestos fenólicos la
capacidad de inhibir moléculas proinflamatorias (NO, TNF-α (Factor de necrosis tumoral-α),
Interleucinas (IL) , a saber, IL-1β, IL-6) producción por macrófagos, para estimular la expresión de
marcadores antiinflamatorios e inhibir enzimas proinflamatorias (iNOS y COX-2 (ciclooxigenasa-
2)), provocando una disminución en la producción de NO ( Zhang et al., 2019 ). Las enfermedades
ambientales, inmunes y crónicas, como la diabetes y el cáncer, tienen inflamación en común ( Arulselvan
et al., 2016 ). Por lo tanto, se requiere el desarrollo de fármacos más efectivos para eliminar radicales
NO e inhibir la actividad enzimática de iNOS y / o la expresión del gen iNOS ( Queiroz et al., 2017 ).
En este sentido, los extractos de tallo de uva son buenos candidatos para el desarrollo de nuevos
fármacos que puedan reducir o eliminar la inflamación de los tejidos, ya que tienen la capacidad de
inhibir la producción de radicales NO.
3.5. Actividad anti-envejecimiento de los extractos de tallo de uva
Con el fin de comprender si los tallos de uva se pueden utilizar en productos
anti-envejecimiento, el presente trabajo evaluó la capacidad de los extractos de tallos de uva (1 mg /
mL) para inhibir la actividad de dos enzimas, a saber, tirosinasa y elastasa. Los resultados obtenidos
se presentan en Cuadro 5 . Existen diferencias significativas entre los extractos de las seis variedades.
Para la tirosinasa, los porcentajes de inhibición variaron de
41,47% -53,83%, y para elastasa, oscilaron entre 67,98% y 98,02
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Figura 1. Efecto de extractos de tallo de uva sobre la viabilidad celular de macrófagos de ratón (línea celular Raw 264.7) a las 24 hy 48 h de exposición. (A) Tinta Roriz; (B) Touriga Nacional; (C) Castelão; (D) Syrah;
(E) Arinto; (F) Fernão Pires. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (n = 4). Significancia: no significativa, NS (p> 0.05); * significativo ap <0,05; ** significativo ap <0,01; *** significativo ap
<0,001.

%, lo que demuestra que independientemente de las variedades de extractos de tallo de uva, hubo
una mejor inhibición de la actividad elastasa. Los resultados obtenidos mostraron que la variedad
Syrah presentó una mejor actividad inhibidora de las enzimas analizadas, con 53,83% y 98,02% para
tirosinasa y elastasa, respectivamente, mientras que la variedad Tinta Roriz demostró tener una
menor capacidad para inhibir la actividad tirosinasa (41,47%). %), y la variedad Arinto presentó la
menor inhibición de la actividad elastasa (67,98%).
Hasta donde sabemos, hasta la fecha no se han publicado estudios sobre las actividades
anti-tirosinasa y anti-elastasa de los extractos de tallos de uva, que se presentan aquí por primera
vez. Sin embargo, el Wittenauer
et al. (2015) estudio demostró que los extractos de orujo de uva (cultivar Weisser Riesling) tienen
actividad anti-elastasa, presentando una inhibición del 73,00% (en
35,3 μg / mL) de esta actividad enzimática.
El presente estudio es el primero en reportar las actividades anti-tirosinasa y anti-elastasa de los
extractos de tallo de uva, demostrando que esta materia prima puede, en el futuro, ser aplicada en
productos cosméticos para combatir las arrugas cutáneas y los trastornos de la pigmentación. Dado
que los extractos de tallo de uva también poseen actividad antioxidante y antiinflamatoria, junto con
propiedades anti-envejecimiento, afirman el subproducto del tallo de uva de gran valor agregado para
la industria cosmecéutica.

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Figura 2. Actividad antiinflamatoria de extractos de tallo de uva en macrófagos de ratón (línea celular Raw 264.7). (A) Tinta Roriz; (B) Touriga Nacional; (C) Castelão; (D) Syrah; (E) Arinto; (F) Fernão Pires. Los
resultados se presentan como media ± desviación estándar (n = 4). Significancia: no significativa, NS (p> 0.05); * significativo ap <0,05;
* * significativo ap <0,01; *** significativo ap <0,001.

4. Conclusiones actividades anti-envejecimiento de los tallos de uva, pero también su capacidad para inhibir el crecimiento de

bacterias de úlceras en las heridas del pie, mejorando en gran medida el uso de este subproducto en las

El potencial biológico de los tallos de la uva se demostró, una vez más, en este estudio. Este industrias cosmética y farmacéutica.

subproducto mostró actividad antioxidante, revelando una buena capacidad depuradora; actividad
antimicrobiana, que mostró alta eficacia contra bacterias Gram-positivas, especialmente S. aureus y E.
faecalis; actividad antiinflamatoria, en la que se demostró que todos los extractos inhiben la
producción de NO a concentraciones celulares no tóxicas. Finalmente, también se encontró actividad
anti-envejecimiento, donde se obtuvieron resultados importantes para la inhibición de la actividad de
las enzimas tirosinasa y elastasa. De hecho, este estudio permitió conocer, por primera vez, no solo
Este estudio demostró ser de gran importancia para el cumplimiento del modelo de economía
circular, ya que, al demostrar posibles aplicaciones para el tallo de la uva, presenta nuevos
propósitos para este residuo. Comprobando también que el tallo de uva puede ser reutilizado en la
industria cosmética, farmacéutica y alimentaria, evitando su acumulación y reduciendo los costes de
su tratamiento. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar la toxicidad de este
subproducto, así como para analizar las propiedades biológicas de cada uno de los compuestos
bioactivos presentes en el tallo de la uva en

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C. Leal y col. Cultivos y productos industriales 154 (2020) 112675

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Tinta Roriz 41,47 ± 1,05 un 78,30 ± 2,72 segundo Barros, A., Gironés-Vilaplana, A., Teixeira, A., Collado-González, J., Moreno, DA, Gil-

Touriga Nacional 46,29 ± 2,00 un 86,84 ± 0,42 C Izquierdo, A., Rosa, E., Domínguez-Perles, R., 2014. Evaluación de la uva (Vitis vini- fera L.) procedente de
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Syrah 53,83 ± 0,84 segundo 98,02 ± 1,96 re
2014.07.021 .
Arinto 44,07 ± 0,49 un 67,98 ± 1,32 un
Bolaños de la Torre, AAS, Henderson, T., Nigam, PS, Owusu-apenten, RK, 2015. Corto
Fernão Pires 44,83 ± 2,99 un 72,93 ± 2,33 ab
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pags- valor *** ***
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Los valores se presentan como media ± desviación estándar (n = 3). Letras diferentes indican Butkhup, L., Chowtivannakul, S., Gaensakoo, R., Prathepha, P., Samappito, S., 2010.
resultados significativamente diferentes (ANOVA, p < 0,05). Significado: no significativo, NS ( p> 0,05); Estudio de la composición fenólica de la variedad de uva roja shiraz (Vitis vinifera l.) Cultivada en el noreste de

* significativo en p < 0,05; ** significativo en p < 0,01; *** significativo en p < 0,001. Tailandia y su actividad antioxidante y antimicrobiana. S. Afr. J. Enol. Viticultor. 31, 89–98 .

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Saavedra: Supervisión. Ana IRNA Barros:

Conceptualización, Adquisición de financiación, Supervisión.
Declaración de intereses en competencia
Ninguna.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por Fondos Nacionales de FCT - Fundación Portuguesa de Ciencia y
Tecnología, en el marco del proyecto UIDB / 04033/2020 y el proyecto I&D Interact - Investigación
Integrativa en Medio Ambiente, Agrocadenas y Tecnología (NORTE-01-0145-FEDER-
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