Tesis Funcionalizacinde Materialesy Dispositivosparael Sensado Biolgico

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FUNCIONALIZACIÓN DE MATERIALES Y DISPOSITIVOS PARA SENSADO

BIOLÓGICO
Thesis · May 2014

DOI: 10.13140/RG.2.1.4026.2003
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1 author:
E. S. Kolosovas
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
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Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Facultad de Ciencias
FUNCIONALIZACIÓN DE MATERIALES Y DISPOSITIVOS PARA
SENSADO BIOLÓGICO
Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias Aplicadas
Presenta
M.C. Eleazar Samuel Kolosovas Machuca
Asesor de Tesis
Dr. Francisco Javier González Contreras
San Luis Potosí, SLP Mayo de 2014

FUNCIONALIZACIÓN DE MATERIALES Y DISPOSITIVOS PARA
SENSADO BIOLÓGICO
Eleazar Samuel Kolosovas Machuca
Mayo de 2014
A mi esposa Alejandra, cuando era niña.
Agradecimientos
A Dios, a mi familia, a mis amigos, a mi asesor y a todos mis maestros.
Muchas gracias
Resumen
La funcionalización de un material consiste en el proceso mediante el cual se
crean los grupos funcionales necesarios para que se pueda fijar un elemento
biológico de reconocimiento a la superficie del sensor. En este trabajo de
investigación se desarrolló un protocolo de funcionalización versátil para varios
materiales, con una gran estabilidad y muy fácil de reproducir. Los principales
pasos que se siguieron en proceso de hacer funcionales estos materiales (óxido
de hafnio, óxido de aluminio y nanotubos de carbono de capa múltiple) fueron:
Oxidación para crear grupos hidroxilos sobre la superficie del material.
Silanización usando 3-APTES para modificar la superficie con moléculas de
alcoxisilano. Adhesión del enlazante, añadiendo glutaraldehído, el cual actuará
como eslabón entre el grupo amino del 3-APTES y el grupo amino de las
biomoléculas. Anclaje del elemento de reconocimiento biológico, usando
albúmina de suero bovino como elemento de reconocimiento y finalmente
inmovilización de diferentes concentraciones de anti-albúmina de suero bovino
para evaluar el potencial de los materiales en aplicaciones en el área de
biosensores. Una vez optimizado el protocolo de funcionalización de las
superficies se procedió a aplicarlo en un biosensor resistivo de nanotubos de
carbono multicapa y en un biosensor capacitivo interdigitado con un
recubrimiento de óxido de hafnio.

Índice General
Índice General ....................................................................................................... 1
Capítulo I. Introducción .......................................................................................... 7
1.1 Biosensores.................................................................................................. 8
1.1.2 Clasificación de los Biosensores .......................................................... 13
1.1.2.1 Biosensores Catalíticos ..................................................................... 13
1.1.2.2 Biosensores de Afinidad.................................................................... 13
1.1.2.3 Biosensores Capacitivos ................................................................... 14
1.1.2.4 Biosensores Resistivos ..................................................................... 15
1.2 Anticuerpos y Antígenos............................................................................. 15
1.2.1 Localización Anatómica de los Anticuerpos ......................................... 18
1.2.2 La Reacción Antígeno-Anticuerpo........................................................ 18
1.2.3 Enlaces que Participan en la Reacción Antígeno-Anticuerpo .............. 19
1.3 Inmunosensores ......................................................................................... 19
1.4 Inmovilización del Sistema de Reconocimiento Biológico Sobre las
Superficies de los Sensores ............................................................................. 20
1.4.1 Oxidación ............................................................................................. 22

1
1.4.2 Silanización .......................................................................................... 23
1.4.3 Adhesión de un Enlazante, .................................................................. 24
1.4.4 Adhesión del Elemento de Biorreconocimiento .................................... 24
1.5 Justificación del Proyecto ........................................................................... 25
1.6 Objetivos del Proyecto................................................................................ 26
Capítulo II Diseño, Fabricación y Funcionalización de Dispositivos Interdigitados
............................................................................................................................. 27
2.1 Introducción ................................................................................................ 28
2.2 Capacitores Interdigitados .......................................................................... 31
2.3 Marco teórico de la simulación ................................................................... 32
2.4 Microlitografía ............................................................................................. 33
2.5 Funcionalización de inmunosensores interdigitados .................................. 34
2.6 Material y Métodos .................................................................................... 36
2.6.1 Parámetros de Simulación. .................................................................. 36
2.6.2 Proceso de microlitografía.................................................................... 38
2.6.2.1 Diseño en AutoCAD .......................................................................... 38
2.6.2.2 Reducción de alta resolución 1:10 .................................................... 39
2.6.2.3 Limpieza del substrato ...................................................................... 40
2.6.2.4 Proceso fotolitográfico ....................................................................... 40
2
2.6.3 Características de los Capacitores Fabricados .................................... 40
2.6.3.1 Electrodo Interdigitado Al-Al2O3 (E4) ................................................. 41
2.6.4 Deposito de metal sobre substrato ....................................................... 42
2.6.5 Analizador de Impedancia Vectorial ..................................................... 44
2.6.7 Reactivos ............................................................................................. 45
2.6.8 Método de funcionalización de superficies oxidadas ........................... 46
2.7 Resultados de Simulación .......................................................................... 46
2.8 Resultados de la fabricación ...................................................................... 49
2.9 Resultados de modificación de superficies interdigitadas .......................... 53
2.10 Conclusiones ............................................................................................ 54
Capítulo III. Biosensores Basados en Nanotubos de Carbono ............................ 57
3.1 Introducción ................................................................................................ 58
3.2 Nanotubos de Carbono .............................................................................. 60
3.3 Tipos de nanotubos de carbono ................................................................. 62
3.3.1 Nanotubos de Carbono de Pared Simple ............................................. 62
3.3.2 Nanotubos de Carbono de Pared Múltiple ........................................... 63
3.4 Propiedades de los CNTs........................................................................... 65
3.5 Aplicaciones de los CNTs........................................................................... 66
3.6 Funcionalización de los CNTs .................................................................... 67

3
3.7 Aplicaciones Médicas de los CNTs ............................................................ 68
3.8 Biosensores de CNTs................................................................................. 68
3.8.1 Reactivos ............................................................................................. 70
3.8.2 Paso #1 Purificación de MWNTs......................................................... 70
3.9 Paso# 2 Oxidación de CNTs ...................................................................... 73
3.9.1 Mecánismo de reacción ....................................................................... 75
3.9.2 Caracterización con espectroscopia de infrarrojo ................................ 76
3.10 Paso# 3 Silanización de los CNTs............................................................ 80
3.10.1 Mecanismo de reacción ..................................................................... 81
3.10.2 Caracterización FT-IR ........................................................................ 81
3.11 Deposito de CNTs sobre vidrio. ................................................................ 83
3.12 Mediciones Eléctricas de Sensor.............................................................. 84
3.13 Conclusiones ............................................................................................ 84
Capítulo IV. Funcionalización de superficies de óxido de hafnio ......................... 89
4.1 Óxido de hafnio (HfO2) ............................................................................... 90
4.2 Biosensores de HfO2 .................................................................................. 92
4.3 Deposito por capas atómicas. .................................................................... 93
4.4 Material y Métodos ..................................................................................... 94
4.4.1 Crecimiento HfO2 por ALD.................................................................... 94

4
4.4.2 Funcionalización del substrato ............................................................. 94
4.4.3 Caracterización por microscopia de fuerza atómica ............................. 95
4.4.4 Caracterización UV-Vis ........................................................................ 96
4.4.5 Caracterización Raman ........................................................................ 97
4.4.6 Caracterización FT-IR .......................................................................... 97
4.5 Resultados ................................................................................................. 98
4.5.1 Rugosidad ............................................................................................ 98
4.5.2 Absorbancia ....................................................................................... 100
4.5.3 Espectroscopia Raman ...................................................................... 103
4.5.4 Caracterización FT-IR ........................................................................ 104
4.6 Conclusiones ............................................................................................ 106
Capítulo V. Conclusiones y Trabajo a Futuro .................................................... 107
5.1 Funcionalización de superficies sólidas.................................................... 108
5.2 Funcionalización de Nanotubos de Carbono. ........................................... 110
5.3 Concentraciones Óptimas de las Superficies Modificadas. ...................... 111
5.4 Publicaciones ........................................................................................... 111
5.5 Trabajo a Futuro ....................................................................................... 113
5.5.1 Análisis del Potencial de otros Tipos de Silanos Sobre los Materiales
Estudiados .................................................................................................. 113
5
5.5.2 Síntesis y Funcionalización de Nanopartículas Metálicas .................. 113
5.5.3 Aplicación de la Técnica de Espectroscopia Raman de Superficie
Amplificada.................................................................................................. 115
5.5.4 Inmunosensores para la Detección de Adiponectina ......................... 116
5.5.5 Diseño y Fabricación de Biosensores Ópticos ................................... 117
6
Capítulo I. Introducción
7
1.1 Biosensores
La necesidad de llevar a cabo determinaciones analíticas de manera rápida,
selectiva y con elevada sensibilidad ha dado lugar a la aparición y desarrollo de
biosensores. Estos dispositivos analíticos que incorporan un elemento biológico
asociado a un transductor físico-químico, presentan un enorme potencial para la
detección de numerosos analitos. Los biosensores que detectan y miden
biomoléculas clínicamente relevantes juegan un papel importante en el campo de
la ingeniería biomédica y ciencias de laboratorio médico. Un biosensor se define
como un dispositivo interfaz entre un instrumento electrónico y un sistema
biológico. El dispositivo cumple la función de detectar y medir de manera
cuantitativa una propiedad fisiológica del sistema biológico [1].
Figura 1.1. Elementos básicos de un biosensor.

8
La figura 1.1 muestra los elementos básicos de un biosensor, de arriba hacia
abajo tenemos en rojo las muestras que queremos analizar o sensar, estas
pueden ser muestras de comida, cultivos celulares, muestras de sangre o de
orina, entre otras. Más abajo, en color azul tenemos el transductor que puede ser
un arreglo de electrodos, nanopartículas o nanoalambres y como parte del
transductor, y fijado a la superficie de este, entre las muestras a analizar y el
transductor, en color verde se encuentra el elemento de reconocimiento biológico
o biorreceptor, el cual, gracias a su afinidad con las muestras a sensar las podrá
reconocer y su interacción con estas producirán cambios que podrán ser
medidos, el biorreceptor puede ser una proteína, un anticuerpo o una enzima.
Por último, en gris tenemos el sistema electrónico que permitirá amplificar las
señales obtenidas, procesarlas y desplegarlas. El receptor biológico debe estar
preparado para detectar específicamente una sustancia aprovechando la
especificidad de las interacciones biomoleculares. El transductor debe ser capaz
de interpretar la reacción de reconocimiento biológico que produce el receptor y
"traducirla" en una señal.
Los biosensores, al igual que cualquier otro tipo de instrumento, han
evolucionado a lo largo de la historia. En 1956, el llamado padre de los
biosensores Leland C. Clark Jr. inventó el electrodo de Clark, un dispositivo que
sirve para medir el oxígeno en la sangre, el agua y otros líquidos [2]. La figura 1.2
muestra el diseño original del circuito del electrodo de Clark [3]. A finales de los
años 60, Guilbault y Montalvo detallaron el primer electrodo enzimático

9
potenciométrico basado en la inmovilización de la enzima ureasa sobre un
electrodo selectivo de amonio [4].
Figura 1.2. Circuito del electrodo de Clark [3].
En 1975 se puso a la venta el primer analizador de glucosa basado en la
detección amperométrica de peróxido de hidrógeno. Este fue el primer biosensor
a la venta de los muchos que se comercializarían más adelante, tales como
pruebas de embarazo, biosensores para la determinación del virus VIH,
medidores para la coagulación de sangre, entre otros. En 1982, basándose en la
utilización de mediadores electroquímicos para favorecer la transferencia de
10
electrones desde una enzima a la superficie del electrodo se construyeron la
nueva generación de biosensores electroquímicos. Basándose en esto se
describió la implantación de un biosensor subcutáneo para la determinación de
glucosa. A partir de entonces se han desarrollado y perfeccionado diversas
técnicas en esta prometedora área cuya principal finalidad es detectar y
cuantificar parámetros biológicos o químicos. Actualmente nuevos sistemas de
biosensores están siendo desarrollados debido al avance de la biotecnología,
aplicación de nuevos materiales y procesos de fabricación. La fabricación y
aplicación de biosensores se presenta en forma natural debido a la necesidad de
contar con mecanismos de detección de un amplio rango de biomoléculas de
interés en la industria y en particular en el diagnóstico clínico, a través de la
explotación de diversos fenómenos físicos como la variación del índice de
refracción, de masa, de esfuerzo, de resistencia, entre otros. Dichos biosensores
presentan propiedades deseables tales como una alta sensibilidad, especificidad,
reproducibilidad, bajo costo y detección rápida. Los campos en los cuales la
aplicación de biosensores ha venido creciendo son muy diversos, por ejemplo, en
el control de procesos industriales, defensa, medio ambiente y robótica entre
otros. Particularmente en la medicina clínica y de investigación biológica los
biosensores se utilizan rutinariamente para medir una amplia gama de variables
fisiológicas. A menudo son llamados transductores biomédicos y son la parte
principal de muchos instrumentos de diagnóstico médico que se encuentra en los
consultorios médicos, laboratorios clínicos y hospitales. Estos sensores se
11
utilizan rutinariamente in vivo para la monitorización continua invasiva y no
invasiva de variables fisiológicas, así como in vitro para ayudar a los médicos en
varios procedimientos de diagnóstico [5].
En resumen, los biosensores representan una parte importante en los sistemas
de instrumentación biomédica ya que proporcionan la interfaz entre el
instrumento electrónico y el sistema biológico que se está midiendo. Muy a
menudo la calidad del instrumento depende de la calidad del sensor en el
extremo frontal del instrumento. Aunque el procesamiento de señal electrónica se
ha desarrollado a un alto nivel, las señales no son mejores que la calidad de los
sensores que las producen. A pesar de los muchos avances en la tecnología de
sensores biomédicos, quedan muchos problemas por solucionar. Los sensores
biomédicos seguirán siendo un área importante para la investigación y desarrollo
en ingeniería biomédica. Los biosensores continúan despertando gran interés en
la comunidad científica, lo anterior debido a los numerosos campos en los que
encuentran aplicaciones y el hecho de que el objetivo principal del desarrollo de
esta nueva tecnología consiste en la mejora de la calidad de vida. En el presente
trabajo se busca mejorar los procesos de inmovilización de las biomoléculas
sobre las superficies así como también el análisis del potencial de materiales
novedosos para la construcción de biosensores. Para lograr anterior, se variarán
parámetros en el proceso de fabricación, tales como concentraciones, tiempos,
métodos, etc. Se harán caracterizaciones entre cada paso del proceso para, en
base a los resultados, optimizar el diseño y fabricación del biosensor.

12
1.1.2 Clasificación de los Biosensores
Dependiendo de la naturaleza del material biológico, los biosensores se pueden
dividir en dos grupos, biosensores catalíticos y biosensores de afinidad.
Dependiendo de los principios básicos de sensado un biosensor se puede
clasificar en resistivo, capacitivo, inductivo y piezoeléctrico. Las características de
algunos de estos se describen brevemente a continuación:
1.1.2.1 Biosensores Catalíticos
Estos hacen uso de biocomponentes capaces de reconocer especies químicas y
su transformación en un producto a través de una reacción química.
Los receptores pueden ser enzimas, tejidos o células. Sin embargo, este tipo de
biosensores está representado principalmente por los biosensores enzimáticos,
las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos,
los biosensores enzimáticos hacen uso de enzimas específicas o sus
combinaciones. Son los biosensores mejor conocidos y los más aplicados [6].
1.1.2.2 Biosensores de Afinidad
Éstos hacen uso de las capacidades específicas de un analito para unirse a un
elemento de biorreconocimiento. Este grupo puede dividirse a su vez en
inmunosensores (que se basan en interacciones específicas entre un anticuerpo
y un antígeno), biosensores de ácido nucleico (que hacen uso de la afinidad entre
oligonucleótidos complementarios), y biosensores basados en las interacciones
entre un analito (ligando) y un receptor biológico [6]. En el presente trabajo se
13
reportan resultados obtenidos por medio de la interacción antígeno anticuerpo, es
decir inmunosensores.
1.1.2.3 Biosensores Capacitivos
En este tipo de biosensores se detectan los cambios en las propiedades
dieléctricas en la superficie de un electrodo. Se puede medir directamente
cuando el componente de interés analítico de una muestra (analito) se fija a un
elemento inmovilizado de afinidad a este. Los cambios pueden determinarse
midiendo la capacitancia o la impedancia, se pueden usar capacitores
interdigitados o métodos potenciostáticos [7]. En el presente trabajo se
diseñaron, fabricaron y funcionalizaron biosensores capacitivos interdigitados de
óxido de aluminio, níquel y óxido de hafnio. La figura 1.3 muestra a) la geometría
de un electrodo interdigitado de 12 dedos, y b) un electrodo interdigitado de 8
dedos.
Figura 1.3. a) Esquema de electrodo capacitivo interdigitado de 12 dedos. b) electrodo capacitivo

interdigitado de 8 dedos.
14
1.1.2.4 Biosensores Resistivos
En este tipo de biosensores se detectan los cambios en la resistencia del sensor.
Al igual que los sensores capacitivos, se puede medir directamente cuando un
analito se fija a un elemento inmovilizado de afinidad a este. Los cambios pueden
determinarse a partir de una curva corriente-voltaje. En el presente trabajo se
diseñaron, fabricaron y funcionalizaron biosensores resistivos de nanotubos de
carbono multicapa y se midieron los cambios en una curva corriente-voltaje
cuando se hacía interaccionar un anticuerpo con el elemento de reconocimiento
del biosensor.
1.2 Anticuerpos y Antígenos
Inmunidad significa protección frente a la enfermedad, y, más específicamente,
frente a la enfermedad infecciosa. Las células y moléculas responsables de la
inmunidad constituyen el sistema inmunitario y la respuesta global y coordinada
tras la introducción de sustancias extrañas es la respuesta inmunitaria. Los
antígenos son sustancias que inducen una respuesta inmune. La respuesta
inmune puede ser un anticuerpo, el cual es una proteína que se combina
específicamente con un antígeno. Una de las primeras demostraciones de la
inmunidad específica fue la inducción de inmunidad humoral frente a toxinas
microbianas. Ahora se sabe que los efectos protectores de la inmunidad humoral
están mediados por una familia de glucoproteínas estructuralmente relacionadas
llamadas anticuerpos [8]. La figura 1.4 muestra la disposición global simplificada
15
de la molécula de anticuerpo. La estructura consiste en tres unidades. Dos de
ellas son idénticas y están relacionadas con la unión al antígeno: los brazos Fab
(fragment antigen binding; fragmento de unión al antígeno) de la molécula.
Figura 1.4. Estructura de anticuerpo mostrada en forma de diagrama [9].
Estas unidades contienen regiones de secuencia que varían mucho de un
anticuerpo a otro y confieren en un anticuerpo dado su especificidad única de
unión. La tercera unidad, Fc (fragmento cristalizable), tiene a su cargo la unión
con las moléculas efectoras. De la figura también podemos observar que la
estructura consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H)
idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas, dispuestas para abarcar tres
unidades estructurales. Las dos unidades Fab idénticas se unen al antígeno y la
16
tercera unidad (Fc) se une a las moléculas efectoras para activar la eliminación
del antígeno [9]. Los antígenos y los anticuerpos desempeñan funciones
fundamentales en la respuesta del sistema inmunitario. Los antígenos provocan
una respuesta inmunitaria muy específica que, en la inmunidad humoral, da como
resultado la producción de anticuerpos capaces de reconocer al antígeno que les
dio origen. Por ese motivo los antígenos que causan estas respuestas se
conocen también con el nombre más descriptivo de inmunógenos [10]. Los
anticuerpos siempre inician sus efectos biológicos al unirse a antígenos. La unión
del anticuerpo al antígeno, aunque no es totalmente covalente, sí es específica
para un antígeno frente a otro y a menudo es muy fuerte. Todos los anticuerpos
tienen una estructura básica común, formada por dos cadenas ligeras idénticas y
dos cadenas pesadas idénticas. Cada cadena consta de múltiples dominios
plegados de forma independiente, con unos 110 aminoácidos y que contienen
enlaces disulfuro intracatenarios. Los anticuerpos son también una herramienta
de gran valor en el laboratorio. Se utilizan para detectar y cuantificar sustancias
que se encuentran en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras
por medio de la técnica de Radioinmunoensayo (abreviado RIA del inglés
Radioimmunoassay) y también se utilizan en la técnica de ELISA (acrónimo
del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, „Ensayo por Inmunoabsorción
Ligado a Enzimas‟) para cuantificar antígenos en solución. En la
inmunoprecipitación y el Western blotting se usan para la purificación y análisis
estructural de antígenos proteicos.
17
1.2.1 Localización Anatómica de los Anticuerpos
Aunque los anticuerpos se aislaron inicialmente a partir de la porción líquida de la
sangre, se pueden encontrar en diferentes localizaciones anatómicas:
o Los anticuerpos están presentes dentro de los compartimientos unidos a la
membrana citoplásmica (retículo endoplásmico y complejo de Golgi) y
sobre la superficie de los linfocitos B, que son las únicas células capaces
de sintetizar anticuerpos.
o Los anticuerpos están presentes en el plasma (porción líquida) de la
sangre, y en menor proporción, en el líquido intersticial de los tejidos
donde se acumulan los anticuerpos secretados por las células B.
o Los anticuerpos están unidos a la superficie de determinadas células
inmunitarias efectoras, como los fagocitos mononucleares, células
citocidas naturales, que no sintetizan anticuerpos, pero poseen receptores
específicos para unirlos.
o Los anticuerpos están presentes en los fluidos secretados como el moco y
la leche, en los cuales se transportan específicamente ciertos tipos de
anticuerpos [8].
1.2.2 La Reacción Antígeno-Anticuerpo
Una de las propiedades más características de los anticuerpos, es su capacidad
de reaccionar específicamente con los antígenos inductores de su producción
(antígenos homólogos). La reacción antígeno-anticuerpo ocurre en dos etapas.
18
En la primera sucede la interacción físico-química entre las moléculas del
antígeno y el anticuerpo, y en la segunda esta interacción se hace manifiesta por
la formación de un precipitado, cuando el antígeno es soluble, o de un
“aglutinado”, cuando el antígeno es particulado [11].
1.2.3 Enlaces que Participan en la Reacción Antígeno-Anticuerpo
La interacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es un fenómeno que depende de la
complementariedad química de los reactantes. Ésta, depende a su vez de la
conformación de las moléculas y de la carga de sus elementos constituyentes.
Cuando tal interacción ha ocurrido, se producen los complejos antígeno-
anticuerpo, donde los reactantes se mantienen unidos a través de enlaces
electrostáticos y, en algunos casos, a través de enlaces covalentes reversibles.
La energía de unión en los enlaces electrostáticos es baja, del orden de 4 a 12
kcal/mol, mientras que la energía contenida en los enlaces covalentes es más
alta y va de las 32 a las 100 kcal/mol [11]. Dentro de los enlaces electrostáticos
contamos con los enlaces iónicos o salinos, los enlaces por puente de hidrogeno,
las interacciones hidrofóbicas, las interacciones entre dipolos y las fuerzas de
Van der Waals.
1.3 Inmunosensores
Los biosensores de afinidad hacen uso de interacciones específicas entre un
anticuerpo y un antígeno o un hapteno. La afinidad de los antígenos a los
anticuerpos es muy fuerte, pero son estrictamente no covalentes. Un

19
Inmunosensor es un aparato de estado sólido capaz de detectar la unión
antígeno-anticuerpo, sobre la base de cambios en la masa, cambios en las
propiedades ópticas o cambios electroquímicos. Se puede emplear en el análisis
químico, del medio ambiente o análisis de alimentos [12]. Un inmunosensor es un
tipo de biosensor en el cual el componente biológico es un inmunorreactivo.
Cuando el analito es una molécula pequeña, se requiere realizar un proceso
adicional para lograr la reacción inmune con una molécula similar llamada
hapteno. Generalmente el elemento objetivo es el antígeno (el analito o el
hapteno) y el anticuerpo se adhiere al receptor, aunque en algunos casos se
obtiene una mejor respuesta cuando el analito, o una forma modificada de él, se
adhieren al receptor. En el presente trabajo se diseñaron, elaboraron y
caracterizaron inmunosensores resistivos de nanotubos de carbono,
inmunosensores capacitivos con estructura interdigitada y se hicieron pruebas
sobre superficies de óxido de hafnio. En los siguientes capítulos se explicará a
detalle cada uno de los inmunosensores antes mencionados así como los
resultados obtenidos.
1.4 Inmovilización del Sistema de Reconocimiento
Biológico Sobre las Superficies de los Sensores
Antes de caracterizar la interacción antígeno-anticuerpo en un inmunosensor, un
paso fundamental es la modificación de la superficie con el fin de crear enlaces
que permitan fijar las biomoléculas en las superficies del sensor. El buen
20
funcionamiento de un biosensor depende en gran medida, de la inmovilización
del sistema de reconocimiento biológico sobre el transductor. Los métodos de
inmovilización comprenden métodos físicos, fundamentalmente por adsorción o
por atrapamiento, y métodos químicos, ya sea mediante unión covalente o por
entrecruzamiento. Dentro de cada uno de estos métodos existen numerosas
variantes y además, también es posible utilizar combinaciones de diferentes
métodos de inmovilización. Existen varios métodos para la inmovilización de
proteínas tales como los anticuerpos sobre soportes sólidos. Uno de esos
métodos consiste en la creación de un enlace covalente entre el soporte y la
proteína. La superficie del soporte se hace reactiva con grupos tales como
aminos (-COOH) y carboxilos (-NH2) o, con menor frecuencia, con los grupos
yodoacetamida, grupos isotiocianato, o con ácido bórico. Estos se pueden hacer
reaccionar con grupos aminos, grupos tiol, grupos carboxilos, o grupos sacáridos
de anticuerpos para formar enlaces químicos covalentes [6].
En el presente trabajo se aplicó un método conocido como captura biológica o
inmovilización por bioafinidad del receptor biológico el cual consiste en la
inmovilización del receptor biológico a la superficie como consecuencia de una
interacción de reconocimiento específico entre dicho receptor biológico y una
agente de captura tal como ocurre en la reacción Ag-Ac. Previo a esto, se deben
crear grupos funcionales que permitan crear enlaces covalentes con los cuales se
pueda fijar el elemento de reconocimiento a la superficie del biosensor. Las
superficies de cristal y de óxido de metal son a menudo funcionalizadas utilizando

21
reactivos silil (aminopropiltrimetoxisilano es un ejemplo típico). En este proyecto
se usó 3-aminopropiltrimetoxisilano (3-APTES) en el proceso de funcionalización
de superficies de óxido de hafnio, óxido de aluminio, níquel y nanotubos de
carbono multicapa. Los principales pasos a seguir, antes de la inmovilización del
anticuerpo sobre el biosensor fueron los siguientes:
1.4.1 Oxidación
El objetivo de esta etapa de la funcionalización es la creación de grupos
hidroxilos reactivos sobre la superficie los cuales son necesarios para la unión de
moléculas de silanos. Para lo anterior se Usó una mezcla de ácido sulfúrico
(H2SO4) y peróxido de hidrogeno (H2O2) 3:1, conocida como solución piraña, la
cual además añadir grupos hidroxilos (-OH) también elimina la contaminación de
origen orgánico. La estructura química de la solución piraña se muestra en la
figura 1.5.
Figura 1.5. Estructura química de solución piraña.
22
También se hicieron pruebas oxidando con un sistema UV/ozono y para el caso
específico de los nanotubos de carbono multicapa se usó un tratamiento con una
mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico (HNO3/H2SO4).
1.4.2 Silanización
Existen diversos tipos de silanos, en el presente trabajo se usaron trialcoxisilanos
en los cuales el silicio está unido a tres grupos alcoxi (-OR), los cuales suelen ser
bien un grupo metoxi (-OCH3) ó un grupo etoxi (-OCH2CH3). En esta tesis se usó
específicamente el 3-aminopropiltrimetoxisilano (3-APTES) para modificar las
superficies de interés con moléculas de alcoxisilano, en el 3-APTES, el grupo
funcional que se encuentra al final de la cadena (grupo terminal) es un grupo
amino (-NH2). La estructura química del 3-APTES se muestra en la figura 1.6.
Figura 1.6. Estructura química de 3-aminopropiltrimetoxisilano.
23
1.4.3 Adhesión de un Enlazante,
El 3-APTES presenta la desventaja de requerir la adición de una especie
activadora como el glutaraldehído (GA) para unir la molécula de interés a la
superficie silanizada, por lo tanto, para la inmovilización de la biomoléculas a
través de sus grupos amino es necesaria la utilización de GA, el cual actuará
biomoléculas. La estructura química del GA se observa en la figura 1.7.
Figura 1.7. Estructura química de glutaraldehido.
1.4.4 Adhesión del Elemento de Biorreconocimiento
El último paso en la fabricación del biosensor es la adhesión del elemento de
biorreconocimiento, se usó la albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas en
inglés Bovine Serum Albumin) y en algunos casos albúmina de suero humano
(HSA por sus siglas en inglés Human Serum Albumin). Las caracterizaciones
hechas con el FT-IR muestran la presencia de los grupos funcionales entre cada
paso de la modificación de la superficie de los biosensores.

24
1.5 Justificación del Proyecto
Actualmente existe gran interés en el desarrollo de investigaciones que
involucren la interacción multidisciplinaria entre la biología, la medicina, la
ingeniería y la física, en este contexto, la investigación en el área de los
biosensores ha venido creciendo. PCR (Polymerase Chain Reaction, por sus
siglas en inglés) y ELISA son las pruebas de diagnóstico con mayor sensibilidad y
especificidad para enfermedades infecciosas. Sin embargo estos métodos son
muy lentos y costosos [13]. Una alternativa es utilizar dispositivos electrónicos.
En relación a esto, los biosensores son dispositivos de análisis utilizados para
convertir una respuesta biológica o química en una señal eléctrica. Un biosensor
es portátil, relativamente barato y muy fácil de usar, por lo que es un sistema de
detección ideal para puntos de atención y aplicaciones de campo [14]. Un tipo
específico de biosensores es el inmunosensor, los inmunosensores actuales son
una combinación inteligente de instrumentación sofisticada y avanzadas
estrategias bioquímicas que han permitido suplementar y en algunos casos
reemplazar los métodos convencionales de análisis instrumental [15]. En este
proyecto, se propone el modelado, diseño y construcción de biosensores
eléctricos capacitivos que permitan aprovechar el potencial de las estructuras
interdigitadas. Se estudiará también el potencial de dieléctricos alternativos en
biosensores, tales como el óxido de hafnio y se aprovecharán las diversas
propiedades de los nanotubos de carbono para la fabricación de sensores
resistivos.
25
1.6 Objetivos del Proyecto.
Los objetivos específicos de este proyecto son tres, el primero es diseñar y
fabricar circuitos interdigitados para luego funcionalizar las superficies de estos
dispositivos. El segundo objetivo es desarrollar un protocolo que permita
funcionalizar superficies de óxido de hafnio para evaluar el potencial de este
material para su uso en el área de los biosensores y el tercer objetivos es fabricar
un biosensor de nanotubos de carbono multicapa los cuales se presentan como
una opción con ventajas en algunos aspectos, ya en comparación con los
biosensores que usan nanotubos monocapa como transductor, los nanotubos de
capa múltiple son más baratos y menos tóxicos por lo que representan una
alternativa deseable.
26
Capítulo II Diseño,
Fabricación y
Funcionalización de
Dispositivos Interdigitados
27
2.1 Introducción
Actualmente, la simulación es una parte importante en el desarrollo de proyectos
relacionados con ciencias e ingeniería, La simulación previa puede ayudar a
reducir el tiempo total de desarrollo de un producto y su coste total además de
que brinda información sobre su comportamiento eléctrico, todo antes de su
fabricación. El desarrollo de la metodología de elementos finitos como una
herramienta de análisis fue esencialmente iniciado con el advenimiento de las
computadoras electrónicas digitales. En la solución numérica de un problema
continuo es básicamente necesario establecer y resolver un sistema de
ecuaciones algebraicas. Usando el método de elementos finitos en una
computadora digital, es posible establecer y resolver las ecuaciones que
gobiernan sistemas complejos de una manera muy efectiva. Los programas de
análisis por elementos finitos (AEF), permiten obtener soluciones aproximadas de
problemas que sean susceptibles de ser representados por un sistema de
ecuaciones diferenciales. La técnica de AEF consiste en dividir la geometría en la
que se quiere resolver una ecuación diferencial de un campo escalar o vectorial
en un dominio, en pequeños elementos, teniendo en cuenta unas ecuaciones de
campo en cada elemento, los elementos del entorno de vecindad y las fuentes
generadoras de campo en cada elemento. Habitualmente, esta técnica es muy
utilizada en el ámbito de la ingeniería debido a que muchos problemas físicos de
interés se formulan mediante la resolución de una ecuación diferencial en
derivadas parciales, a partir de cuya solución es posible modelar dicho problema

28
(transmisión del calor, electromagnetismo, cálculo de estructuras, etc.). Esta
técnica se encuentra automatizada en las herramientas software comercial,
llamadas herramientas de análisis por elementos finitos para problemas físicos
tanto de propósito general, como aplicadas a problemas físicos particulares. El
paquete COMSOL Multiphysics®, antes conocido como FEMLAB, usa AEF para
modelar, analizar y simular sistemas que se basen en la física, el paquete permite
trabajar con situaciones y diseños teóricos. El propósito de la simulación
mediante el paquete COMSOL Multiphysics® en nuestro trabajo es el de variar
los parámetros propios de un capacitor con la finalidad de optimizar la geometría
de un biosensor basado en electrodos interdigitados, cuyo potencial como
inmunosensor será evaluado. Los resultados obtenidos en ésta etapa serán de
mucha importancia ya que nos permitirán elegir correctamente los parámetros
óptimos del dispositivo antes de su diseño y construcción.
Por otro lado, el uso de microsensores fiables y de alto rendimiento es cada vez
más importante en el campo de la medicina para la vigilancia de la salud del
paciente. Dispositivos de silicio piezoresistivos se introdujeron por primera vez en
la década de 1960 para controlar las variaciones relacionadas con la presión [16].
El efecto piezoresistivo describe el cambio en la resistividad eléctrica de un
semiconductor cuando se aplica tensión mecánica. Estos dispositivos, desde
entonces se han investigado y utilizado con catéteres o como unidades
implantables para supervisar las variaciones de presión arterial [17,18]. Tales
dispositivos están ya presentes en el mercado [19,20]. Sin embargo, estos

29
dispositivos presentan algunas desventajas tales como lo es la alta sensibilidad a
la temperatura, la cual debe ser compensada con un alto consumo de energía si
lo comparamos con los dispositivos capacitivos. Estos inconvenientes de los
dispositivos piezoresistivos han acelerado la investigación de otras opciones de
dispositivos. En la década de 1980 se inició la investigación sobre sensores
capacitivos [21]. El enfoque capacitivo está basado en el principio del capacitor
de placas paralelas. En este tipo de estructuras, las cuales consisten en dos
superficies conductoras separadas por un material no conductor, o dieléctrico, la
capacitancia está dada por:
A
C = εr ε0 (2.1)
d
Donde εr es la permitividad relativa, ε0 la permitividad en el vacío, A es el área de
las placas y d la distancia entre estas. Aunque la forma de la ecuación puede
cambiar dependiendo del tipo de circuito, en un sensor capacitivo los principales
parámetros que dictaminan el valor final son la constante dieléctrica y la
geometría del sistema. Los sensores capacitivos han sido usados exitosamente
para el monitoreo de la presión intraocular [22], monitoreo de presión intracraneal
[23], así como para la evaluación clínica de la toma de ajuste de la prótesis [24] y
la distribución de la presión en las articulaciones artificiales [25]. Además de
medir presión, el cual es el campo en donde mayormente se han empleado los
sensores capacitivos, también se han usado en otros campos de la medicina
tales como acelerómetros que registran los movimientos tanto de personas

30
sanas, como en rehabilitación [26-28]. Los capacitores interdigitados son una
geometría interesante dada su fácil reproducibilidad, así como el gran
aprovechamiento de su área sensante. En este capítulo se mostrarán los
primeros dispositivos fabricados en el proyecto, a partir de los resultados
obtenidos en la simulación, se explicaran los pasos que se siguieron para su
fabricación (Diseño en COMSOL, modelado, diseño en Autocad escala 10x,
reducción de alta resolución 1:10, microlitografía y Evaporación) así como su
caracterización. Se discutirá el potencial de éstos dispositivos como biosensores.
2.2 Capacitores Interdigitados
Los capacitores interdigitados consisten en colocar sobre un substrato dos
electrodos en forma de peine desfasados uno del otro. Este arreglo posee una
capacitancia intrínseca que se puede calcular de manera analítica. Cuando se
vierte sobre los electrodos una sustancia, la capacitancia del dispositivo cambia
dependiendo de la permitividad dieléctrica de la sustancia [29, 30]. Entre ambos
electrodos se aplica una diferencia de potencial que genera el campo eléctrico no
uniforme que depende de la geometría de los electrodos y de las propiedades del
material. La capacitancia del sistema dependerá principalmente de su geometría
y de la permitividad relativa del dieléctrico. En la figura 2.1 se observa el dibujo de
un capacitor interdigitado con sus respectivos parámetros [29]. Donde G es el
espacio entre electrodos, W el ancho de electrodos, L la longitud de electrodo, λ=
2(W+G), N el número de dedos y ΔV el potencial. Las estructuras interdigitadas
31
presentan algunas ventajas tales como facilidad de mediciones eléctricas,
repetibilidad en el proceso de fabricación del dispositivo usando el proceso
estándar de microfabricación y el incremento en el área efectiva de detección.
Figura 2.1 Parámetros de un capacitor interdigitado.
2.3 Marco teórico de la simulación
La energía necesaria para cargar un condensador debe ser igual a la del campo
electrostático, que es:
Q2
𝑊𝑒 = (2.2)
2C
32
W e se obtiene en el modo de aplicación electrostática; el software calcula la
energía integrando a través del dominio:
𝑊𝑒 = 𝛺 𝐃. 𝐄 dΩ (2.3)
Donde D es el desplazamiento eléctrico y E es el campo eléctrico. La
capacitancia, C, está relacionada con la carga en las dos placas conductoras, Q,
y la diferencia de voltaje a través de esas placas, ΔV, por:
Q
C= (2.4)
ΔV
Por lo tanto:
Q2 C 2 ΔV 2 2W e
C= = →C= (2.5)
2W e 2W e Δr 2
2.4 Microlitografía
La microlitografía es un proceso de fabricación para la producción de alta
precisión de patrones de dos dimensiones sobre un material fotosensible [33].
Los patrones son réplicas de un patrón maestro. El progreso de la microlitografía
se puede medir por las cada vez más pequeñas imágenes que se pueden
imprimir. La habilidad para crear estructuras en la microescala es de crucial
importancia, no sólo en los chips para análisis biomolecular sino en general para
33
el avance de las micro y nanotecnologías y para el avance del estudio de las
nanociencias. Algunos de los aspectos que se deben considerar al realizar un
proceso litográfico son la resolución, la fiabilidad, velocidad y precisión.
2.5 Funcionalización de inmunosensores interdigitados
El recubrimiento de sustratos con el fin de modificar sus propiedades para una
determinada aplicación es un fenómeno conocido desde hace mucho tiempo. El
enlace de moléculas a una superficie que tiene como resultado una reducción o
pérdida de la movilidad de estas la llamaremos inmovilización. Una etapa clave
en la construcción de un biosensor es precisamente la inmovilización del receptor
biológico sobre una superficie sólida. Específicamente en un inmunosensor se
usa el método de inmovilización por bioafinidad del receptor biológico en el cual
se realiza la inmovilización previa del agente de captura mediante inmovilización
física o covalente a la superficie. El enlace entre el agente de captura y el
receptor biológico posee una elevada fuerza de unión, siendo un enlace muy
estable. Presenta las mayores ventajas en cuanto a la especificidad de la fijación,
la reproducibilidad y uniformidad de la orientación de las biomóleculas sobre el
soporte y la integridad estructural de aquellas. Además se consigue una elevada
densidad de receptores biológicos sobre la superficie [31]. En el presente trabajo,
la inmovilización del receptor biológico se hizo creando enlaces covalentes,
basándose en una reacción entre grupos reactivos de la biomolécula a
inmovilizar (no importantes para la actividad biológica) y grupos reactivos de la
34
superficie sólida, es decir, la inmovilización mediante enlace covalente requiere la
presencia de grupos funcionales adecuados, tanto en el soporte como en la
biomolécula [31,32]. Para la inmovilización covalente del receptor biológico a la
superficie se utiliza la química de los silanos. Un silano muy utilizado en la
funcionalización de superficies es el 3-aminopropiltrietoxilsilano (3-APTES). Dicho
silano presenta grupos amino terminales los cuales permiten la inmovilización de
biomoléculas. En el presente trabajo se usó 3-APTES en el proceso de
funcionalización de superficies interdigitadas de alumina (Al-Al2O3). Un esquema
del proceso de funcionalización se muestra en la figura 2.2.
Figura 2.2. Esquema del proceso de funcionalización de superficies interdigitadas.
35
En el esquema podemos observar los principales pasos en este proceso, el
primero consiste en la oxidación, mediante la cual se crean los grupos hidroxilo
en la superficie del material, después de esto, dicha superficie era silanizada
usando 3-APTES para modificar la superficie con moléculas de alcoxisilano.
Luego se añade el glutaraldehído, el cual actuará como eslabón entre el grupo
amino del 3-APTES y el grupo amino de las biomoléculas, luego se añaden las
biomolécuas usando albúmina de suero bovino como elemento de
reconocimiento, por último se inmoviliazaron diferentes concentraciones de anti-
albúmina de suero bovino (Anti-BSA).
2.6 Material y Métodos
2.6.1 Parámetros de Simulación.
Usando el paquete de simulación COMSOL Multiphysics®, se hizo el modelado
en 3D de 10 capacitores interdigitados, variando parámetros tales como la
frecuencia, así como G, W, L y N. El voltaje de entrada fue de 50 mV para todas
las simulaciones. Uno de los electrodos estaba cargado mientras el otro estaba
aterrizado. Se hizo el barrido en frecuencia, cambiando el valor de la constante
dieléctrica. Al finalizar la simulación se calculaba la capacitancia y la energía
necesaria para cargar el capacitor. En la figura 2.3 se observa la distribución de
potencial eléctrico de un capacitor interdigitado de 12 dedos. La figura 2.4
muestra la distribución de líneas de campo eléctrico de un capacitor interdigitado
de 19 dedos.
36
Figura 2.3 Distribución de potencial eléctrico de un capacitor interdigitado de 12 dedos.
Figura 2.4. Distribución de líneas de campo eléctrico de un capacitor interdigitado de 19 dedos.
37
Los resultados obtenidos se usaron para modelar la capacitancia vs la frecuencia
para distintos N. En el análisis se utilizó la opción de refinado de la malla antes
de resolver el sistema, lo anterior para obtener un resultado más preciso. Todas
las simulaciones se hicieron usando el modulo de MEMS-Electrostática. El
análisis de posprocesado para obtener capacitancia y energía se obtuvo por
medio de los comandos: C11_emes e intWe11_emes respectivamente.
2.6.2 Proceso de microlitografía
Los pasos que se siguieron en este trabajo para llevar a cabo el proceso de
microlitografía son los siguientes:
2.6.2.1 Diseño en AutoCAD
Se realizó el dibujo con una escala de 10x, esto mediante el programa
AUTOCAD, al diseño original se le agregaron contactos, uno para cada peine,
esto con la finalidad de usarlos para soldar, por ejemplo el diseño final para los
capacitores 1,2 y 3 se muestran en la figura 2.5 a), b) y c) respectivamente.
Figura 2.5. Diseño final para capacitores 1,2 y 3.
38
2.6.2.2 Reducción de alta resolución 1:10
A los dibujos impresos se les tomó fotografías y luego se les hizo una reducción
de alto contraste al 10%, obteniéndose negativos y positivos del diseño original a
escala los cuales se muestran en la figura 2.6. Estas imágenes fueron tomadas
con el microscopio óptico de parte de los negativos los cuales se revisaron
minuciosamente, no encontrándose discontinuidades o ruido considerable. La
figura 2.7 muestra los negativos que serán usados en el proceso de fotolitografía
para fabricar los primeros dispositivos de níquel sobre silicio.
Figura 2.6. Negativos de capacitores 1,2 y 3.
Figura 2.7. Negativos de circuitos interdigitados.
39
2.6.2.3 Limpieza del substrato
Se sumergió la oblea de silicio (100) en acetona durante dos minutos, luego en
etanol otros dos minutos y por último se limpio con abundante agua desionizada.
Para secar el substrato, se calentó en el horno a 100°C durante 2 minutos.
2.6.2.4 Proceso fotolitográfico
Después de colocar el substrato de silicio sobre el spiner, se colocó la resina
usando una gotera y se activó el spiner a 6000 rpm durante 60 segundos. Se
colocó el silicio en el horno durante 15 minutos a 95°C y luego se dejo enfriar
durante 5 minutos. Usando el negativo de los trazados, se expuso a la luz UV
durante 45 segundos, se limpió nuevamente con agua desionizada y se revisó
cuidadosamente en el microscopio óptico, por último se secó el substrato en el
horno durante 5 minutos.
2.6.3 Características de los Capacitores Fabricados
Se fabricaron los 3 tipos de capacitores interdigitados con las características
geométricas descritas en la tabla 2.1.
Capacitor 1 Capacitor 2 Capacitor 3

N 32 40 50
W 100 µm 100 µm 100 µm
G 100 µm 75 µm 50 µm
L 8 mm 8 mm 8 mm
α 400 µm 350 µm 300 µm
k 25 25 25
Tabla 2.1. Parámetros simulados para cada uno de los capacitores.
40
En resumen, a partir de los resultados obtenidos en COMSOL, se hicieron dibujos
de estas geometrías usando el programa AUTOCAD (Para obtener líneas más
finas) se imprimieron y se les tomaron negativos a los cuales se les realizó una
reducción de alto contraste, todo como parte del proceso de fotolitografía, el
resultado final sirvió como trazado, el cual sería dibujado sobre la oblea de silicio
para entonces depositarles níquel sobre silicio usando un evaporador por haz de
electrones. Por último y con la finalidad de aumentar la capacitancia de los
dispositivos, se les depositó una capa de óxido de hafnio de aproximadamente 60
nm usando el método de deposición por capas atómicas, mejor conocido como
ALD. El esquema de fabricación de los dispositivos de muestra en la figura 2.8.
Figura 2.8. Esquema de fabricación de dispositivos interdigitados.
2.6.3.1 Electrodo Interdigitado Al-Al2O3 (E4)
Además de los tres capacitores que fabricamos, obtuvimos un cuarto capacitor
por medio de una colaboración. Sus características son las siguientes:
o 50 dedos
o Ancho de dedos 2 µm
o Espacio entre dedos 2 µm
o Longitud de dedos 200 µm
41
Sobre silicio oxidado fueron depositados 750 nm de aluminio y después una
segunda capa de 100 nm de óxido de aluminio (figura 2.9). La figura 2.10
muestra una imagen tomada con el microscopio óptico de parte del electrodo de
Al-Al2O3.
Figura 2.9. Sección transversal de electrodo 4 de AL-Al2O3
Figura 2.10. Imagen tomada con microscopio óptico de electrodo 4 de AL-Al2O3
2.6.4 Deposito de metal sobre substrato
Se depositó níquel sobre el trazado usando la técnica de la evaporación por
cañón de electrones. La muestra se sitúa en la cámara de depósito, después de
42
hacer vacío, el metal a depositar se calienta a altas temperaturas mediante el haz
de electrones. Este proceso causa la evaporación del metal y su depósito sobre
la muestra. Al sacar la muestra, ésta se limpió con acetona para revelar el
trazado interdigitado final que se estaba buscando. Las figuras 2.11 y 2.12
muestran el resultado final obtenido al depositar níquel sobre un substrato de
silicio.
Figura 2.11. Oblea de silicio con C1, C2 y C3.
Figura 2.12. Acercamiento C2.
43
2.6.5 Analizador de Impedancia Vectorial
Las curvas de impedancia vs. frecuencia fueron hechas con el analizador de
impedancia vectorial (VIA) el cual puede medir en un rango de frecuencias de
4MHz a 1GHz. El instrumento aplica una señal sinusoidal a determinada
frecuencia y determina la impedancia a esa frecuencia. Al realizar el
procedimiento en un determinado rango de frecuencias se obtiene la impedancia
del circuito en el rango de frecuencias de interés. La figura 2.13 (a) muestra el
aparato con el que se tomaron dichas mediciones, la figura 2.13 (b) muestra la
manera como se realizaban las mediciones de los circuitos interdigitados usando
dos finos alambres de cobre.
Figura 2.13. (a)VIA Echo (b) Alambres de cobre usados en la medición.

44
2.6.7 Reactivos
Los siguientes reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich: glutaraldehído (GA)
(50%), 3-APTES, buffer fosfato salino (PBS por sus siglas en inglés phosphate
buffered saline) con pH = 7.4, 0.01 M, acetona, 2-propanol, etanol y albúmina de
suero bovino (BSA por sus siglas en inglés bovine serum albumin) y anti-
albúmina de suero bovino (anti-BSA). La superficie del substrato de alumina (Al-
Al2O3) se modificó, primero mediante oxidación seguido del método de
silanización con 3-APTES para la generación de superficies con grupos amino-
terminales. Las muestras se limpiaron con acetona, 2-propanol y agua
desionizada seguido por inmersión en una solución Piraña (3:1 de ácido sulfúrico
al peróxido de hidrógeno) durante 1 hora. Las muestras se sumergieron entonces
en una solución etanólica de 3-APTES recién preparada (6%, v/v) durante 2
horas a temperatura ambiente, seguido de inmersión en etanol durante 1 minuto,
se secaron con una corriente de N2, después de eso, las muestras se
sumergieron en una solución de PBS y GA (1.25 %, v/v) durante 1 h, y después
se limpiaron con solución buffer de PBS. A continuación, las muestras se
sumergieron en una solución de PBS y albúmina de suero bovino (50% v/v)
durante 1 h. Las técnicas de espectrometría Raman, microscopía electrónica de
barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) se utilizaron para
caracterizar las muestras.
45
2.6.8 Método de funcionalización de superficies oxidadas
o Limpieza con agua desionizada, acetona, 2-propanol y agua
desionizada en ese orden.
o Sumergir en una solución de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno
con concentración 3:1 por 1 hora a temperatura ambiente.
o Enjuagar con etanol.
o Secar con nitrógeno en atmosfera inerte.
o Sumergir en solución de 3-APTES en etanol 6% v/v por 2 horas.
o Enjuagar con etanol y secar con nitrógeno en atmósfera inerte.
o Adición del enlazante.
o Sumergir en solución de glutaraldehido en PBS (1.25% v/v) 1 hora y
enjuagar con PBS.
2.7 Resultados de Simulación
Los valores obtenidos para la capacitancia en función de la frecuencia para
capacitores interdigitados de 12 a 22 dedos se muestran en la figura 2.14. En
cuanto a la distribución de potencial eléctrico, este era simétrico tanto para N
pares como para N impares, sólo cambiaba el eje de referencia, como se observa
en las figuras 2.15 y 2.16. La tabla 2.2 muestra los valores de capacitancia y
energía obtenidos para los tres electrodos simulados. La figura 2.17 muestra un
modelado de la impedancia vs la frecuencia de los tres electrodos simulados en
46
COMSOL. El modelado se hizo por medio de el programa MATLAB, a partir de la
ecuación 2.5 con R=0 y usando los valores de capacitancia obtenidos en la
simulación (tabla 2.2).
Figura 2.14. Capacitancia vs frecuencia para capacitores interdigitados de 12 a 22 dedos.
47
Figura 2.15. Distribución de potencial eléctrico de un capacitor interdigitado con N par
Figura 2.16. Distribución de potencial eléctrico de un capacitor interdigitado con N impar.
Electrodo 1 Electrodo 2 Electrodo 3

Capacitancia obtenida 50.48 pF 75.94 pF 96.44 pF
Energía obtenida 6.31x10 J 8.98x10-14J
-14
1.20x10-13J
Tabla 2.2 Valores de capacitancia y energía para los tres electrodos simulados.
48
1
𝑍= 𝑅2 + ( )2 (2.5)
2πfC
Figura 2.17. Modelado de Impedancia vs frecuencia de electrodos simulados.
2.8 Resultados de la fabricación
Los circuitos fabricados por medio del proceso de microlitografía fueron
caracterizados eléctricamente usando el analizador de impedancia vectorial.
Algunos circuitos fueron recubiertos con una capa de óxido de hafnio por medio
de la técnica de deposición de capas atómicas (ALD) con la finalidad de
aumentar su constante dieléctrica (≈25). Este valor de constante dieléctrica fue el
que se usó en la simulación y el modelado. La figura 2.18 muestra la curva
experimental y la curva teórica para el capacitor 3. La figura 2.19 muestra un
49
acercamiento en el rango de frecuencias de 0 a 12 MHz de la curva de
impedancia vs frecuencia de los tres capacitores de níquel sobre silicio, Debido a
su geometría, el capacitor 1 tiene mayor impedancia que el 2 y que el 3
respectivamente. Las figuras 2.20, 2.21 y 2.22 muestran la impedancia vs
frecuencia de los capacitores 1,2 y 3 con y sin la capa de óxido de hafnio, la cual,
dada su constante dieléctrica más alta que la del silicio, aumenta la capacitancia
y por ende disminuye la impedancia del circuito.
Figura 2.18. Curva modelada y curva experimental de Impedancia vs frecuencia para electrodo 3.
50
Figura 2.19. Curva de impedancia vs frecuencia de los tres electrodos de níquel sobre silicio.
Figura 2.20. Impedancia vs frecuencia de capacitor 1.
51
Figura 2.21. Impedancia vs frecuencia de electrodo 2.
Figura 2.22. Impedancia vs frecuencia de electrodo 3.
52
2.9 Resultados de modificación de superficies
interdigitadas
La figura 2.23 muestra una imagen SEM de la superficie de del dispositivo de
Al2O3, (a) antes y (b) después del proceso de funcionalización, aquí podemos ver
un cambio claro en la superficie debido a la capa de proteínas depositadas sobre
la superficie. La figura 2.24 (a) muestra la morfología de la superficie de una
película de Al2O3 en 3D, que representa una estructura uniforme de la superficie
de la película. La figura 2.24 (b) muestra la superficie después de ser modificada.
Lo mismo se observa en las figuras 2.25 (a) y 2.25 (b) pero en dos dimensiones.
El aumento de rugosidad fue 11,63% para la superficie de Al 2O3.
Figura 2.23. Imagen SEM de la superficie de Al2O3 a) antes y b) después de la modificación.
53
Figura 2.24. (a) Morfología de la superficie de una película de Al 2O3 en 3D (b) misma superficie
después de ser modificada.
Figura 2.25. (a) Morfología de la superficie de una película de Al2O3 en 2D (b) misma superficie
después de ser modificada.
2.10 Conclusiones
La capacitancia y la energía de un electrodo interdigitado varían linealmente con
el número de dedos. A mayor frecuencia disminuye el valor de la constante
dieléctrica y por ende la capacitancia. Es recomendable usar valores de L≥20W.
54
Las variaciones en el grosor del dieléctrico no afectan significativamente el valor
de la capacitancia. El número de dedos puede ser par o impar sin afectar la
distribución del potencial eléctrico en el dispositivo. El uso de una película
delgada de un dieléctrico (entre 50nm y 100 nm) con una constante k mayor a la
del silicio proporciona un mejor acoplamiento para el campo eléctrico sobre la
superficie sensante. En las gráficas resultantes del modelado se observa que en
el rango de frecuencias de 0 a 10 MHz es posible observar la caída de
impedancia respecto a la frecuencia, esta información será útil al momento de
caracterizar pues permitirá hacer el barrido sólo en el rango de interés. El objetivo
principal de la simulación el cual era la optimización de las dimensiones de los
electrodos se cumplió satisfactoriamente. Con respecto a la fabricación de
circuitos interdigitados, se lograron fabricar estructuras interesantes, fáciles de
reproducir y de bajo costo, que podrían usarse como sensores capacitivos. Con
respecto a la modificación de la superficie de Al2O3 y con base en las imágenes
tomadas con microscopio electrónico de barrido, es claro que la superficie ha sido
modificada, también las imágenes de AFM muestran el aumento de rugosidad
cuando la superficie ha sido modificada. Esto muestra que las superficies de
Al2O3 fueron funcionalizadas con 3-APTES y que a las a las proteínas que se les
fijó (BSA) podrían anclarse los anticuerpos (anti-BSA). Por último se hicieron
curvas corriente-voltaje para el capacitor interdigitado 2 con el depósito de la
capa de óxido de hafnio, encontrándose un aumento en la conductividad cuando
la capa de proteínas era depositada tal como se muestra en la figura 2.26.
55
Figura 2.26 Curva corriente-voltaje para Capacitor interdigitado.
56
Capítulo III. Biosensores
Basados en Nanotubos de
Carbono
57
3.1 Introducción
La detección temprana de patógenos juega un papel crucial en la prevención de
la propagación de enfermedades. Los métodos de diagnóstico más sensibles y
específicos para enfermedades infecciosas son, la reacción en cadena de la
polimerasa [34] conocida como PCR, por sus siglas en inglés (polymerase chain
reaction) y el Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas [35] conocida como
ELISA por sus siglas en inglés (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Sin
embargo, los métodos mencionados anteriormente son costosos, consumen
mucho tiempo y necesitan personal calificado y una instrumentación sofisticada.
Por lo tanto, enfoques alternativos son deseables. En este contexto, los
inmunosensores son una alternativa, ésta, es una prometedora técnica de
inmunoensayo que ha sido aplicada en muchas áreas [36,37]. El rápido
desarrollo de nuevos nanomateriales y nanotecnologías ha proporcionado
nuevas oportunidades para los biosensores, recientemente, el interés en el uso
de los nanotubos de carbono (CNTs por sus siglas en inglés Carbon Nanotubes)
para aplicaciones en biosensores está creciendo. Los CNTs han sido
ampliamente utilizados en este campo debido a que presentan una elevada área
superficial, elevada relación longitud/radio, buena conductividad eléctrica y
resistencia mecánica significativa [38-41]. La posible integración de sensores en
materiales cotidianos, como hilos, materiales de goma o de papel surgió como un
intento de resolver las cuestiones relacionadas con los costos [42-45]. En este
capítulo, se buscó aprovechar las propiedades de los CNTs en el desarrollo de

58
un inmunosensor resistivo que podría ser una alternativa importante a los
métodos convencionales debido a su bajo costo y el uso práctico fácil. La
inmovilización de biomoléculas sobre sustratos sólidos es de crucial importancia
para todos los inmunosensores, el método utilizado en este trabajo se basa en la
creación de un enlace covalente entre los CNTs y la proteína. Los enlaces se
crearon siguiendo tres pasos principales: 1) Oxidación, utilizando una mezcla de
sulfúrico concentrado y ácido nítrico; 2) Silanización, Usando 3-
aminopropiltrietoxisilano (3-APTES), este es un método eficaz para la
modificación de las propiedades físicas y químicas del material tratado, los
agentes de acoplamiento de silano organofuncionales nos permitirán unir
químicamente dos materiales, y finalmente; 3) Modificación de la última capa
usando glutaraldehído como fijador. La funcionalización genera grupos
funcionales en las superficies y luego es posible vincular una proteína sobre la
superficie del biosensor. La albúmina de suero bovino (BSA) se usa comúnmente
como un agente bloqueante para inhibir la adhesión no especifica de proteínas,
es un material de modificación importante debido a la presencia de grupos amino
en su estructura. Después del proceso de funcionalización, BSA y anti -BSA
fueron fijados al sustrato. Los resultados indicaron la unión de moléculas de
silano sobre la superficie de los MWCNTs y muestran que la concentración de
BSA y anti-BSA influye en las características eléctricas de las muestras
depositadas, hay un aumento en la conductividad cuando se añade el BSA y un
decremento de ésta al añadir el anti-BSA. Los resultados relacionados con la
59
disminución de la corriente por la inmovilización del anti-BSA, indican que los
sensores resistivos fabricados con CNTs tienen potencial para ser utilizados
como inmunosensores como una alternativa barata y práctica.
3.2 Nanotubos de Carbono
Los CNTs son estructuras tubulares cuyos diámetros son del orden de los
nanómetros. Aunque Oberlin en 1976, reportaba la observación de filamentos de
carbono con estas dimensiones [46], se dice que estas estructuras fueron
descubiertas “oficialmente” en 1991 por Sumio Iijima [47] de NEC Corporation,
quien caracterizó por microscopía electrónica de alta resolución una nueva forma
alotrópica del carbono que denominó nanotubo de carbono. Quizás, actualmente
las nanoestructuras más interesantes y con mayor potencial de aplicación sean
los CNTs. Se podría pensar en un nanotubo de carbono como una lámina de
grafito enrollada para formar un tubo, con enlaces al final de la lámina para sellar
los extremos [48] como se observa en la figura 3.1.
Figura 3.1. Nanotubo de carbono.
60
Los enlaces químicos que unen a los átomos de carbono en los CNTs son
uniones sp2, similares a las del grafito, y bajo altas presiones los CNTs pueden
fusionarse modificando algunos enlaces a tipo sp 3 confiriéndole fuerza y longitud
ilimitada. Las láminas de grafeno de los CNTs se atraen entre ellas mismas
mediante fuerzas de Van de Waals, de tal manera que los CNTs tienden a
entrelazarse como una trenza de cabello. La presencia de fuerzas de Van der
Waals en la estructura de los nanotubos de carbono explican en gran medida las
propiedades físicas (conductividad térmica y eléctrica, punto de fusión, etc.) de
estos alótropos del carbono ya que implican la existencia de movimiento de
densidad electrónica. Estas fuerzas se deben a que es probable que en un
instante en particular y únicamente por azar, los electrones se encuentren
concentrados en una región de un átomo. Este desplazamiento de electrones
hace que una especie normalmente no polar se convierta momentáneamente en
polar formándose así un dipolo instantáneo. Una vez formado este momento
dipolar instantáneo los electrones de un átomo vecino se desplazan para producir
también un dipolo mediante un proceso de inducción y el nuevo dipolo formado
se denomina dipolo inducido. Estos dos procesos, considerados de forma
conjunta, conducen a una fuerza intermolecular de atracción llamada atracción
instantánea dipolo/dipolo inducido o fuerzas de dispersión de London (Fritz
London proporciono una explicación teórica de estas fuerzas en 1928). Estos
fenómenos están relacionados con la polarizabilidad la que se define como la
tendencia a que se produzca una separación de cargas en un átomo o molécula.
61
Cuanto mayor es esta tendencia se dice que el nanotubo es más polarizable. La
polarizabilidad aumenta con el número de electrones y el número de electrones
aumenta con el número total de átomos de carbono que forman al nanotubo
generando fuerzas de atracción de London más fuertes y aumentando así el
punto de fusión
3.3 Tipos de nanotubos de carbono
Los nanotubos de carbono se pueden clasificar en dos tipos diferentes según sea
el número de capas.
3.3.1 Nanotubos de Carbono de Pared Simple
Los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT, abreviaturas derivadas de la
denominación inglesa Single Wall Carbon Nanotube), están constituidos por
átomos de carbono dispuestos en una red hexagonal cilíndrica, de forma que su
estructura es la misma que se obtendría si se enrollara sobre sí misma una
lámina de grafito. Sus extremos pueden estar cerrados por media esfera de
fulereno o pueden estar abiertos. Los fulerenos son moléculas de carbono
individuales, con estructuras cerradas formadas por varias decenas de átomos de
carbono únicamente, por lo que son formas alotrópicas del carbono. La figura 3.2
muestra la estructura de un tubo formado cuando se enrolla una lámina de grafito
sobre un eje paralelo a los enlaces C-C. El diámetro promedio de los SWNTs
varía entre 1.4 y 2 nm con longitudes de hasta 100 μm. Como consecuencia de
sus propiedades eléctricas los SWNTs han sido los mejores candidatos para la
62
miniaturización electrónica. Se ha demostrado que después de una excitación
con luz visible presentan una longitud de onda cercana a la infrarroja (entre 900 y
1600 nm) [49,50]. Dos años después del hallazgo de lijima, se descubrieron los
SWCNT por el grupo de Iijima en NEC y por otro grupo en el IBM Almaden
Laboratory [51]. A partir de entonces, se ha investigado en la forma de
producirlos en el laboratorio y se ha avanzado mucho en los distintos métodos de
síntesis que han ido surgiendo, así como en los de caracterización, purificación y
separación.
Figura 3.2. Nanotubo de carbono de pared simple.
3.3.2 Nanotubos de Carbono de Pared Múltiple
Los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT por sus siglas en inglés
Multiwall Carbon Nanotubes) tienen una estructura similar a varios SWCNT
concéntricos con diferentes diámetros, en la figura 3.3 se puede observar un
nanotubo anidado, en el que un tubo está dentro de otro [48]. En ambos casos su
63
principal característica, que dará lugar a un buen número de propiedades
excepcionales, es que muestran una relación longitud/diámetro muy elevada: su
diámetro, que depende de la cantidad de hojas concéntricas, es del orden de los
nanómetros y su longitud puede variar desde unas micras hasta milímetros e
incluso algunos centímetros [51]. Al igual que los SWNTs, los MWNTs presentan
una hibridación tipo sp2 sin embargo, para este caso, el cuarto enlace del
carbono forma enlaces débiles del tipo Van der Walls por lo que la estructura
formada adquiere características semiconductoras. La perfección en la estructura
cristalina de lo MWNTs se pierde conforme aumenta el número de hojas de
grafito [52]. Los MWNTs son más fáciles de sintetizar que los SWNTs. Se pueden
producir MWNTs mediante métodos de producción a gran escala, basados en la
descomposición química, lo anterior se traduce en un coste mucho menor de los
MWNTs.
Figura 3.3. Nanotubo de carbono de pared múltiple.

64
3.4 Propiedades de los CNTs
Existen numerosas investigaciones sobre las propiedades físicas y químicas de
los nanomateriales basados en carbono desde que fueron descubiertos en 1991.
Los CNTs han sido estudiados ampliamente por la comunidad científica debido a
sus excelentes propiedades eléctricas, mecánicas y térmicas, las cuales son
aplicadas en diferentes ramos de la ciencia y tecnología. Referente a sus
propiedades eléctricas, podemos mencionar que además de ser buenos
conductores de corriente eléctrica, los CNTs pueden ser metálicos o
semiconductores, según el diámetro y la quiralidad del tubo [48]. En muchos
casos, aunque no siempre, se aprovecha la circunstancia de que las propiedades
eléctricas de los nanotubos de carbono dependen fuertemente de su estructura
atómica y electrónica y cualquier modificación de origen físico o químico que se
produzca en ésta provocará un cambio en dichas propiedades. Midiendo el
cambio tendremos un reflejo de la característica que lo provocó. De sus
propiedades mecánicas, podemos destacar su rigidez y su resistencia, los CNTs
presentan módulos de Young que oscilan entre 1.28 y 1.8 TPa. El módulo de
Young del acero es de 0.21 TPa, lo cual significa que los módulos de Young de
los CNTs son unas 10 veces los del acero [48]. Esto implicaría que los CNTs
fueran muy rígidos y difíciles de doblar. Sin embargo, esto no es exactamente así
porque son muy delgados. Los CNTs resultan ser muy elásticos cuando se
doblan. La mayoría de los materiales se parten al doblarse por la presencia de
defectos, tales como dislocaciones o fronteras granuladas. Como los CNTs

65
presentan muy pocos defectos en la estructura de sus paredes, esto no ocurre.
Otra razón es que cuando se doblan fuertemente, la mayoría de los anillos
hexagonales de carbono en las paredes, cambian de estructura sin romperse
[48]. Por otro lado, sus principales propiedades térmicas consisten en que los
CNTs presentan una muy alta conductividad térmica en dirección al eje del
nanotubo, característica que es transferible a los materiales de los que forma
parte y presentan también una elevadísima estabilidad térmica [53]. Estas
propiedades los convierten en materia prima con un gran potencial para el
desarrollo de todo tipo de elementos disipadores de calor [54], aisladores
térmicos [55] y materiales termoestructurales [56]. Otra característica de los
CNTs, es que disminuyen el punto de congelación de ciertas soluciones, lo cual
es útil para el desarrollo de anticongelantes [57].
3.5 Aplicaciones de los CNTs
Las aplicaciones de los CNTs son muy diversas, por mencionar algunas, se ha
demostrado que es factible diseñar transistores de efecto de campo (FET),
también existen aplicaciones en emisión de campo, en celdas de combustible, en
la formulación de nanocompuestos para dispositivos electrónicos, ópticos,
biosensores entre otros. Uno de los principales usos de los CNTs es su
incorporación a otros materiales con el objetivo de producir materiales
compuestos de ingeniería, esto con el fin de realmente tomar ventaja de sus
excelentes propiedades mecánicas [58], en este sentido, existen aplicaciones de
66
CNTs como reforzamiento mecánico, un ejemplo es el uso de largas fibras de
carbono como el poliacrilonitrilo (PAN) la cual es ya una tecnología usada para
aumentar la resistencia de sustancias orgánicas e inorgánicas usadas en algunos
plásticos
3.6 Funcionalización de los CNTs
La manipulación de los CNTs ha sido limitada debido a que son insolubles en la
mayoría de los solventes comunes [59]. La funcionalización de CNTs consiste
en la modificación de propiedades por la adsorción de átomos o moléculas en las
paredes exteriores. Se pueden obtener cambios en las propiedades físicas de la
superficie de estas nanopartículas, como lo son la solubilidad y dispersión, las
cuales son importantes en las propiedades biológicas de los CNTs, ya que les
permite tener una mejor interacción con moléculas biológicas [60-62]. La
funcionalización orgánica de los CNTs ha permitido un alto nivel de solubilidad en
cloroformo, diclorometano, acetona, metanol, etanol e incluso en agua [63]. La
solubilidad no es la única ventaja obtenida al funcionalizar los CNTs, a los grupos
funcionales pegados en la pared de los CNTs se pueden conjugar una gran
variedad de moléculas de interés clínico. La funcionalización de los nanotubos se
basa en una reacción de cicloadición 1,3-bipolar con intermediarios cargados de
azometina, generada por la condensación entre un ácido á-amino y un aldehído.
67
3.7 Aplicaciones Médicas de los CNTs
Los CNTs son uno de los avances tecnológicos con mayor potencial para el área
médica. Por medio de reacciones químicas sencillas se pueden pegar a la
superficie de los CNTs sustancias de interés clínico. Además, por su tamaño,
pueden transitar libremente a través de la circulación sanguínea y atravesar la
barrera encefálica, el epitelio estomacal y pueden ser filtrados por el bazo y el
riñón, convirtiéndose en una gran alternativa para el área terapéutica [64].
Algunas de sus aplicaciones médicas son el uso de nanovacunas, administración
de drogas terapéuticas, terapia genética y biosensores. En el presente trabajo
nos enfocaremos en el estudio, diseño y fabricación de un inmunosensor resistivo
basado en CNTs.
3.8 Biosensores de CNTs
La capacidad de funcionalizar los CNTs ha motivado varias investigaciones en las
cuales es posible unir a la superficie de los CNTs, sustancias de interés en el
diagnóstico médico, para ser usados como biosensores. La combinación única
de excelentes propiedades mecánicas, eléctricas y electroquímicas, que
presentan los CNTs ha fomentado el aumento de interés en la aplicación de
CNTs como componentes de biosensores. Debido a todas sus propiedades, los
CNTs son materiales prometedores para aplicaciones de detección. Los sensores
basados en nanomateriales de carbono generalmente tienen mayor sensibilidad y
un límite de detección más bajo que los sensores tradicionales [65]. Los CNTs se
68
presentan como una opción interesante para la fabricación de sensores de
pequeño tamaño, portátiles, rápidos y de bajo consumo. Se han desarrollado
biosensores de CNTs para la detección de de cepas de pseudomonas [65],
también existen numerosos trabajos, y se han logrado grandes avances usando
biosensores basados en CNTs para la detección de glucosa [66]. Se han hecho
grandes avances en investigaciones sobre inmunosensores mediante técnicas
electroquímicas usando diferentes tipos de electrodos. En cualquiera que sea el
caso, un paso importante en el diseño y fabricación de biosensores basados en
CNTs, es la funcionalización de los nanotubos, la cual permitirá el fijar la
sustancia biológica a sensar, con la parte sensante, ya sea metálica o
semiconductora. Lo que se pretende en éste trabajo, es aprovechar las
propiedades de los CNTs antes mencionadas, en un inmunosensor resistivo de
CNTs depositados sobre un substrato de vidrio. Para lograr esto, primero se
deben modificar los CNTs añadiendo grupos funcionales que permitan la unión
con una parte biológica, después ser depositados sobre un substrato, para
entonces ser utilizados como sensores. Los pasos a seguir para lograr la
funcionalización de los CNTs son: La purificación, la oxidación y la silanización,
en ese orden, después de funcionalizados, los CNTs serán depositados sobre
vidrio, luego se añadirá un enlanzante (GA) para luego añadir BSA y anti-BSA.
Además de las caracterizaciones ópticas, se realizaron mediciones eléctricas que
permitieron cuantificar los cambios de la superficie de CNTs entre cada paso, al
compararse estos se resultados, se puede obtener información sobre el potencial
69
de los dispositivos para ser usados como inmunosensores. Los pasos antes
mencionados, como también las caracterizaciones hechas entre cada
modificación de los CNTs se explicarán más adelante, en éste capítulo.
3.8.1 Reactivos
Los reactivos utilizados para la modificación superficial fueron: Albumina de suero
bovino (Sigma-Aldrich ≥96% libre de IgG), buffer de fosfato salino (Sigma-Aldrich
PBS pH 7.4), 3-Aminopropiltrietoxisilano (Sigma-Aldrich APTS, 99%), Anti-
albumina bovina-Agarosa (Sigma-Aldrich en suspensión de PBS). También
Glutaraldehído (50% Electron Microscopy Sciences), Acido Nítrico (Fermont
90%), Acido sulfúrico (Fermont 98-99%), Acetona (Fermont 99.55%) Alcohol iso-
propílico (Fermont 99.9%) Alcohol etílico (Fermont 99.9%). Agua desionizada
(Fermont 1.1*10^-6 1/Ω*cm).
3.8.2 Paso #1 Purificación de MWNTs
La purificación es necesaria, si se quiere remover restos de catalizadores
presentes en los MWNTs obtenidos por métodos convencionales, siempre que se
pretenda obtener un material puro. El objetivo de la purificación de los MWNTs es
separar a los nanotubos de otras formas indeseables producidas durante la
síntesis, como pueden ser fulerenos y carbón amorfo. Los pasos que se siguieron
con la finalidad de purificar los MWNTs, a los que llamaremos p-MWNTs, fueron
los siguientes:
70
o Poner los nanotubos de carbono a 400°C durante 30 minutos, para
eliminar carbón amorfo.
o Sumergir CNTs en ácido Clorhídrico durante 24 horas.
o Filtrar los CNTs.
o Enjuagar CNTs con alcohol etílico.
o Filtrar CNTs.
o Calentar CNTs durante 30 minutos a 200°C para eliminar el alcohol.
3.8.2.1 Caracterización SEM
En el presente trabajo, se utilizó un microscopio electrónico de barrido modelo
JEOL JCM-5000. En la figura 3.4 se observa una imagen de los MWNTs antes y
después del proceso de purificación respectivamente, tomado con el SEM. En
ellas se observa una clara disminución de los aglomerados.
Figura 3.4 Imagen SEM de MWNTs (a) antes y (b) después de proceso de purificación.
71
3.8.2.2 Caracterización Raman
Las mediciones de dispersión de Raman se realizaron a temperatura ambiente
usando un espectrómetro de Jobin-Ybon T64000 operando en la configuración
triple. La espectroscopia Raman es capaz de brindar información muy útil de
materiales como los CNTs, estos presentan una banda intensa sobre 1600 cm-1,
correspondiente a la vibración fundamental (primer orden) de elongación
tangencial denominada G. También presentan una intensa banda en la zona de
1300 cm-1, denominada D. La banda D es indicadora de la presencia de defectos
en las paredes, la relación de las bandas D y G, denotada como ID/G, puede
usarse para la caracterización del grado de desorden estructural presente en las
muestras analizadas. Las relaciones de intensidades de estas bandas, así como
las posiciones específicas de las mismas, antes y después del proceso de
purificación se presentan en la Tabla 3.1.
Picos Intensidad
Banda Banda Banda Banda ID/G

D G D G
MWNTs 1354.71 1593.93 36.99 37.63 0.98

p-MWNTs 1368.24 1589.07 11157 26123 0.42
Tabla 3.1. Posiciones e intensidades asociadas a los picos visibles en el espectro Raman de los
MWNTs.
En la figura 3.5 se observa el corrimiento Raman de los MWNTs y los MWNTs
después del proceso de purificación.
72
Figura 3.5. Corrimiento Raman de MWNTs y los MWNTs purificados.
Por medio del tratamiento con ácidos se logró reducir en índice ID/G en un
57.14%, evidencia de que se ha logrado reducir impurezas en el primer paso de
la funcionalización de los CNTs, la purificación y los cuales denotaremos como p-
CNTs.
3.9 Paso# 2 Oxidación de CNTs
En las distintas aplicaciones de los CNTs, la oxidación de los nanotubos juega un
rol importante ya que a través de ella se modifica su morfología superficial al
introducir nuevos grupos funcionales. Uno de los métodos más comunes en la
73
oxidación de CNTs es el tratamiento con ácidos concentrados (HNO 3/H2SO4).
Esta técnica genera un rompimiento de enlaces que pueden reaccionar dando
lugar a la formación de grupos funcionales que contienen átomos de oxígeno,
tales como ácidos carboxilos, lactonas, cetonas, anhídridos carboxílicos, fenol
entre otros. Al obtenerse un grupo mayor de grupos funcionales que contienen
oxígeno, se aumenta la capacidad de intercambio iónico del material. La
oxidación también aumenta la hidrofilia de la estructura superficial. La oxidación
es el primer paso en el que algunas investigaciones se centran previas a la
silanización de CNTs, la cual se describirá más adelante. Los pasos que se
siguieron con la finalidad de oxidar los p-CNTs y obtener O-CNTs fueron los
siguientes:
o Dispersar 3 gramos de CNx en 300 mL de concentración de
H2SO4/HNO3 (3:2 v/v) a 50°C.
o Agitar por 24 horas.
o Filtrar y lavar con agua y acetona.
o Secar al vacío a 100°C durante 24 horas.
También se hicieron pruebas oxidando SWNTs con un sistema de UV-ozono en
el cual el oxígeno pasa delante de una lámpara de ultravioleta a 185 nm. Las
muestras de SWNTs se exponían en el sistema UV-Ozono durante 1 hora.
74
3.9.1 Mecánismo de reacción
Se tiene en la superficie del nanotubo de carbono átomos de carbono enlazados
a tres átomos de carbono por lo que tiene un electrón de la capa de valencia libre
y puede formar otro enlace sigma para completar el octeto. Se añade una mezcla
1:3 v/v de ácido nítrico con peróxido de hidrógeno para el caso de los MWNTs y
se usa un sistema de UV-Ozono para los SWNTs. Lo anterior provoca la
oxidación de la superficie de los CNTs, es decir, los átomos de carbono forman
un enlace nuevo con un átomo de oxígeno enlazado a su vez a un átomo de
hidrógeno, esto se debe a que el átomo de oxígeno tiene un par electrónico para
formar dos enlaces, un enlace sigma con el carbono y otro enlace sigma con el
hidrógeno que obtiene de la solución que es fuertemente ácida (alta
concentración de iones hidrogeno). Los esquemas de dichas reacciones se
muestran en las figuras 3.6 y 3.7.
Figura 3.6. Esquema de oxidación de MWNTs basado en una mezcla ácida de HNO3/H2O2
75
Figura 3.7. Esquema de oxidación de SWNTs basado en tratamiento con sistema de UV-Ozono.
3.9.2 Caracterización con espectroscopia de infrarrojo
Las técnicas espectroscópicas, además de no ser destructivas, suelen reunir los
requerimientos para identificar los cambios ocurridos después de una reacción,
una de estas técnicas es la espectroscopia infrarroja. Si un compuesto se ilumina
con luz infrarroja, ésta pueda atravesarlo o bien absorberse. Que tenga o no
lugar la absorción depende de la frecuencia exacta de la luz y de los tipos de
enlaces y grupos funcionales presentes en la molécula [67]. La espectroscopia
Infrarroja es una técnica empleada en el análisis de composición de materiales
orgánicos e inorgánicos, en sólido, líquido y fase gas, la operación del sistema se
realiza haciendo pasar un haz de luz infrarroja a través de la muestra bajo
estudio, la luz transmitida se analiza a fin de revelar la cantidad de la energía que
es transmitida o absorbida en cada longitud de onda. La técnica de
espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR, Fourier-Transform
76
Infrared Spectroscopy, por sus siglas en inglés) es una herramienta analítica
instrumental que se basa en la absorción de la radiación infrarroja por las
moléculas en vibración, la técnica permite identificar los principales grupos
funcionales de la estructura molecular de un compuesto al someterse a la
radiación infrarroja dentro del espectrofotómetro. El hecho de que se pueda
identificar a determinados grupos funcionales de una molécula permite la
utilización de esta técnica en el seguimiento de una reacción en la que se tiene
lugar una transformación de grupos funcionales observables en IR. La tabla 3.2
muestra un resumen de las frecuencias de tensión en IR [68]. En el presente
trabajo, dado que en el proceso de funcionalización de los CNTs se añadieron
grupos funcionales entre cada paso de modificación de la superficie, la técnica
fue de gran ayuda para identificarlos. Para ello se utilizó un Espectrofotómetro de
Infrarrojo con Transformada de Fourier (FTIR) Spectrum GX de Perkin Elmer con
Microscopio acoplado AutoIMAGE. El FTIR opera en el Medio y Cercano
Infrarrojo (MIR y NIR). Las figuras 3.8 y 3.9 muestran los espectros FT-IR típicos
de MWNTs y SWNTs oxidados respectivamente, en ellos se observan los picos
de distintos grupos funcionales. Las bandas en 3432 cm-1 y una más pequeña en
1050 cm-1 indican la presencia de grupos hidroxilos (O-H) en la superficies de los
O-MWNTs y de los O-SWNTs. La banda en 1159 cm-1 corresponde a la
presencia de grupos carboxilos (COOH). Todas las observaciones anteriores
indican que las superficies de los MWNTs y de los SWNTs han sido oxidadas.
77
Frecuencia (cm-1) Grupo funcional Comentarios
alcohol O─H siempre es ancha.
puede ser ancha, puntiaguda o ancha
amina, amida N─H
3300 con picos.
siempre es puntiaguda, generalmente
alquino ≡C─H
intensa.
│
alcano ─ C─H justo por debajo de 3000cm-1
│
H
3000
/
alqueno =C justo por encima de 3000cm-1
\
H
ácido O ─ H muy ancha
alquino ─ C≡C ─ justo por debajo de 2200 cm-1
2200
nitrilo ─ C≡N justo por encima de 2200cm-1
Cetonas, aldehídos, ácidos, superior en
\ el caso de los ésteres, aproximadamente
1710
carbonilo C=O 1735cm-1 la conjugación disminuye la
(muy fuerte)
/ frecuencia, más bajo en el caso de las
amidas, aprox. 1650cm-1
\ / La conjugación disminuye la frecuencia
alqueno C=C en el caso del C=C aromático aprox.
/ \ 1600cm-1
\ / Más intensa que el C=C
imina C=N
1660
/
\ Más intensa que el C=C
amida C=O
/
Los éteres, ésteres y alcoholes también presentan tensiones C-O ENTRE 1000 Y 1200 cm-1
Tabla 3.2 frecuencias de tensión en IR.
78
Figura 3.8. FT-IR de O-MWNTs
Figura 3.9. FT-IR de O-SWNTs

79
3.10 Paso# 3 Silanización de los CNTs
En el proceso de silanización, una superficie es cubierta con grupos funcionales
de alcoxisilano. La silanización de CNTs diversifica las características de su
superficie, estas características están relacionadas con el silano usado en la
funcionalización. La dispersión de los nanotubos de carbono en disolventes
orgánicos es modificada por el tipo de organosilano aplicados en silanización de
los nanotubos. Los organosilanos se describen químicamente como:
R-Si-R‟3
Donde R es un grupo orgánico-funcional unido a silicio. En la silanización de
CNTs, se ha propuesto que el grupo R puede elegirse para que sea reactivo en
función de la matriz orgánica que se utiliza. Los CNTs silanizados (S-CNTs) se
utilizan para unir a la superficie de nanotubos con las de otras nanopartículas y
moléculas [56]. Los pasos que se siguieron en el proceso de silanización son los
siguientes.
o Dispersar 0.05 gramos de O-MWNTs en 50 mL de etanol.
o Sonicar durante 30 minutos.
o Mezclar con 3-APTES y agitar magnéticamente durante 4 horas a 70°C.
o Enjuagar con agua desionizada.
o Limpiar con acetona.
o Filtrar y secar al vacío, 80°C durante 12 horas.
80
El último paso es agregar el GA el cual representará un puente de unión entre los
grupos amino del 3-APTES y las aminas primarias de las proteínas.
3.10.1 Mecanismo de reacción
Primero, al tener el 3-APTES en solución, éste sufre una hidrólisis por
encontrarse en solución polar. Mediante ésta hidrólisis los radicales unidos al
oxígeno de la molécula formaran alcohol etílico y esto permite a las moléculas de
3-APTES unirse entre ellas mediante el oxígeno que perdió el radical etilo.
Posteriormente una molécula de 3-APTES con un oxígeno que ha perdido su
radical etilo es atraída mediante enlaces del tipo puente de hidrógeno al
hidrógeno del oxígeno que se encuentra en la superficie previamente oxidada, se
forma una nueva molécula de agua y finalmente queda enlazado el silicio de la
molécula del 3-APTES al oxígeno que se encontraba en la superficie del
nanotubo de carbono. El esquema del mecanismo de reacción de la silanización
de los nanotubos de carbono, tanto monocapa como multicapa, se muestra en la
figura 3.10.
3.10.2 Caracterización FT-IR
El espectro FT-IR del producto obtenido al reaccionar los O-MWNTs con el 3-
APTES (S-CNx o S-MWNTs) se muestran en la figura 3.11. Se puede ver un
pico de absorción característico en 1079 cm-1 el cual se atribuye a la vibración
Si-O. Se observa también un pico en 800 cm-1 debido a la vibración SI-OH [67].
81
Figura 3.10. Esquema de silanización de CNTs.
Figura 3.11. Espectro FT-IR del producto obtenido al reaccionar los O-MWNTs con el 3-APTES.
82
3.11 Deposito de CNTs sobre vidrio.
Los nanotubos se depositaron en soportes de vidrio de 2.5 x 7.5 cm por medio de
goteo con una jeringa para su secado final, el vidrio se mantuvo a una
temperatura ambiente. La figura 3.12 muestra una imagen tomada con el
microscopio óptico del depósito de los MWNTs a una concentración de 2mg/mL,
sobre un substrato de vidrio.
Figura 3.12. Imagen tomada con microscopio óptico de depósito de CNTs sobre vidrio.
83
3.12 Mediciones Eléctricas de Sensor
Dos líneas verticales de plata de 6 mm de largo y 1.2 mm de ancho se
depositaron encima de los MWNTs usando una pintura de plata conductora, se
hizo un anclaje de los cables de cobre para crear contactos eléctricos en ambos
lados de la superficie de la película para permitir la caracterización corriente-
tensión (I-V). Los resultados se obtuvieron a presión atmosférica, a temperatura
ambiente, utilizando un electrómetro Keithley 617 ®, mientras que la variación de
la tensión aplicada fue de 0,05 a 0,30 V. Se registraron las curvas de tensión vs.
corriente (I-V) para la inmovilización sobre la superficie de BSA y anti-BSA. La
figura 3.17 muestra las características I-V del biosensor y del biosensor con el
anticuerpo. Se observó una disminución de corriente de 15,65% a una tensión
de polarización de 0,3 V entre uno y otro.
3.13 Conclusiones
Un esquema de los pasos que se siguieron en el tratamiento de los MWNTs
antes de ser depositados sobre vidrio se muestra en la figura 3.13.
Figura 3.13. Tratamientos hechos a los MWNTs antes de ser depositados sobre vidrio.
84
Después de purificar los MWNTs con ácido clorhídrico, se logró reducir el índice
ID/G en más de un 50%, también disminuyeron los aglomerados tal como lo
muestran las imágenes SEM, el diámetro final de los p-MWNTs estaba dentro de
un rango de 80-100nm. El siguiente paso en el proceso de funcionalización fue la
oxidación de los CNTs, las caracterizaciones FT-IR (figura 3.8) muestran una
banda en 1159 cm-1 que indica la presencia de grupos carboxilos. Con respecto
al proceso de silanización, mediante caracterizaciones de FT-IR se pudieron
observar bandas atribuidas a los modos de vibración Si-O y SI-OH después del
proceso de silanización. La manipulación y el procesamiento de los CNTs están
limitados por su insolubilidad en disolventes orgánicos comunes. La
funcionalización de los CNTs puede resolver éste problema y así preparar los
CNTs para procesos en los cuales la solubilidad es indispensable. Una señal
inequívoca de que los CNTs se han funcionalizado correctamente es su
solubilidad en el agua. En la figura 3.14 se observa la comparación entre MWNTs
sin funcionalizar disueltos en agua desionizada y s-MWNTs disueltos en el mismo
medio. La figura 3.15 muestra una imagen SEM de los CNTs después del
proceso de silanización.
Figura 3.14. Soluciones de MWNTs sin funcionalizar y MWNTs funcionalizados.

85
Figura 3.15. Imagen SEM de CNTs silanizados.
En la figura 3.16 se comparan los espectros de los MWNTs y los S-MWNTs, se
puede ver en ella una diferencia considerable entre 1000 cm-1 y 1200 cm-1.
Acercándonos en esa zona, figura 3.17, podemos ver dos picos en 1154 cm-1 y
1079 cm-1. El primero indica la presencia de grupos carboxilos como se dijo
anteriormente, el segundo se atribuye a la vibración Si-O. Las bandas antes
mencionadas, no se encuentran en el espectro del MWNTs tal como se observa
en la figura.
86
Figura 3.16. Espectros FT-IR de MWNTs y s-MWNTs.
Figura 3.17. Acercamiento de espectros FT-IR de MWNTs Y s-MWNTs.
87
En cuanto a las conclusiones obtenidas por los resultados en las mediciones
eléctricas, la resistencia de las muestras depositadas aumentó en función de la
inmovilización de anti-BSA debido a que las moléculas depositadas sobre los
MWNTs actúan como donadores de electrones al contribuir con cargas negativas
a los MWNTs de tipo p las cuales, en presencia de aire tienen como
consecuencia una reducción de la carga [69]. La curva corriente-voltaje se
muestra en la figura 3.18
Figura 3.18. Valores experimentales I-V de muestras establecidas.
88
Capítulo IV.
Funcionalización de
superficies de óxido de
hafnio
89
4.1 Óxido de hafnio (HfO2)
El hafnio es un metal de transición que se simboliza como Hf, se encuentra en el
grupo 4 de la tabla periódica de los elementos. En la naturaleza el Hafnio se
encuentra en 190 partes por millón de la corteza terrestre junto con el Zirconio,
estos dos elementos son químicamente muy similares por lo que resulta muy
difícil su separación. Los óxidos de Hf (IV) se obtienen por combinación directa
de los elementos o por calentamiento, del HfCl4 con H2O seguido de
deshidratación. Estos óxidos son de color blanco, y son isoestructurales. El HfO2,
también llamado dióxido de hafnio, óxido de hafnio (IV) o hafnia, es un
compuesto inorgánico absolutamente inerte. El HfO2 se ha estudiado
ampliamente en años recientes, ya que posee importantes características físico-
químicas tales como lo son una buena estabilidad térmica (temperatura de fusión
de 2774°C), buena estabilidad química (sólo reacciona con ácidos y bases
fuertes) y buena estabilidad mecánica [70,71]. Las propiedades antes
mencionadas le brindan un gran potencial en aplicaciones como aislantes
eléctricos en dispositivos electrónicos y optoelectrónicos, por su alta constante
dieléctrica (≈25) y amplia brecha energética (Eg= 5.68 eV) presentan un área de
interés en la microelectrónica, donde ha sido considerado como material
alternativo al óxido de silicio en dispositivos MOS (Metal-Óxido-semiconductor)
de la siguiente generación como el transistor de efecto campo sensible a iones
(ISFET), transistores de efecto campo enzimáticos (EnFET), Transistores de
efecto químico, Bio-FET, DNAFET, etc. [72]. La principal razón por la cual se
90
considera al HfO2 como un sustituto al óxido de silicio se debe a que, desde que
los transistores de efecto campo metal-óxido-semiconductor (MOSFET) fueron
introducidos a principios de la década de los 60, cada nueva generación de
dispositivos ha empleado un óxido de silicio cada vez más delgado. Conforme el
espesor del óxido se reduce, la corriente de pérdidas a través de él por efecto
túnel aumenta exponencialmente. Éste es un efecto cuántico que no depende de
la calidad del óxido, sino sólo de su espesor. Debido a ello puede que no sea
posible emplear láminas de SiO2 por debajo de 1.2 nm. La corriente de túnel
sería tan elevada que causaría una disipación de potencia inaceptable, lo cual es
especialmente crítico en sistemas electrónicos de bajo consumo. Por lo anterior,
la opción que se presenta es sustituir el óxido de silicio por otros dieléctricos de
alta k (permitividad mayor o igual que la del nitruro de silicio k=7). La mayor
constante dieléctrica hace que las estructuras metal-aislante-semiconductor
fabricadas con estos materiales puedan tener la misma capacidad con un
espesor notablemente mayor que una lámina de SiO 2 equivalente. De esta forma
se elimina el problema de las corrientes de túnel. Su elevada constante
dieléctrica permite también que sea altamente sensible a cambios de pH; también
se utiliza en procesos de fotocatálisis [73] por su dureza (6.5 escala de Mohs), se
ha empleado en sensores de gases [74,75], también tiene aplicaciones como
capa óptica antirreflejante por su alta transmisión óptica (80-98%) en la región del
visible e infrarrojo cercano a diferentes ángulos de incidencia [76,77]. Las
91
propiedades antes mencionadas hacen del óxido de hafnio un material que
presenta gran interés para ser usado en el campo de los biosensores.
4.2 Biosensores de HfO2
La variación de fluido corporal humano en concentraciones pequeñas puede ser
crítico para el diagnóstico clínico, por lo tanto, la detección de especies químicas
y biológicas a través de los dispositivos de sensores microelectrónicos ha atraído
gran atención en la última década. El aumento de la disponibilidad de técnicas
para la fabricación y caracterización de semiconductores ha suscitado un interés
generalizado destinado a su uso en diferentes sistemas biotecnológicos. La
capacitancia se puede mejorar mediante el aumento de la constante dieléctrica k
sin tener que cambiar la geometría del sistema. Muchos materiales con alta
constante dieléctrica han sido considerados como posibles alternativas en lugar
de SiO2, ya que presentan capacitancia y dimensiones óptimas [78,79]. Algunos
de estos materiales son: óxido de aluminio (Al 2O3), pentóxido de tántalo (Ta2O5),
dióxido de titanio (TiO2), dióxido de circonio (ZrO2) y óxido de hafnio (HfO2). Si
comparamos el HfO2 con los otros mencionados dieléctricos, el HfO2 presenta la
ventaja de aumentar la estabilidad térmica en el silicio mediante la deposición de
capas atómicas (ALD) como método de deposición. Por lo tanto, el HfO2 puede
ser considerado un material prometedor. En la aplicación a un biosensor, estas
propiedades pueden ser dirigidas al considerar el efecto de la carga de un
material.
92
4.3 Deposito por capas atómicas.
El método de depósito por capas atómicas fue propuesto por Aleskovskii V.B en
1952. Consiste en reacciones de saturación de adsorción superficial de
precursores que fluyen de forma secuencial a un reactor de baja presión. Esta
técnica al ser un crecimiento superficial limitado por adsorción produce películas
de alta calidad con excelente uniformidad y una conformación superficial casi
perfecta [72]. Las características principales de esta técnica son: deposición
cíclica, homogeneidad de la película, control del espesor a nivel atómico
mediante el número de ciclos y el bajo nivel de impurezas. Cada ciclo consiste de
dos veces el proceso de quimiadsorción-saturación-purga (1-3 segundos) y se
crecen dos capas atómicas por ciclo (3 A°) y se requiere que los precursores
sean estables a la temperatura de trabajo y que sean reactivos con el sustrato.
La temperatura de trabajo se encuentra entre 200-400 °C y presiones de 0.1 a 10
mbar. La reacción que se lleva a cabo es de la forma:
AXn + BYn → AB + nXY
Donde la capa AB se forma a partir de los compuestos AXn y BYn y las
moléculas volátiles nXY salen del reactor durante la purga. Algunas de las
desventajas del crecimiento por ALD son el prolongado tiempo de crecimiento,
las altas temperaturas de evaporación que necesitan los materiales a depositar,
las pocas técnicas de monitoreo in situ y el hecho de que aún no existen
93
comercialmente algunos de los precursores químicos para compuestos típicos o
comunes a crecer.
4.4 Material y Métodos
4.4.1 Crecimiento HfO2 por ALD
El óxido de hafnio fue crecido sobre obleas de silicio Si (100) por deposición de
capas atómicas en un sistema ALD de Savannah 100 de Cambridge NanoTech,
usando Tetraquis(dimetilamido)-hafnio [(CH3)2N]4Hf, C8H24HfN4 (TDMAHf) como
precursor y agua desionizada como reactante. La temperatura en la cámara se
fijó a 275 °C, mientras que la temperatura del TDMAHf se fijó a 70ºC. Se hicieron
500 ciclos que corresponden aproximadamente a 62 nm de espesor de HfO2.
4.4.2 Funcionalización del substrato
Las superficies de los substratos de HfO2 se modificaron de la siguiente manera:
Las muestras se limpiaron con acetona, 2-propanol y agua desionizada seguido
por inmersión en una solución Piraña (3:1 de ácido sulfúrico al peróxido de
hidrógeno) durante 1 hora. Después las muestras se sumergieron en una
solución etanólica de 3-APTES recién preparada (6%, v/v) durante 2 h a
temperatura ambiente, seguido de inmersión en etanol durante 1 min y se
secaron con una corriente de N2, después de eso, se sumergieron las muestras
en una solución de GA y PBS (1.25 %, v/v) durante 1 h, y después se limpiaron
94
con una solución de PBS. A continuación, las muestras se sumergieron en una
solución de PBS y albúmina de suero bovino (50 % v/v) durante 1 h.
4.4.3 Caracterización por microscopia de fuerza atómica
El microscopio de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés) es un
instrumento que puede estudiar la morfología superficial de muestras a nivel
microscópico. Mediante el AFM es posible ver características superficiales con
gran resolución y presenta la ventaja de obtener imágenes de cualquier tipo de
superficie, incluyendo polímeros, cerámica, cristales, materiales compuestos y
muestras biológicas. Para llevar a cabo las caracterizaciones de AFM se utilizó el
microscopio Solver NEXT SPM de NT-MDT. Las muestras a estudiar se fijaron en
un substrato metálico el cual estaba montado en un portamuestras, a su vez, el
portamuestras se fijó a la parte superior del escáner piezoeléctrico. El sistema de
posicionamiento permite mover la muestra en el plano XY para seleccionar el
área de investigación y de igual manera desplaza la muestra verticalmente para
acercarla hacia la punta. El microscopio óptico incorporado está equipado con un
sistema de ubicación que selecciona el área deseada sobre la superficie de la
muestra. Se midieron tres áreas por cada muestra para obtener un promedio de
las rugosidades en éstas. Se utilizó una punta fabricada de platino-iridio de
longitud 0.8 mm. Para obtener las imágenes en este microscopio de fuerza
atómica se usó la técnica de topografía en el modo semi-contacto. Las
condiciones de medición fueron a temperatura ambiente y humedad relativa
alrededor del 35%. Posteriormente, utilizamos el software Gwyddion 2.24 una

95
herramienta muy útil para el análisis y visualización de datos obtenidos con el
AFM, con este programa se logró medir rugosidad, tamaño de grano, altura
máxima, densidad y volumen. La rugosidad se calculó mediante el escaneo cinco
veces en cada muestra.
4.4.4 Caracterización UV-Vis
Se caracterizó la absorbancia de los reactivos en suspensión mediante un
espectrofotómetro USB650-UV-VIS. Los reactivos se midieron en una celda de
cuarzo, el espectrómetro cubre un rango que va desde 200 nm hasta 850 nm.
Para caracterizar las muestras de HfO 2 se utilizó un espectrofotómetro LAMBDA
25 con un rango de 190 a 1100 nm.
Figura 4.1. Espectrofotómetro USB650-UV-VIS
96
4.4.5 Caracterización Raman
Las mediciones de dispersión de Raman en substratos sólidos se realizaron a
temperatura ambiente usando un espectrómetro de Jobin-Ybon T64000 con una
línea de excitación de 514.5 nm. Las caracterizaciones Raman de los reactivos
en suspensión se hicieron usando un espectrómetro Raman IDR-MINI con una
línea de excitación de 785 nm como se muestra en la figura 4.2.
Figura 4.2. Raman IDR-MINI.
Se utilizó un espectrofotómetro de Infrarrojo con Transformada de Fourier (FTIR)
Spectrum GX de Perkin Elmer con Microscopio acoplado AutoIMAGE. El FTIR
opera en el Medio y Cercano Infrarrojo (MIR y NIR).

97
4.5 Resultados
4.5.1 Rugosidad
La Figuras 4.3 (a) muestra la topografía de los anticuerpos inmovilizados en la
superficie. La figura 4.3 (b) muestra la topografía en 3D. La figura 4.4 (a) muestra
la morfología de la superficie de una película de HfO2, que representa una
estructura uniforme de la superficie de la película. La figura 4.4 (b) muestra la
superficie de HfO2 modificada, en ella se pueden observar las proteínas fijadas
como pequeños óvalos, éstos tienen un radio de aproximadamente 100 nm. El
comportamiento de la rugosidad promedio en función de la concentración de
anticuerpos se muestra en la figura 4.5. Ante un exceso de antígeno o un exceso
de anticuerpo la mayoría de los complejos antígeno-anticuerpo se mantienen
solubles pero en el punto de equivalencia se produce un precipitado amorfo e
insoluble; en la curva de rugosidad se observa un pico en 10% y se debe a que
en esa concentración de anticuerpo se alcanza el punto de equivalencia y se
forma sobre la superficie del sustrato un sólido amorfo que es detectado como
una irregularidad sobre la superficie (rugosidad) por lo que se puede medir
rugosidad para detectar el punto de equivalencia.
98
Figura 4.3. a) Topografía de los anticuerpos inmovilizados 2D. b) Topografía de los anticuerpos
inmovilizados 3D.
Figura 4.4. a) Morfología de la superficie de una película de HfO2. b) Morfología de la superficie

de una película de HfO2 funcionalizada.
99
Figura 4.5. Comportamiento de la rugosidad en función de la concentración de Anti-BSA.
4.5.2 Absorbancia
Se obtuvieron los espectros en el UV-visible de los reactivos con los cuales se
tratarían los substratos en su proceso de funcionalización. La figura 4.6 muestra
la absorbancia del 3-APTES, encontrándose su máximo en 208 nm. La figura 4.7
y 4.8 muestran la absorbancia de la albúmina de suero bovino y de la albúmina
de suero humano (HSA), los máximos de absorbancia se encontraron en 276 nm
y 280 nm respectivamente. Al medir la absorbancia en los substratos se encontró
una saturación en el rango de 260 a 285 nm debido a la presencia de BSA fijada
sobre el substrato de HfO2 después del proceso de funcionalización (figura 4.9).

100
Figura 4.6. Absorbancia de 3-APTES.
Figura 4.7. Absorbancia de BSA.

101
Figura 4.8. Absorbancia de HSA.
Figura 4.9. Absorbancia de muestra de HfO2 sin funcionalizar comparada con una funcionalizada.
102
4.5.3 Espectroscopia Raman
Los resultados obtenidos al caracterizar las superficies de HfO 2 por medio de
espectroscopia Raman muestran un pico en 1320 cm-1 aproximadamente (figura
4.11). Resultado que coincide con el pico obtenido al medir corrimiento Raman en
solución acuosa de albúmina de suero humano (figura 4.10). La figura 4.11
muestra los espectros Raman de una superficie de HfO2 antes y después de la
modificación de la superficie, el pico en aproximadamente 1300 cm-1 no se
observa en el espectro correspondiente a la superficie de HfO 2 sin funcionalizar.
Figura 4.10. Espectro Raman de albúmina de suero humano diluido en agua.
103
Figura 4.11. Espectro Raman de muestras de HfO2 antes y después de la modificación de la
superficie.
Por medio de esta técnica fue posible identificar los principales grupos
funcionales de la estructura molecular de las superficies al someterse a la
radiación infrarroja dentro del espectrofotómetro. Las superficies del HfO2
presentaron un pico cercano a los 3500 cm-1 dichas vibraciones corresponden a
la presencia de un grupo amino tal como puede verse en la figura 4.12. En la
figura 4.13 puede observarse un pico en aproximadamente 1730 cm-1 que
corresponde a los grupos carboxilos. Esto resultados prueban que los grupos
funcionales necesarios para que la superficie esté preparada para fijar el
elemento de reconocimiento han sido creados sobre la superficie de HfO 2.

104
Figura 4.12. Espectros FT-IR de substrato funcionalizado y substrato sin funcionalizar.
Figura 4.13 Espectros FT-IR de substrato funcionalizado y substrato sin funcionalizar.
105
4.6 Conclusiones
La figura 4.14 resume el proceso de modificación de las superficies de HfO2. En
ella se observan los grupos funcionales que se fueron añadiendo entre cada paso
del proceso de funcionalización. Esta y las otras caracterizaciones hechas,
muestran que la superficie ha sido funcionalizada, lo que implica que el óxido de
hafnio presenta un gran potencial para ser usado como biosensor.
Figura 4.14 Diagrama con espectros FT-IR de grupos funcionales que se añadieron durante el
proceso de funcionalización.
106
Capítulo V. Conclusiones y
Trabajo a Futuro
107
5.1 Funcionalización de superficies sólidas
En esta etapa del proyecto se desarrolló el protocolo de inmovilización de
biomoléculas sobre superficies sólidas y la evaluación del potencial de estas
superficies como inmunosensores. Las superficies con las que se trabajó fueron
Oxido de aluminio, oxido de hafnio y níquel. Un esquema del proceso de
funcionalización se muestra en la figura 5.1.
Figura 5.1 Esquema de funcionalización de superficies sólidas.
La superficie sólida era oxidada usando solución piraña o un sistema se UV-
ozono. Esto para añadir grupos hidroxilos sobre la superficie, después de esto,
dicha superficie era silanizada usando 3-APTES para funcionalizar la superficie
con moléculas de alcoxisilano. Luego se añade el glutaraldehído, el cual actuará
108
biomoléculas, por último se añadían las biomolécuas usando albúmina de suero
bovino como elemento de reconocimiento. Las caracterizaciones hechas indican
que los pasos en el proceso de funcionalización han sido exitosos y que las
biomoléculas se han fijado correctamente sobre las superficies por lo que los
materiales estudiados pueden ser aplicados en el uso de biosensores por medio
de la técnica de funcionalización descrita en este trabajo. En el caso del óxido de
hafnio se hicieron pruebas con Anti-BSA para analizar la reacción Ag-Ac en ese
tipo de materiales observándose que el BSA inmovilizado sobre las superficies de
HfO2 modificadas con APTES se unen con los anticuerpos de anti-BSA.
109
5.2 Funcionalización de Nanotubos de Carbono.
Para el caso de la funcionalización de CNTs, entre cada paso de la modificación
de la superficie se debe hacer un proceso de filtrado y CNTs funcionalizados
deben ser depositados sobre un substrato para su posterior caracterización como
inmunosensor. El esquema de funcionalización se muestra en la figura 6.2.
Usando el protocolo descrito en este trabajo, es posible oxidar y silanizar
nanotubos multicapa así como fijar el elemento de reconocimiento en el
biosensor, todos los pasos han sido comprobados por distintas caracterizaciones.
También se demostró que el sistema presenta potencial como inmunosensor al
hacer caracterizaciones eléctricas después de la interacción Ag-Ac.
Figura 5.2 Esquema de funcionalización de nanotubos de carbono.

110
5.3 Concentraciones Óptimas de las Superficies
Modificadas.
La tabla 6.1 Muestra los métodos de oxidación que se usaron dependiendo cual
fuera la superficie a funcionalizar, también se muestran las concentraciones
ideales y los tiempos, para los reactivos principales que se usaron en el proceso.
Material Oxidación Tiempo Silanización Enlazante

HfO2 Sistema UV- 2 horas 3-APTES Glutaraldehído
Ozono 10% v/v 6% v/v
Al2O3 3:1 H2SO4/H2O2 1 hora 3-APTES Glutaraldehído
3% v/v 1.25% v/v
CNTs 3:1 H2SO4/HNO3 24 horas 3-APTES Glutaraldehído
6% v/v 3% v/v
Tabla 5.1. Métodos, concentraciones y tiempos usados en las tres superficies funcionalizadas.
5.4 Publicaciones
A continuación se enuncian los trabajos que se publicaron durante mi trabajo
doctoral como parte de este y de otros proyectos.
1. E.S. Kolosovas-Machuca and F. J. González “Distribution of skin
temperature in Mexican children”, Skin Research and Technology 17(3),
326-331 2011.
2. Castillo-Martínez, Valdes-Rodríguez, E.S Kolosovas-Machuca; B.
Moncada; F.J. González "Use of digital infrared imaging in the assessment
of childhood psoriasis", Skin Research and Technology 19(1) e549-e551
2013.
111
3. Medina-Preciado, E.S. Kolosovas-Machuca, Miranda-Altamirano and F.
J. González "Non-invasive determination of burn-depth in children by digital
infrared thermal imaging” Journal of Biomedical Optics 18(6), 061204 2013.
4. Martínez-Jiménez, Aguilar-García, Valdés-Rodríguez, Metlich-Medlich,
Porro-Dietsch, Gaitán-Gaona, E.S. Kolosovas-Machuca, F.J. González,
Sánchez-Aguilar. “Local Use of Insulin in Wounds of Diabetic Patients
Higher Temperature, Fibrosis and Angiogenesis” Plastic and
Reconstructive Surgery 132(6):1015e-9e 2013.
5. H. Díaz de León Torres, E.S. Kolosovas-Machuca, Jorge Simón, Vera-
Reveles, Edgar Briones, F. J. González “Use of infrared imaging in the
analysis of planar antennas” Microwave and Optical Technology Letters.
(aceptado).
6. Alejandra Ortiz-Dosal, E. S. Kolosovas-Machuca, Rosalina Rivera Vega,
Jorge Simon and Francisco Javier González “Case series. Use of infrared
thermography in children with shock” SAGE Open Medical Case Reports
(aceptado).
7. E.S.Kolosovas-Machuca, Vera-Reveles, Rodríguez-Aranda, L.C. Ortiz-
Dosal, Segura-Cardenas and F. J. Gonzalez “Resistance-based Biosensor
of Multi-Walled Carbon Nanotubes” Journal of Immunoassay and
Immunochemistry DOI:10.1080/15321819.2014.908129.
112
5.5 Trabajo a Futuro
Los resultados obtenidos traen como consecuencia el surgimiento de nuevas
inquietudes por lo que a continuación se presentan algunas líneas de trabajo a
futuro que podrían mejorar los métodos discutidos en esta tesis, así como darle
una continuidad al trabajo que permita mejorar y hacer más eficientes varios
aspectos presentes en el.
5.5.1 Análisis del Potencial de otros Tipos de Silanos Sobre los
Materiales Estudiados
Existen muchos tipos de silanos que se pueden usar en el proceso de
funcionalización de superficies, cada uno con ventajas y desventajas reportadas.
Analizar el potencial de otros silanos tales como el Polymethylhydrosiloxane el
cual es más barato, fácil de manejar y amigable con el ambiente se presenta
naturalmente como una línea de trabajo a futuro.
5.5.2 Síntesis y Funcionalización de Nanopartículas Metálicas
La modificación de materiales nanométricos proporciona nuevas características y
funciones en estos que pueden ser de interés si se les quiere dar aplicaciones
distintas. Por lo anterior, la funcionalización de nanopartículas metálicas y su
aplicación se presenta como una línea de investigación a futuro. La figura 5.3
muestra un espectro típico de absorbancia de la plata comparado con la misma
suspensión luego de habérsele fijado albúmina de suero bovino. El plasmón de la
plata disminuye en el espectro con el BSA fijado a las NPs mientras que el rango
113
que corresponde al pico de absorción del BSA, el cual se mostró en la figura 4.7,
se satura debido a la presencia de esta proteína.
Figura 5.3 Absorbancia de nanopartículas de plata y nanopartículas de plata funcionalizadas.
Figura 5.4 Absorbancia UV-vis de NPs de plata incubadas con diferentes concentraciones de BSA
(a-e) El porcentajes de las concentraciones de HSA varían de 0,1,10,50 y 75%.
114
Por otro lado, en la figura 5.4 se observa como el plasmón de la plata disminuye
conforme aumenta la concentración de albúmina de suero bovino que ha sido
incubada con las nanopartículas de plata.
5.5.3 Aplicación de la Técnica de Espectroscopia Raman de
Superficie Amplificada.
La técnica de espectroscopia Raman de superficie amplificada o SERS (por sus
siglas en inglés surface enhanced Raman scattering), que usa sensores de
nanopartículas de metales nobles (Ag, Au y Cu), ha demostrado ser una técnica
muy efectiva para superar los problemas de sensibilidad, inherentes a la
espectroscopia Raman dispersiva convencional. Usando la técnica SERS, la
sensibilidad de detección se mejora hasta 6-10 órdenes de magnitud con
respecto a la espectroscopia Raman convencional [80,81]. La figura 5.5 muestra
una gráfica de correlación, en ella se observa que cuando se usan NPs de plata
para amplificar la señal el límite de detección es mayor.
115
Figura 5.5 Limite de detección de HSA con y sin nanopartículas de plata.
5.5.4 Inmunosensores para la Detección de Adiponectina
La adiponectina (APN) es una proteína, de 30 kDa, compuesta por 244
aminoácidos y codificada en el brazo largo del cromosoma 3. La APN está
involucrada en una amplia variedad de procesos fisiológicos incluyendo el
metabolismo energético, la inflamación y la fisiología vascular, actuando
directamente en el hígado, el músculo esquelético y el endotelio vascular [82,83].
En diferentes estados de resistencia a la insulina como la obesidad y la diabetes
tipo 2 y en las enfermedades cardiovasculares, hay una disminución de la
concentración de adiponectina. La cuantificación de esta proteína podría permitir
la caracterización de estos pacientes en función del riesgo de desarrollar
complicaciones. El método convencional para la detección de la APN es el ELISA
116
sin embargo mediante métodos alternativos tales como el uso de
inmunosensores, más rápidos y de menor costo, se podría monitorear a
pacientes con una mayor frecuencia. Lo anterior justifica la investigación del uso
de biosensores para detectar APN.
5.5.5 Diseño y Fabricación de Biosensores Ópticos
Se funcionalizarán fibras ópticas con un método similar al que se ha descrito en
este trabajo con la finalidad de obtener biosensores ópticos que permitan
detectar proteínas especificas cuando estas se fijen a la fibra funcionalizada
mediante un cambio en el índice de refracción de la misma por la interaccion
antígeno-anticuerpo.
117
Apéndice
% Programa en matlab para gráficar frecuencia vs impedancia de

Electrodos 1,2 y 3
f=[0:1:35]; %frecuencia MHz

C1= 50.48e-6; %Capacitancia de electrodo 1 en pF
Z1= 1./(2.*pi.*f.*C1);% Impedancia Electrodo 1
subplot(2,2,2);
plot (f,Z1,'r','linewidth',5)%gráfica de frecuencia vs impedancia E1
title('Electrodo 1','FontName','Arial','FontSize', 22); %Título
xlabel('Frecuencia (MHz)','FontName','Arial','FontSize', 22);%Etiqueta
de eje x
ylabel ('Z (ohms)','FontName','Arial','FontSize', 22); % Etiqueta de eje
y
subplot(2,2,3);
plot (f,Z2,'g','linewidth',5)%gráfica de frecuencia vs impedancia E2
title('Electrodo 2','FontName','Arial','FontSize', 22);
xlabel('Frecuencia (MHz)','FontName','Arial','FontSize', 22);%Etqueta de
eje x
ylabel ('Z (ohms)','FontName','Arial','FontSize', 22);% Etiqueta de eje
y
subplot(2,2,4);
plot (f,Z3, 'linewidth',5)%gráfica de frecuencia vs impedancia E3
title('Electrodo 3','FontName','Arial','FontSize', 22); % Título
xlabel('Frecuencia (MHz)','FontName','Arial','FontSize', 22);%Etiqueta
de eje x
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FUNCIONALIZACIÓN DE MATERIALES Y DISPOSITIVOS PARA SENSADO

Thesis · May 2014

Development of clinical prediction models to assess wound healing View project

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FUNCIONALIZACIÓN DE MATERIALES Y DISPOSITIVOS PARA

Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias Aplicadas

M.C. Eleazar Samuel Kolosovas Machuca

Dr. Francisco Javier González Contreras

San Luis Potosí, SLP Mayo de 2014

Eleazar Samuel Kolosovas Machuca

A Dios, a mi familia, a mis amigos, a mi asesor y a todos mis maestros.

La funcionalización de un material consiste en el proceso mediante el cual se

biológico de reconocimiento a la superficie del sensor. En este trabajo de

investigación se desarrolló un protocolo de funcionalización versátil para varios

pasos que se siguieron en proceso de hacer funcionales estos materiales (óxido

de hafnio, óxido de aluminio y nanotubos de carbono de capa múltiple) fueron:

Oxidación para crear grupos hidroxilos sobre la superficie del material.

Silanización usando 3-APTES para modificar la superficie con moléculas de

alcoxisilano. Adhesión del enlazante, añadiendo glutaraldehído, el cual actuará

biomoléculas. Anclaje del elemento de reconocimiento biológico, usando

albúmina de suero bovino como elemento de reconocimiento y finalmente

inmovilización de diferentes concentraciones de anti-albúmina de suero bovino

para evaluar el potencial de los materiales en aplicaciones en el área de

biosensores. Una vez optimizado el protocolo de funcionalización de las

superficies se procedió a aplicarlo en un biosensor resistivo de nanotubos de

carbono multicapa y en un biosensor capacitivo interdigitado con un

recubrimiento de óxido de hafnio.

Capítulo I. Introducción .......................................................................................... 7

1.1.2 Clasificación de los Biosensores .......................................................... 13

1.1.2.1 Biosensores Catalíticos ..................................................................... 13

1.1.2.2 Biosensores de Afinidad.................................................................... 13

1.1.2.3 Biosensores Capacitivos ................................................................... 14

1.1.2.4 Biosensores Resistivos ..................................................................... 15

1.2 Anticuerpos y Antígenos............................................................................. 15

1.2.1 Localización Anatómica de los Anticuerpos ......................................... 18

1.2.2 La Reacción Antígeno-Anticuerpo........................................................ 18

1.2.3 Enlaces que Participan en la Reacción Antígeno-Anticuerpo .............. 19

1.3 Inmunosensores ......................................................................................... 19

1.4 Inmovilización del Sistema de Reconocimiento Biológico Sobre las

Superficies de los Sensores ............................................................................. 20

1.4.1 Oxidación ............................................................................................. 22

1.4.3 Adhesión de un Enlazante, .................................................................. 24

1.4.4 Adhesión del Elemento de Biorreconocimiento .................................... 24

1.5 Justificación del Proyecto ........................................................................... 25

1.6 Objetivos del Proyecto................................................................................ 26

Capítulo II Diseño, Fabricación y Funcionalización de Dispositivos Interdigitados

2.1 Introducción ................................................................................................ 28

2.2 Capacitores Interdigitados .......................................................................... 31

2.3 Marco teórico de la simulación ................................................................... 32

2.4 Microlitografía ............................................................................................. 33

2.5 Funcionalización de inmunosensores interdigitados .................................. 34

2.6 Material y Métodos .................................................................................... 36

2.6.1 Parámetros de Simulación. .................................................................. 36

2.6.2 Proceso de microlitografía.................................................................... 38

2.6.2.1 Diseño en AutoCAD .......................................................................... 38

2.6.2.2 Reducción de alta resolución 1:10 .................................................... 39

2.6.2.3 Limpieza del substrato ...................................................................... 40

2.6.2.4 Proceso fotolitográfico ....................................................................... 40

2.6.3.1 Electrodo Interdigitado Al-Al2O3 (E4) ................................................. 41

2.6.4 Deposito de metal sobre substrato ....................................................... 42

2.6.5 Analizador de Impedancia Vectorial ..................................................... 44

2.6.7 Reactivos ............................................................................................. 45