Journal of Chromatography A, 1588 (2019) 77–84

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Revista de cromatografía A
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Separación de partículas similares a virus y vesículas extracelulares

mediante cromatografía de afinidad de heparina y flujo continuo
un segundo un
Katrin Reiter , Patricia Pereira Aguilar , Viktoria Wetter , Petra Steppert
segundo C un,segundo,∗
, Andres Tover , Alois Jungbauer
a Centro Austriaco de Biotecnología Industrial, Viena, Austria
bDepartamento de Biotecnología, Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida, Viena, Austria C Icosagen AS, Tartumaa, Estonia

información del artículo abstracto

Historia del artículo: La separación de partículas similares a virus envueltas de otras vesículas extracelulares es un problema de separación
Recibido el 29 de octubre de 2018 desafiante debido a la similitud de estas bionanopartículas. Sin métodos simples y escalables de purificación y análisis, es
Recibido en forma revisada el 12 de difícil obtener una visión más profunda de su función biológica. Se desarrolló un método de purificación cromatográfica de
diciembre de 2018 Aceptado el 17 de dos pasos. En el primer paso, se recolectaron partículas similares a virus y vesículas extracelulares y se separaron de las
diciembre de 2018 Disponible en línea el ®
18 de diciembre de 2018 impurezas más pequeñas en un modo de flujo continuo. Benzonase El sobrenadante del cultivo de células HEK 293 tratadas
se cargó directamente en una columna empaquetada con perlas de núcleo-capa. El flujo continuo recogido se purificó
adicionalmente usando cromatografía de afinidad con heparina. En la cromatografía de afinidad de heparina, el 54% de la
Palabras clave: carga total de partículas se encontró en el flujo continuo y el 15% de las partículas se eluyeron durante el gradiente lineal de
VLP de mordaza de VIH-1 sal. La caracterización de partículas, especialmente la distribución del tamaño de partículas y los datos de espectrometría de
Exosomas masas, sugiere que las vesículas extracelulares dominan la fracción de flujo continuo y que las VLP gag de VIH-1 están
Capto Heparina enriquecidas en el pico de elución. Esto está en parte en contradicción con otros protocolos en los que las vesículas
Capto Core 700 extracelulares se recuperan uniéndose a la cromatografía de afinidad con heparina.
HEK 293

© 2018 Los Autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

1. Introducción tosis de cuerpos multivesiculares, mientras que las microvesículas brotan

Se ha demostrado que los virus y las partículas similares a virus envueltas
(VLP) se coexpresan con otras vesículas extracelulares (EV) [1-4]. Usamos
VLP gag de VIH-1 producidas en células HEK 293 como sistema modelo
para estudiar la separación de estas bionanopartículas muy similares. La
separación y discriminación entre las VLP y los vehículos eléctricos gag del
VIH-1 representan un desafío importante debido a las similitudes
morfológicas y biofísicas [5], a menudo contienen las mismas estructuras
moleculares [6] y tener un tamaño similar. Para la producción de VLP gag del
VIH-1, la poliproteína gag se sobreexpresa en la célula, se acumula en la
membrana celular y conduce a la formación espontánea y al brote de VLP
desde la membrana plasmática [7]. Por lo tanto, las VLP están cubiertas con
una bicapa lipídica de la membrana de la célula huésped [8]. Los vehículos
eléctricos comprenden una mezcla de partículas heterogénea que incluye
diferentes subtipos como exosomas y microvesículas [9]. Los exosomas se
liberan a través de exocitos
∗ utilizan mecanismos de gemación parcialmente similares. Métodos de
Autor para correspondencia en: Departamento de Biotecnología, Universidad de Recursos
Naturales y Ciencias de la Vida de Viena, Muthgasse 18, 1190, Viena, Austria.
Dirección de correo electrónico: alois.jungbauer@boku.ac.at (A. Jungbauer).
directamente de la membrana plasmática [10]. Ambos están involucrados en
la comunicación intercelular y permiten que las células intercambien
proteínas, lípidos y material genético [11].
Las VLP de gag del VIH-1 varían entre 100 y 200 nm de diámetro,
algunos subtipos de vehículos eléctricos se encuentran en el mismo rango de
tamaño, especialmente exosomas (50 a 150 nm) y microvesículas (50 a 500
nm) [11-13]. Un segundo obstáculo en el proceso de separación de estas
bionanopartículas surge de sus densidades de flotación comparables: 1,13-
1,19 g / L para vehículos eléctricos [13-15] y 1,15-1,18 g / L para las VLP de
mordaza del VIH-1 [15,dieciséis]. Otro desafío en el desarrollo de dicho
proceso de separación es la falta de marcadores bioquímicos específicos en la
superficie o dentro de las partículas. Es difícil lograr una clara discriminación
y separación entre estas bionanopar-tículas, ya que ambas partículas contienen
proteínas de la bicapa lipídica de la célula huésped, compartiendo muchas
proteínas enriquecidas en la membrana plasmática, como las tetraspaninas
[17]. También muestran altas similitudes en la composición de proteínas
presentes en la superficie celular (integrinas) y en el citoplasma (proteínas de
choque térmico) [17],lo cual es concluyente ya que estas bionanopartículas
purificación típicos como centrifugación en gradiente de densidad,
ultrafiltración o cromatografía de exclusión por tamaño.

https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.12.035
0021-9673 / © 2018 Los Autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
78 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84
100, SIGMAFASTTM Tableta de sustrato OPD, solución de glutaraldehído
raphy, que se utilizan para la purificación de virus [18] y purificación de (grado I), acetonitrilo (grado MS), ácido fórmico (98-100%) y yodoacetamida
nanopartículas [19,20] no se recomiendan para una separación eficiente de (≥99%) se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
EV y VLP. Se ha demostrado que los virus [21-23] y VLP [24]se puede Anticuerpo monoclonal HSP90 (# MA1-10372), anticuerpo secundario IgG
purificar de manera eficiente usando cromatografía de afinidad de heparina, (H + L) anti-conejo
por lo que lo usamos como método alternativo para la separación de VLP y
EV. Una purificación directa en un solo paso usando cromatografía de
afinidad de heparina no es factible debido a la gran cantidad de proteínas de
unión a heparina presentes en los sobrenadantes de cultivos de células de
mamíferos. Estas impurezas proteicas competirían directamente con las bio-
nanopartículas por los sitios de unión de la heparina, reduciendo
drásticamente la capacidad de unión de las resinas. Por lo tanto, desarrollamos
un proceso cromatográfico de dos pasos. El primer paso es un método de flujo
continuo basado en la resina Capto Core 700 para la recolección de ambos
tipos de partículas. Las perlas de núcleo-capa con una capa exterior inerte y
un núcleo de octilamida activado por ligando se utilizan para la purificación
inicial de virus y otras bionanopartículas [25]. Las perlas están diseñadas para
tener propiedades hidrófobas y de carga positiva con un tamaño de corte
molecular de 700 kDa. Las bionanopartículas, como VLP y EV de gag del
VIH-1, superan los 700 kDa y no pueden ingresar al núcleo, mientras que las
proteínas, los fragmentos de ADN y otros metabolitos celulares pequeños
pueden penetrar en el núcleo y unirse a los ligandos de octilamida. Las
grandes entidades fluyen directamente a través de la columna. Por lo tanto,
este paso permite la eliminación de la mayoría de las pequeñas impurezas,
incluidas las proteínas de unión a heparina y, como el exterior de la perla está
inactivo, permite la purificación de VLP y EV. Capto Core 700 muestra un
tamaño de partícula de∼90 m. Para nuestro cálculo se asumió un tamaño de
poro dos veces mayor que el diámetro de las moléculas excluidas. El tamaño
de los poros se estimó con 25 nm. Para las proteínas esféricas, una proteína de
700 kDa tiene un tamaño de 11,7 nm [26]. Utilizando el diámetro de poro
estimado de 25 nm, el área de la superficie interna con porosidad
2 2
extrapartícula del 60% y el 90% fue de 67,2 m / mL y 100,8 m / mL,
respectivamente. Para un cálculo más detallado, sería necesaria una
microscopía electrónica exacta para obtener una dimensión de la capa y el
núcleo interno. En comparación con la cromatografía de exclusión por
tamaño, que también se aplica muy a menudo para la purificación de virus,
VLP y nanopartículas, la capacidad de las perlas de núcleo-capa es mucho
mayor. En la cromatografía de exclusión por tamaño, solo se puede cargar
alrededor del 30% del volumen total de la columna sin comprometer aún más
la pureza de la fracción de huecos [27]. En el caso de las perlas núcleo-
caparazón, debido al sitio de unión en su núcleo, se pueden cargar varios
volúmenes de columna mejorando la productividad y la robustez. Otra ventaja
es que el material de flujo continuo recogido en el primer paso de
cromatografía se puede cargar directamente en la segunda columna de
cromatografía (Capto Heparin) para su purificación adicional.

Desarrollamos una nueva estrategia de purificación que permite la

separación de EV y VLP en función del modo mixto de flujo continuo y la
cromatografía de afinidad.

2. Material y métodos

2.1. Productos químicos y estándares

Todos los productos químicos eran de calidad analítica, si no se indica lo

contrario. Benzonase® , cloruro de sodio (NaCl), hidróxido de sodio (NaOH),
dodecilsulfato de sodio (SDS), ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES),
Tween-20, ácido sulfúrico (95-97%, H2 ENTONCES4 ), acetato de uranilo se
adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania).
Ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (≥99,5%), 2-
propanol, albúmina de suero bovino (≥99,5%, BSA), 1 a 4 ditiotreitol (DTT),
TM
EZBlue Reactivo de tinción en gel, IgG anti-ratón (específico de cadena) -
anticuerpo de fosfatasa alcalina (# 3438), BCIP ® / Solución NBT, Triton X-
 paso se agruparon y 20 mL se cargaron directamente en un XK de 2 mL
(# 31460), anticuerpo secundario superclonal anti-IgG (H + L) de ratón (#
A28177) y Super SignalTMEl sustrato de máxima sensibilidad West Femto se
adquirió de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Ver
azul®Plus 2 Pre-teñido Protein Standard y 4x LDS sample buffer se
adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El colorante Coomassie
Brilliant Blue G-250 se adquirió en Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EE.
UU.), El anticuerpo p24 del VIH-1 (ab9071) en Abcam (Cambridge,
Inglaterra), el anticuerpo anti-HSP70 humano (EXOAB-Hsp70A-1) de
System Biosciences (CA, EE. UU.), el kit ELISA p24 de proteína de la
cápside p24 del VIH-1 de Sino Biological (Wayne, EE. UU.) y tripsina de
Promega (Madison, Wisconsin, EE. UU.).

2.2. Expresión de VLP gag del VIH-1 en el sistema de cultivo celular

HEK 293

Para la producción de VLP gag de VIH-1, se utilizó la LLA 293 patentada

de Icosagen Cell Factory OÜ (derivada de 293-F, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, EE. UU.). Para 1 L de producción de VLP, 450 mL de cultivo
6
celular (3× 10 células / ml) se transfectó químicamente con el vector de
expresión VIH-gag (100 g) usando el Reactivo 007 (Icosagen AS, Tartumaa,
Estonia) en BalanCD®Medio HEK 293 complementado con GlutaMAX 4
mM (Thermo Fisher Scientific). El volumen del medio de cultivo celular se
elevó al volumen final agregando BalanCD ®Medio HEK 293 suplementado
con GlutaMAX 4 mM y alimento. El cultivo se alimentó durante la
producción con BalanCD®HEK 293 (la cantidad total de alimentación es el
30% del volumen final del medio) durante 7 días. El cultivo se recogió
mediante centrifugación durante 1000 gy 30 min y NaN al 0,01% 3 fue
añadido.

2.3. Sistema cromatográfico

Todos los experimentos cromatográficos se realizaron con un Äkta Pure

25 M2 equipado con una bomba de muestra S9 y un recolector de fracciones
F9-C (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se utilizó el software Unicorn 6.4.1
para la recopilación y el análisis de datos. Se controlaron simultáneamente los
siguientes parámetros: señales UV a 280 y 260 nm, conductividad y pH.

2.4. Experimentos de cromatografía preparativa

2.4.1. Cromatografía de flujo continuo de bionanopartículas con perlas

core-shell
Para la cromatografía de flujo continuo, se trataron 100 ml de
sobrenadante de cultivo celular HEK 293 con Benzonase ®(grado de pureza II,
Merck KgA, Darmstadt, Alemania) a una concentración final de 150 U / mL
durante 2 h, a temperatura ambiente y agitación moderada. El tratamiento con
endonucleasa fue seguido de una etapa de filtración usando un filtro de
jeringa de 0,8 m (filtro Millex AA, Millipore Bedford, MA, EE. UU.).
Benzonase®El sobrenadante del cultivo celular tratado y filtrado (100 ml) se
cargó en una columna XK 16/20 empaquetada con 5,4 ml de resina Capto
Core 700 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). El tampón A constaba de HEPES
50 mM, pH 7,2 y el tampón B de HEPES 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,2. Antes
de la carga, la columna se equilibró para 5 volúmenes de columna (CV) con
6% de B para permitir la misma conductividad que en el material de carga.
Después de la carga, la columna se lavó con B al 6% durante 10 CV para
garantizar que todas las especies no unidas puedan abandonar la columna
antes de comenzar el paso de elución. La elución se realizó aplicando un
gradiente escalonado de B al 100% y la regeneración se realizó con 10 CV de
NaOH 1 M y 10 CV de 2-Propanol al 30%. La velocidad de flujo fue de 1,3
mL / min, asegurando un tiempo de residencia de 4 min. Para mayor
investigación,

2.4.2. Separación de VLP y EV de gag de VIH-1 por afinidad por heparina

Fracciones de flujo continuo de la cromatografía de flujo continuo
 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84

Columna 16/20 empaquetada con resina Capto Heparin (GE Healthcare, sustrato el sustrato de máxima sensibilidad West Femto (Thermo Fisher
Uppsala, Suecia). Las fases móviles A y B fueron las mismas que en el paso Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Y
anterior. La elución se logró usando un gradiente lineal de sal de 6 a 100% B
en 20 CV, incluyendo un paso de retención al 100% B para 10 CV. El caudal
fue de 0,5 ml / min (tiempo de residencia de 4 min). La columna se regeneró
usando 10 CV de NaOH 1 M seguido de 10 CV de 2-propanol al 30%. Se
recogieron fracciones de 1 ml y se combinaron de acuerdo con el
cromatograma.

2.5. Determinación del contenido total de proteínas y el contenido de

ADN bicatenario

Para la determinación del contenido de proteína total, se utilizó el ensayo

de Bradford. Utiliza la unión del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) A las proteínas. El ensayo se
realizó en un formato de placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. La curva de calibración se obtuvo diluyendo el estándar de
albúmina de suero bovino (BSA) con tampón TE hasta un intervalo de
concentración de 25 a 200 g / ml.

El ADN bicatenario (dsDNA) fue determinado por Quant-iT TM

PicoGreen®kit de dsDNA (Life Technologies, Waltham, MA, EE. UU.) en un
formato de placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las señales de contenido de proteína y dsDNA se midieron con
Genius Pro Plate Reader (Tecan, Männedorf, Suiza).

2.6. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

(SDS-PAGE) y Western blot

SDS-PAGE se realizó utilizando condiciones de ejecución reducidas de

MES-SDS y NuPAGE®Bis / Tris Mini geles 4–12% (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EE. UU.). Para la desnaturalización de proteínas, se trataron 45 L de
muestra con 15 L de tampón de muestra 4x LDS y DTT al 1% (v / v), seguido
◦
de desnaturalización por calor durante 20 min a 96ºC. C. SeeBlue®Como
marcador de peso molecular de la proteína se utilizó el estándar de proteína
Plus 2 previamente teñido (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se utilizaron
las siguientes configuraciones electroforéticas: 400 V, 200 mA, 50 min. Las
bandas de proteína se tiñeron usando un EZBlue basado en Coomassie
TM
Brilliant Blue G-250 Reactivo de tinción en gel (Sigma Aldrich, St. Louis,
MO, EE. UU.).

Para el análisis de transferencia Western, las proteínas se transfirieron

utilizando Trans-Blot®sistema turbo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,
EE. UU.) y membranas de nitrocelulosa de 0,2 m (Whatman, Dassel,
Alemania). El tampón de bloqueo contenía BSA al 3% y Tween-20 al 0,1% (p
/ v). Para la detección de la proteína gag del VIH-1, las membranas se
◦
bloquearon durante la noche a 4 C y luego se incubó durante 2 h con
anticuerpo monoclonal primario de ratón contra VIH-1 p24 [39 / 5,4 A]
(Abcam, Cambridge, Inglaterra), diluido 1: 1000 en PBS-T y conteniendo 1%
de BSA. Se utilizó como anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (específico
de cadena) -anticuerpo de fosfatasa alcalina (# 3438, Sigma Aldrich, St.
Louis, MO, EE. UU.) Diluido 1: 1000 en PBS-T y que contenía 1% de BSA .
Para la visualización de la proteína gag del VIH-1, la membrana se incubó en
10 ml de BCIP premezclado®/ Solución NBT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO,
EE. UU.) Durante 2-3 min. Para la detección de proteínas de choque térmico,
se utilizaron como principal anticuerpo anti-HSP70 humana (EXOAB-
Hsp70A-1, System Biosciences, CA, EE. UU.) Y anticuerpo monoclonal
HSP90 (MBH90AB, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.)
anticuerpos. Las membranas se bloquearon durante 1 h en tampón de bloqueo
◦
y se incubaron durante la noche a 4ºC. C con el anticuerpo primario (1: 1000
diluido en PBS-T que contiene 1% de BSA). Posteriormente, la membrana se
incubó durante 1 h con el anticuerpo secundario utilizando una dilución 1:
4000 (HSP70: anticuerpo secundario anti-IgG de conejo (H + L), HRP
(31460) y HSP90: IgG anti-ratón (H + L) ) superclonal TManticuerpo
secundario, HRP (A28177) ambos Thermo Fisher Scien-tific, Waltham, MA,
EE.UU.). Para detección quimioluminiscente, Super SignalTM Se utilizó como
las proteínas fueron visualizadas por Lumi Imager (Boehringer Ingelheim, proteínas identificadas con al menos 2 péptidos y una puntuación MASCOT
Ingelheim, Alemania). más alta

2.7. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

Para la determinación de la concentración de partículas y la distribución

del tamaño de partículas, se utilizó el análisis de seguimiento de
nanopartículas (NTA). Los experimentos se realizaron en un NanoSight
NS300 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido) con un
módulo de láser azul (488 nm) y un filtro de densidad neutra. Las muestras se
diluyeron en agua sin partículas para obtener de 20 a 100 partículas por
fotograma. En total, se midieron tres diluciones diferentes por muestra. Se
◦
capturaron videos de 30 s usando una temperatura de 25 C. El nivel de la
cámara se ajustó manualmente, antes de las mediciones. Para la
determinación de la concentración de partículas, cada dilución se midió 5
veces. En total, se analizaron 15 videos para cada muestra.

2.8. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

La concentración de p24 de VIH-1 se determinó mediante el kit ELISA de

proteína de cápside p24 de VIH-1 p24 (Sino Biological, Wayne, EE.UU.).
Para romper las partículas y eliminar su bicapa lipídica, las muestras se
◦
incubaron con tampón SNCR [28] durante 10 min a 70 C, seguido de una
◦
incubación con Triton X-100 al 1,5% durante 10 min a 100 C. Se obtuvo una
curva de calibración lineal mediante dilución en serie del control positivo
proporcionado. UN SIGMAFASTTMComo solución de sustrato se utilizó una
tableta de sustrato de OPD (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) disuelta
en 20 ml de agua desionizada. La reacción se detuvo añadiendo 1,25 NH 2
ENTONCES4. La absorbancia se midió a 492 nm con una longitud de onda
de referencia a 630 nm con un lector Tecan Infinite 200 Pro (Tecan).

2.9. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Para la visualización de partículas, se adhirieron 30 L de muestra sobre

una rejilla de cobre con un tamaño de malla 400. Las muestras se incubaron
durante 1 min a temperatura ambiente. Después de eliminar el exceso de
líquido, las muestras se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5%
durante 15 min. Las muestras se lavaron tres veces con agua y luego se
tiñeron en una solución de acetato de uranilo al 1% durante 30 s. Se eliminó
el exceso de líquido y las rejillas se secaron al aire. Para la visualización de
2
un Tecnai G Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión de 200 kV
(FEI, Eindhoven, Países Bajos).

2.10. Análisis proteómico

Las muestras seleccionadas se digirieron en solución. Las proteínas se

alquilaron en S con yodoacetamida y se digirieron con tripsina (Promega,
Madison, WI, EE.UU.). Las muestras digeridas se cargaron en una columna
de separación Thermo Acclaim PepMap300 RSLC C18 (tamaño de partícula
de 2 m, 150 x 0,075 mm) con una precolumna Thermo Acclaim PepMap
utilizando ácido fórmico al 0,1% como disolvente acuoso. Se aplicó un
gradiente del 6% de B (B: 80% de acetonitrilo) al 40% de B en 45 min,
seguido de un gradiente de 10 min del 40 al 90% de B que facilita la elución
de péptidos grandes, a una velocidad de flujo de 0,3 l / min. La detección se
realizó con un QTOF MS, Bruker maXis 4 G ETD (Bruker, MA, EE. UU.),
Equipado con la fuente de pulverización cautiva en modo DDA de iones
positivos (= cambio a modo MSMS para picos de elución). Se registraron
exploraciones por EM (rango: 150-2200 Da) y se seleccionaron los 6 picos
más altos para la fragmentación.

Los archivos de análisis se convirtieron (utilizando Data Analysis,

Bruker) a archivos mgf, que son adecuados para realizar una búsqueda de
iones MS / MS con ProteinScape 3.0 (Bruker, MASCOT integrado). Los
archivos se buscaron en la base de datos de Uniprot (http://www.uniprot.org)
para todos los organismos y homo sapiens (id de taxonomía: 9606). Solo
80 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84

tabla 1
Balance de masa de la ejecución de cromatografía de flujo continuo, utilizando una columna
Capto Core 700 de 5,4 ml. S: sobrenadante del cultivo celular HEK 293, L: material de carga
(sobrenadante del cultivo celular HEK 293 tratado con Benzonase® y filtrado 0,8 m del lote 1);
FT: flujo continuo; W: lavar; E: pico de elución; R1: regenerar 1 (NaOH 1 M); R2: regenerar 2
(30% de 2-propanol).

Recuperació
Volumen Partículas n Proteina total dsDNA p24
[mL] [parte / ml] [%] [g / mL] [ng / mL] [ng / mL]
Dakota del
S 100,0 1.2E + 11 - 491,5 1647,3 Norte
L 100,0 1.3E + 11 100,0 472.1 339,4 683,7
PIE 100,0 9.4E + 10 73,1 274,3 246,6 626,6
W 54,3 3.3E + 09 1.4 49,7 <LLOQ 31,6
mi 10,9 3.1E + 09 0,3 228,4 156,8 33,7
Dakota del
R1 10,9 Norte n/A 69,9 <LLOQ <LLOQ
Dakota del
Figura 1. Cromatograma de una ejecución de cromatografía de flujo continuo para la R2 10,9 Norte n/A 1165.0 193.0 <LLOQ
eliminación de impurezas de pequeño peso molecular de 100 ml de sobrenadante de cultivo Suma - - 74,8 - - -
celular HEK 293 tratado con Benzonase® y filtrado a 0,8 m, que contiene VLP gag de VIH-1 y nd - no determinado.
EV de células huésped. Se utilizó una columna Capto Core 700 de 5,4 ml. El tiempo de na - no aplicable.
residencia fue de 4 min. La columna se equilibró (antes de cargar) y se lavó (después de cargar) <LLOQ - inferior al límite inferior de cuantificación.
con HEPES 50 mM, NaCl 120 mM, tampón de pH 7,2. La elución se logró usando HEPES 50
mM, NaCl 2 M, tampón de pH 7,2. FT: flujo continuo; W: lavar; E: pico de elución.

a los obtenidos en otros métodos de purificación de virus y VLP, como las

se aceptaron más de 50 para análisis adicionales. Alternativamente, los
archivos se buscaron con GPM (algoritmo X! Tandem incrustado) en una
base de datos humana que contiene datos de la secuencia del VIH
(descargados de Uniprot, octubre de 2018).
2.11. Dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS)
Las mediciones de MALS para la determinación de la intensidad de
dispersión de la luz se realizaron utilizando un sistema Ultimate 3000 HPLC
(Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) Con una bomba cuaternaria LPG-
3400SD, un muestreador automático WPS-3000TSL y un detector UV DAD
3000 . La fase móvil consistió en HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. Se
inyectó un volumen de muestra de 30 L en modo bypass utilizando un caudal
de 0,3 ml / min. Todas las muestras se midieron por duplicado. Las señales
MALS fueron adquiridas por el detector de 18 ángulos DAWN HELEOS
(Wyatt, Santa Barbara, CA, EE. UU.). Para la programación de HPLC se
utilizó el software Chromeleon 7 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE.UU.).
La recopilación y análisis de datos MALS se realizó con el software ASTRA,
versión 6.1.2 (Wyatt, Santa Barbara, CA, EE. UU.).
3. Resultados y discusión
técnicas de ultracentrifugación y filtración [29–31]. Además, fue posible
lograr una mayor recuperación de partículas en el flujo continuo (hasta 95%)
simplemente aumentando el volumen de carga (hasta 225 mL) y / o
cambiando el hardware de la columna (Tabla S1, Material suplementario B ).
El aumento en la recuperación al cambiar el hardware de la columna,
especialmente las fritas de la columna, sugiere que las partículas quedan
atrapadas en las fritas. Esto puede ocurrir por adsorción no específica de las
partículas en la superficie de la frita o por atrapamiento de las partículas en
poros sin salida. Además, el aumento en la recuperación al aumentar el
volumen de carga (manteniendo el mismo hardware) sugiere que las partículas
se adsorben de manera no específica a otras superficies que pueden incluir el
hardware de la columna (pared de la columna y tubería), así como la estación
de cromatografía (bombas, tubería). y detectores). Esas superficies tienen
"sitios de unión" limitados, dando como resultado un número máximo de
partículas que pueden perderse por adsorción inespecífica. En consecuencia, a
medida que aumenta el número de partículas cargadas (aumentando el
volumen de carga), la cantidad relativa de partículas que se pierden por la
unión no específica disminuye, lo que conduce a recuperaciones más altas.
Por esa razón, en este método, la pérdida de VLP por adsorción no específica
cuando se utilizan volúmenes de carga industrialmente relevantes no
representará una pérdida significativa en la recuperación del proceso.

El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un método cromatográfico

para purificar las VLP gag del VIH-1 y separarlas de los EV de la célula
huésped. Se desarrolló un método cromatográfico de dos pasos. El primer
paso, basado en la tecnología multimodal core-shell, se operó en modo de
flujo continuo y tenía como objetivo eliminar pequeñas impurezas como
proteínas de la célula huésped y fragmentos de ADN. El segundo paso,
basado en la cromatografía de afinidad de heparina, se utilizó para purificar y
separar VLP y EV y reducir aún más el contenido de impurezas.
3.1. Cromatografía de flujo continuo de bionanopartículas con perlas
core-shell
Para la purificación de VLP y EV de gag del VIH-1, Benzonase ® El
sobrenadante del cultivo celular tratado y filtrado se cargó en una columna a
escala de laboratorio (5,4 ml) empaquetada con resina Capto Core 700
(Figura 1). Se empleó un gradiente escalonado con NaCl 2 M para la elución
y se usaron dos etapas de regeneración diferentes con NaOH 1 M y 2-
propanol al 30% (Figura S1, Material suplementario A). Este método permitió
10
la recolección de partículas en el flujo continuo (9.4× 10 partículas / mL)
con un rendimiento del 73% y una recuperación total del 75% (tabla 1). Tanto
el rendimiento como la recuperación de este método son altos en comparación
La concentración de proteína total se redujo de 472.1 g / mL en el material
de carga a 274.3 g / mL en el flujo continuo, lo que corresponde a un
agotamiento del 42% (tabla 1). Esta reducción también se puede observar en
la SDS-PAGE (Figura 2A) donde FT contiene menos bandas que el material
de carga (L). Las fracciones combinadas se analizaron adicionalmente
mediante transferencia Western anti-p24 y ELISA p24 para detectar y
cuantificar la proteína gag del VIH-1. Además, se utilizó un Western blot anti-
HSP90 (marcador EV) para detectar la presencia de la proteína de choque
térmico 90. Según el ELISA de p24, el 92% del contenido de p24 se recogió
en el FT. Este resultado es compatible con el Western blot p24 (Figura 2B) ya
que la banda para la poliproteína gag (55 kDa) está presente en el FT, casi
ausente en la elución (E) y ausente en ambas regeneraciones (R1 y R2). La
presencia de proteína de choque térmico 90 en el FT fue confirmada por
Western blot anti-HSP90 (Figura 2C).
El sobrenadante del cultivo celular se trató con Benzonase ® , reduciendo
la concentración inicial de dsDNA de 1647.3 g / mL en el sobrenadante (S) a
339.4 g / mL en el material de carga (L, tabla 1). Además, se logró una
depleción de dsDNA del 27% durante el paso cromatográfico de flujo
continuo, con una reducción en dsDNA de 339.4 g / mL en L a 246.6 g / mL
en FT (tabla 1). Juntos, se logró un agotamiento total del 85% de dsDNA.
 Estos resultados demuestran la capacidad de la resina Capto Core 700
utilizada en modo de flujo continuo para pre-purificar bionanopartículas con
reducción del contenido total de proteína y dsDNA. El producto
 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84
Figura 2. Caracterización de las fracciones combinadas del ciclo de cromatografía de flujo continuo (Figura 1): (A) SDS-PAGE; (B) transferencia Western de p24; (C) Transferencia de Western
HSP90. METRO:
marcador de peso molecular; S: sobrenadante de cultivo celular HEK 293; L: material de carga (sobrenadante de cultivo celular HEK 293 filtrado con benzonasa y filtrado 0,8 m del lote 1);
La fracción de este paso (FT) puede luego purificarse adicionalmente usando
cromatografía de afinidad con heparina.
3.2. Separación de VLP y EV de gag del VIH-1 por afinidad de heparina
Varios estudios han demostrado el potencial de la cromatografía de
afinidad con heparina para la purificación de vehículos eléctricos [32], virus
[21,22,33] y VLP [24,34]. Además, se demostró que diferentes EV tienen
diferentes afinidades por los ligandos de heparina [32]. En nuestro trabajo,
exploramos la capacidad de la cromatografía de afinidad de heparina para
separar las VLP gag del VIH-1 recombinantes producidas en las células HEK
293 de las células huésped EV. Para ello se utilizó una columna Capto
Heparin de 2 mL. Para evitar interacciones inespecíficas debido a las
propiedades de intercambio catiónico de los ligandos de heparina [35], la
columna se equilibró con HEPES 50 mM, NaCl 120 mM, tampón pH 7,2
antes de la carga de la muestra. Después del equilibrio, la columna se cargó
con parte del flujo continuo (20 ml) recogido en el ciclo de cromatografía de
flujo continuo. La carga de la muestra fue seguida por un paso de lavado de
10 CV usando el tampón de equilibrio. La elución se logró usando un
gradiente lineal de sal de 20 CV de NaCl de 120 a 2000 mM, incluido un paso
de retención de 10 CV al final del gradiente (Fig. 3). La columna se regeneró
usando NaOH 1 M para 10 CV, seguido de 2-propanol al 30% para 10 CV
(Figura S2, Material suplementario A). Se recogieron fracciones de 1 ml
durante todo el ciclo cromatográfico. Todas las fracciones recolectadas se
inyectaron directamente en un detector MALS usando un HPLC en modo
bypass. Dado que la intensidad de la luz dispersa es proporcional al número
de partículas en un cierto volumen [36–39], utilizamos este método rápido
offline para detectar la presencia de partículas en cada una de las fracciones
recogidas (Fig. 3, Área LS). Tanto la absorbancia de UV como las señales de
intensidad de dispersión de luz se utilizaron como criterios de agrupación de
muestras. Las fracciones agrupadas (flujo continuo - FT y pico 1 - P1) se
analizaron más a fondo para cuantificar el dsDNA (ensayo Picogreen),
cuantificar y detectar proteínas totales y específicas.
®
(Ensayo de Bradford, SDS-PAGE, Western blot, p24 ELISA y espectrometría
de masas) y cuantificar y caracterizar partículas (NTA y TEM). El flujo y / o
elución de partículas de la columna Capto Hep-arin se puede rastrear mediante
la señal de dispersión de luz. EnFig. 3,cada barra en el gráfico representa el
área de dispersión de luz (área LS) de cada fracción de 1 ml recolectada
durante el proceso de purificación. Esta área corresponde al área bajo la curva
del pico de dispersión de luz obtenido con el detector MALS y es
directamente proporcional a la intensidad de dispersión. Como resultado, los
valores más altos del área LS representan una mayor concentración de
partículas. Considerando la señal del área LS durante la fase de carga (Fig. 3,
de 0 a 20 ml de volumen de retención), a pesar de que las partículas
comienzan a romperse inmediatamente después de la carga de 1 CV, se
observa un avance lento. Esto sugiere que mientras algunas partículas se unen
a los ligandos de heparina, otras quedan excluidas de la columna. Esto indica
que diferentes partículas tienen diferente afinidad por los ligandos de
heparina. Además, al final de la fase de carga (Fig. 3, a 20 mL) la señal del
área LS es aún más baja que la medida para el material de carga (datos no
mostrados), lo que indica que la columna no estaba completamente
sobrecargada. La muestra combinada de flujo continuo (FT) incluyó todas las
fracciones recolectadas de 1 CV después de que la columna comenzó a
cargarse hasta los primeros 2.5 CV del paso de lavado (Fig. 3, de 2 a 25 mL
de volumen de retención), asegurando simultáneamente que todas las
partículas no unidas estén contenidas en esta muestra y evitando la dilución de
la muestra.
11
La cantidad total de partículas no unidas (FT) fue de 5,4 × 10 ,
correspondiente al 54% de las partículas cargadas (Tabla 2). A pesar de que la
mayoría de las partículas en esta muestra tenían un diámetro de 160 nm (modo
estadístico medido por NTA), la distribución del tamaño de partícula era
amplia, variando de aproximadamente 100 a 500 nm de diámetro (Figura S3,
Material suplementario A). Esto sugiere la presencia de una población de
partículas heterogénea, que es común en las muestras de EV [12]. Además, el
FT contenía 24% de la proteína total (equivalente a una cantidad de proteína
de 0,7 mg), 64% del dsDNA (equivalente a un
82 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84

Fig. 3. Cromatograma de una cromatografía de afinidad con heparina para la separación de VLP y EV de gag de VIH-1. La columna se cargó con 20 ml de una fracción de flujo continuo de una serie
de cromatografía de flujo continuo (en la que el material de carga se trató con Benzonase® y se filtró 0,8 ml de sobrenadante de cultivo celular HEK 293 del lote 2). Se utilizó una columna de Capto
Heparina de 2 ml. El tiempo de residencia fue de 4 min. La columna se equilibró (antes de cargar) y se lavó (después de cargar) con HEPES 50 mM, NaCl 120 mM, tampón de pH 7,2. La elución se
logró usando un gradiente lineal de sal de 120 a 2000 mM de NaCl. FT: flujo continuo; W: lavar; P1: pico de elución 1; H: mantenga el paso (100% B).

Figura 4. Caracterización de las fracciones combinadas de la ejecución de cromatografía de afinidad de heparina (Fig. 3): (UN) SDS-PAGE; (B) transferencia Western de p24; (C) Western blot de
HSP70; (RE)
Transferencia de Western HSP90. M: marcador de peso molecular; L: material de carga (fracción de flujo continuo de una serie de cromatografía de flujo continuo); FT: flujo continuo; W: lavar; P1:
pico de elución 1; R1: regenerar 1 (NaOH 1 M); R2: regenerar 2 (30% de 2-propanol); NC: control negativo (medio de cultivo).

cantidad de dsDNA de 1,8 g) y 66% de la proteína gag del VIH-1
(equivalente a una cantidad de p24 de 3,6 g). Las partículas unidas comienzan
a eluir de la columna durante el gradiente lineal de sal a una conductividad de
aproximadamente 14 mS / cm (Fig. 3, a 44 ml). Todas las fracciones en la
-5
elución de gradiente lineal con área LS superior a 1.0× 10 cm min se
incluyeron en la muestra combinada de elución (Fig. 3, P1, de 44 a 66 mL de
11
volumen de retención). Una cantidad total de 1,5× 10 Se encontró partículas
en P1, correspondientes al 15% de las partículas cargadas (Tabla 2). El
análisis de tamaño de partículas por NTA reveló que la mayoría de las
partículas en P1 tienen un diámetro de 153 nm (modo estadístico) y el 80% de
las partículas tenían
un diámetro entre 133 y 230 nm (D10 y D90, respectivamente). Esto sugiere
la presencia de una población de partículas más homogénea, en comparación
con el FT. Además, previamente se demostraron distribuciones de tamaño de
partícula similares para las VLP gag del VIH-1 [5]. Además, P1 contenía el
-1 -1
12% de la proteína total (equivalente a una cantidad de proteína de 0,4 mg), el
18% del dsDNA (equivalente a una cantidad de dsDNA de 0,5 g) y el 25% de
la proteína gag del VIH-1 (equivalente hasta una cantidad de p24 de 1,3 g).
Mientras que la distribución de tamaños de partículas diferentes de FT y P1
sugiere la presencia de poblaciones de partículas diferentes, los resultados
obtenidos por SDS-PAGE, Western
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Figura 5. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las fracciones combinadas de la ejecución de cromatografía de afinidad de heparina (Fig. 3): (UN) carga de material; (B) flujo
continuo; (C) pico de elución 1. Las barras de escala corresponden a 200 nm.

Tabla 2 El contenido de proteína y el contenido de p24 fueron ligeramente superiores

Balance de masas de la cromatografía de afinidad de heparina para la separación de VLP y EV 9 9
en P1 (proteína total: 2,4 g / 10 partículas p24: 8,8 ng / 10 partículas) en
de gag de VIH-1, utilizando una columna de 2 mL de Capto Heparina. L: material de carga 9 9
(fracción de flujo a través de un ciclo de cromatografía de flujo a través en el que el material de comparación con FT (proteína total: 1,3 g / 10 partículas p24: 6,7 ng / 10
carga fue tratado con Benzonase® y sobrenadante de cultivo celular HEK 293 filtrado 0,8 m del partículas).
lote 2); FT: flujo continuo; W: lavar; P1: pico de elución. A pesar de los esfuerzos recientes en la caracterización del papel de los
Recuperaci
VE en la infección retroviral, así como de los estudios sobre las similitudes en
Volumen Partículas ón Proteina total dsDNA p24 la biogénesis de los VE y los retrovirus, hasta ahora no se ha descrito ninguna
[mL] [parte / ml] [%] [g / mL] [ng / mL] [ng / mL] característica discriminativa de estas partículas excepto por técnicas de
L 20,0 5.0E + 10 100,0 147,3 143,0 273,2 imagen de alta resolución como cryo-EM. Usamos la combinación de datos de
PIE 23,0 2.4E + 10 53,8 31.0 79,6 157,8 distribución de tamaño y datos proteómicos para caracterizar el tipo de
W 15,1 <LLOQ n/A <LLOQ <LLOQ <LLOQ partículas presentes en cada muestra. Este método es simple y quizás útil para
P1 22.0 6,9E + 09 15,1 16,5 22,7 61,0
el aislamiento rápido de vesículas extracelulares.
Suma - - 69,1 - - -
na - no aplicable.
<LLOQ - inferior al límite inferior de cuantificación.

blot y TEM no revelan diferencias significativas entre esas muestras. En el
SDS-PAGE, una banda alrededor de 55 kDa indica la presencia de la proteína
gag en ambas muestras (Figura 4A, FT y P1). Esto se confirma en el análisis
de Western blot (Figura 4SEGUNDO). Además, HSP70 y HSP90 se
utilizaron como proteínas indicadoras para vehículos eléctricos [40,41] y las
bandas correspondientes (70 kDa y 90 kDa) también se detectan mediante
análisis de transferencia Western en ambas fracciones (Figura 4C y D). Las
imágenes TEM demuestran la presencia de partículas esféricas intactas en
ambas muestras (Figura 5A, B y Figura S4, Material suplementario A).
Con el fin de caracterizar y discriminar aún más las poblaciones de
partículas separadas, se realizó el análisis proteómico de las fracciones
combinadas de FT y P1. Del total de 348 proteínas identificadas, 170 estaban
presentes en ambas fracciones, 62 solo en FT y 116 solo en P1 (Figura S5,
Material suplementario C, FT seleccionado y P1 seleccionado). Comparamos
estas proteínas con las 100 principales proteínas más identificadas en
vehículos eléctricos de la base de datos EVpedia (evpedia.info). Por un lado,
el 30% de las proteínas únicas en FT forman parte del TOP 100 de proteínas
más identificadas en VE. Por otro lado, solo el 6% de las proteínas únicas en
P1 están en esta lista. Además, se sabe que el 47% de las proteínas únicas en
P1 interactúan con la proteína gag del VIH-1 o se han encontrado
incorporadas en los virus gag del VIH-1 y partículas similares a virus
(interacciones del VIH-1 en ncbi.nlm.nih.gov /gene).
4. Conclusión
Este método de cromatografía de dos pasos que combina un flujo continuo
multimodal de núcleo-capa y una cromatografía de unión a heparina es capaz
de separar las VLP envueltas de los vehículos eléctricos. El primer paso es
principalmente para la reducción de pequeñas impurezas moleculares,
mientras que el segundo paso separa diferentes partículas. El método es
escalable y permite una rápida separación de partículas en un día. Esto está en
contradicción con otros protocolos en los que las vesículas extracelulares se
recuperan uniéndose a la cromatografía de afinidad con heparina. La
recolección de las fracciones debe realizarse con un detector como el análisis
de seguimiento de nanopartículas o la dispersión de luz de múltiples ángulos
para rastrear las partículas. La señal UV no es lo suficientemente sensible para
la detección de partículas. El método resuelve el problema crucial de la
separación y cuantificación de VLP y EV en una plataforma robusta escalable
con cromatografía. En comparación con otros métodos, como la
ultracentrifugación, esto abre la posibilidad de una producción a gran escala
de VLP y EV, así como el desarrollo de un método analítico basado en HPLC
a pequeña escala en el futuro.

Para realizar una adecuada comparación del contenido de impurezas y p24
(representativo del contenido de gag del VIH-1) entre ambas muestras (FT y
P1), los valores obtenidos en los ensayos ELISA Bradford, Picogreen y p24
9 Digitales y Económicos (bmwd), el Ministerio Federal de Transporte,
se normalizaron a 10 partículas (como dosis de vacunación hipotética). El
contenido de dsDNA por dosis fue similar en ambas muestras (FT: 3,4 ng /
9 9
10 partículas P1: 3,3 ng / 10 partículas). Estos valores ya cumplen los
requisitos de las agencias reguladoras (<10 ng de dsDNA residual por dosis)
[42]. El total
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por el Ministerio Federal de Asuntos
Innovación y Tecnología (bmvit), la Agencia de Promoción Empresarial de
Estiria SFG, Standortagentur Tirol, Gobierno de Baja Austria y ZIT - Agencia
de Tecnología de la Ciudad de Viena a través del Programa de Financiamiento
COMET gestionado por la Agencia Austriaca de Promoción de la
Investigación FFG. Las agencias de financiación no influyeron en la
realización de esta investigación. Patricia Pereira Aguilar fue apoyada por el
Austrian Science Fund (proyecto BioToP; FWF W1224). Queremos
agradecer a Friedrich Altmann y Clemens Grünwald-Gruber por proporcionar
datos de espectrometría de masas.
84 K. Reiter y col. / J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84
[20] MY Konoshenko, EA Lekchnov, AV Vlassov, PP Laktionov, Aislamiento de
Apéndice A. Datos complementarios vesículas extracelulares: Metodologías generales y últimas tendencias, Biomed. Res. En t. 2018
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Se puede encontrar material complementario relacionado con este
artículo, en la versión en línea, en doi:https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.
12.035.

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