Química Analítica ( Plan E ) Segundo Año.

Ingeniería Química
CRD: 1er Semestre Curso:
Conferencia # 6
Tema 5: Métodos Cromatográficos.
Sumario:
 Introducción a los Métodos Cromatográficos.
 Clasificación de los Métodos Cromatográficos.
 Generalidades sobre algunos Métodos Cromatográficos (CP, CCD, Columna, CG, HPLC).
Bibliografía:
 Pombo, R. Manual de Análisis Instrumental p213-316.
 Material Complementario en formato digital.
Objetivos:
 Familiarizar a los estudiantes con los Métodos Cromatográficos.
 Conocer su fundamento y su clasificación.
 Conocer generalidades sobre algunos Métodos Cromatográficos (CP, CCD, Columna, CG,
HPLC).
Introducción:
La experiencia científica acumulada en las últimas décadas indica que para poder estudiar y
analizar los sistemas biológicos y naturales, el hombre ha tenido que desarrollas un inagotable
conjunto de métodos de análisis capaces de ofrecer una información cada vez más exacta de la
composición de dichos sistemas.
Dado que en la naturaleza raramente existen sustancias puras, la determinación cuali y/o
cuantitativa de una de ella requiere, en general, un proceso previo de extracción o separación para
su posterior purificación y/o análisis.
¿Qué técnicas de separación uds. conocen?
Técnicas gravimétricas, filtración, destilación, evaporación, extracción, volatilización,
centrifugación, etc..
Pero para utilizar cada una de estas técnicas las muestras tienen que tener determinados
requisitos, es decir, el procedimiento analítico va a depender de las propiedades, características
del sistema bajo estudio.
Así por ejemplo: ¿Cómo separar una mezcla de S y limaduras de hierro?
Bueno, sencillamente pudiéramos emplear un imán que atraiga selectivamente las limaduras de
hierro de la muestra dejando el S sin afectar.
¿Cómo separar acetona (Teb: 580C) y H2O?.... a través de una destilación fraccionada.
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Pero de forma general, cuando los componentes de una mezcla se van pareciendo en sus
propiedades físicas o químicas, aumenta la dificultad de la separación e incluso a veces la de
identificación y/o cuantificación.
La mayoría de los métodos analizados en los temas de conferencias anteriores se emplean
frecuentemente con fines identificativos y/o cuantificativos (como es el caso de los volumétricos
para cuantificar). Pero en la actualidad la cromatografía es la técnica de análisis químico mas
difundida dado que su éxito radica en que permite separar cualquier tipo de mezcla de sustancias
de casi cualquier naturaleza:
- orgánica e inorgánica
- gases o polímeros
- sintéticos o naturales
Es una herramienta ideal para el análisis de cualquier producto porque generalmente las
sustancias no están aisladas, sino que son una mezcla de sustancias.
Y la pregunta puede ser: ¿pues separar para que?
Para identificar y cuantificar de forma individual aquellos componentes de la mezcla que sean
de interés. Es posible, en algunos casos, utilizando procedimientos específicos o muy selectivos, la
cuantificación de un componente determinado sin que sea necesario su aislamiento de la matriz
que lo contiene, pero desafortunadamente esto es poco frecuente.
En muchas ocasiones la cromatografía permite identificar y determinar cuantitativamente los
componentes de una mezcla de forma casi simultanea con su propia separación.
Origen y Concepto de Cromatografía:
Aunque varios investigadores precedieron a Tsweet en la descripción de métodos que se pudieran
llamar cromatográficos, el descubrimiento de esta técnica analítica se atribuye corrientemente a este
científico ruso, quien observó en 1906 que los pigmentos de las hojas verdes de las plantas podían
separarse al hacer atravesar un extracto de ellas en una columna rellena con carbonato de calcio. Las
bandas coloreadas, separadas individualmente pudieron ser colectadas en fracciones discretas al final
de la columna.
Fue Michael Tsweet quien utilizó por primera vez el término "cromatografía" (Khromatos – color
y graphos - escrito) para denominar esta técnica, lo cual literalmente significa impresión de colores.
Aunque en realidad los componentes a separar por lo general son incoloros, se ha mantenido su
denominación por razones históricas.
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A partir de estos experimentos iniciales tan burdos, la técnica cromatográfica se ha diversificado
en un numero de técnicas de separación que incluyen la cromatografía de papel, la de placa delgada,
la de columna, la liquida, la gaseosa y otras.
El concepto de cromatografía es hoy mucho más amplio y abarca todos los métodos
cromatográficos desarrollados hasta el presente.
Este concepto ha sido expresado de distintas formas por varios autores, pero la definición mas
completa y abarcadora fue publicada por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada
(IUPAC):
“La Cromatografía es un método físico usado principalmente para la separación de los
componentes de una muestra, en el cual estos se distribuyen entre dos fases, una de ellas
estacionaria mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede estar empacada en una
columna, esparcida en forma de capa o distribuida como una película. La fase móvil puede ser
gaseosa o un liquido.”
Pero esta claro que en cualquiera de los enunciados que podamos encontrar debe estar
planteada la interacción de las sustancias a separar en dos fases diferentes e inmiscibles entre
ellas. Una de estas fases (FM) se desplaza a través o a lo largo de la otra que permanece fija (FE).
Proceso Cromatográfico
La separación de una mezcla de sustancias se consigue en la cromatografía por la distribución
selectiva de c/u de los constituyentes en la fase estacionaria a medida que se mueven disueltas en
la FM.
La fase móvil puede estar constituida por uno o varios líquidos miscibles o ser gaseosa, es
decir, es un fluido (puede ser gas, líquido o fluido supercrítico) que se usa como portador de la
mezcla.
La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa
como soporte, de gran área superficial.
Los componentes que se desean separar por cromatografía deberán ser solubles en la fase
móvil y ser capaces de interaccionar con la fase estacionaria ya sea disolviéndose en ella,
adsorbiéndose, mediante reacciones de intercambio iónico, tamaño molecular, densidad de carga
iónica, solubilidad, etc.
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Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyan de
modo diferente entre la FM y la FE. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la FE
se mueven lentamente con el flujo de la FM, por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la FE se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los
componentes de la muestra se separan en bandas separadas que pueden analizarse cuali y/o
cuantitativamente.
Clasificación de los Métodos Cromatográficos
Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos. De forma general, según la
literatura, se puede clasificar la Cromatografía por sus variantes:
 Fase Móvil (puede ser gaseosa, líquida ó fluido supercrítico)
 Fase Estacionaria
 Mecanismo de Retención (tipos de equilibrios implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases).
 Forma de Contacto entre las fases (columna ó superficie plana)
 Dimensionalidad
 Escala Física
 Gradientes , entre otras.
Pero las formas más empleadas son en base a:
a) La forma en la que la FE y la FM se ponen en contacto.
b) Tipo de interacción entre los solutos y las fases M y E.
c) Según el estado físico de la FM y la FE.
d) Según la finalidad del análisis.
 La forma en la que la FE y la FM se ponen en contacto:
C. Plana: la FE se mantiene sobre una placa lisa o en los intersticios de un papel, en este caso
la FM se desplaza a través de la FE por capilaridad o por gravedad.
C. Columna: la FE se mantiene dentro de un tubo estrecho a través del cual se hace pasar la
FM por presión o por gravedad.
Es importante señalar que los equilibrios en que basan ambos tipos de cromatografías son
idénticos y que la teoría desarrollada para la C. Columna se adapta también fácilmente a la C.
Plana.
 Tipo de interacción entre los solutos y las fases M y E.
- adsorción ………………Cromatografía por adsorción
- absorción, distribución, partición o reparto ………………. Cromatografía por reparto
- intercambio iónico …………………. Cromatografía por intercambio iónico
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- exclusión por tamaño ……………… Cromatografía por exclusión por tamaño
Adsorción (FE-----sólido/ tipo de cromatografía: liq-sol o gas-sol)
La adsorción es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un
sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial.
La adsorción es un fenómeno que depende de la naturaleza de la substancia adsorbida, de la
temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisión del adsorbente, y de la concentración.
Ejemplos de estos sólidos (FE) son los óxidos metálicos, óxidos hidratados, etc e/ los mas
populares se encuentran el gel de sílice y la alúmina (Al 2O3).
Esta retención del componente y su consiguiente separación depende de la habilidad de los
centros activos (átomos, partículas) de la superficie (FE) de captar al soluto desde la FM y
adsorberlo temporalmente mediante las fuerzas de acción reciproca que se manifiestan en la
interfase FM-FE las cuales tienen naturaleza electrostática. ¿y de que tipo de fuerzas estamos
hablando?
a) Interacción dipolo-dipolo
b) Interacción dipolo-dipolo inducido
c) Interacción dipolo fluctuante o de dispersión
d) Interacción por puente de hidrógeno
¿Cómo se traduce esto? Sencillamente sobre la FE quedarán retenidas primero aquellas
sustancias cuyas interacciones sean mas intensas. Aquellas de interacción más débil con la FE
serán retenidas por la FM, es decir, no serán retenidas por la FE.
Ha quedado claro que estas interacciones tienen lugar constante y simultáneamente con la
corrida de la FM.
Absorción (partición, distribución o reparto) (FE-----liq/ tipo de cromatografía: liq-liq o gas-
liq)
En este tipo de cromatografía la separación de las sustancias mezcladas se debe a la diferencia
de solubilidad de estas en la FM y la FE.
La FE es un liquido que esta soportado por un sólido inerte y la FM puede ser otro medio liquido
o gaseoso.
En este proceso de partición (absorción, reparto o distribución) están involucradas las mismas
interacciones moleculares que tienen lugar en la adsorción. La diferencia esencial consiste en que
el proceso en este caso tiene lugar en toda la masa de la FE y no solo en su superficie.
Ejemplos de estas FE tenemos la celulosa o gel de sílice impregnadas en H 2O (FE).
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La retención del soluto esta en función de la solubilidad relativa de esta en ambas fases según
lo determina el coeficiente de reparto.
Intercambio Iónico
La FE es una matriz polimérica a la cual han sido enlazados químicamente grupos funcionales
iónicos (Ejemplos: ácidos carboxílicos o aminas cuaternarias) capaces de ser intercambiados con
los de igual tipo de carga, presentes en el medio circundante. Se emplea en la separación de
sustancias iónicas tanto orgánicas como inorgánicas.
Los solutos iónicos son retenidos debido a la formación de enlaces químicos de carácter
electrostáticos con los grupos funcionales de la FE.
La FM siempre es un líquido.
Ejemplos:
___SO3-H+ (g. sulfónico: Ocurre un intercambio catiónico, los H+ son los que se intercambian)
___(N(CH3)3)+ OH- (g. hidroxilo de un amonio cuaternario: Ocurre un intercambio aniónico, los
OH- son los que se intercambian)
La FE puede ser un intercambiador natural o sintético. Estos últimos son los mas empleados y
existe una gran diversidad de resinas de intercambio aniónicas o catiónicas.
Las características más generales de un intercambiador son:
a) poseer una matriz inerte e insoluble
b) poseer en su superficie grupos funcionales ionizables
c) el intercambiador debe ser reversible (permite recuperar el material)
Exclusión por tamaño
En este tipo de cromatografía no hay interacción, es decir, no se establece equilibrio ni de
adsorción ni de reparto entre la FM y la FE.
La FE es un laberinto con numerosos poros de dimensiones moleculares. Los solutos con
tamaño molecular suficientemente pequeño difunden dentro de los poros y son los mas retenidos,
las moléculas mas grandes que no pueden penetrar en los poros permanecen en la FM no siendo
retenidos sino excluidos.
La FM puede ser un líquido o un gas.
Este método es útil en muestras con tamaños moleculares diferentes.
Ejemplos de FE: Sephadex (se obtiene a partir de un polisacárido, dextrana), biogeles de
poliacrilamida de enlaces entrecruzados.
 Según el estado físico de la FM y la FE.
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FE FM Empleo
CCD, Columna (adsorción)
Cromatografía sólido liquido HPLC (intercambio iónico, exclusión por
tamaño)
Cromatografía sólido gas CG (adsorción)
Cromatografía liquido liquido CP, CCD, Columna (partición)
Cromatografía liquido gas CG (partición)

 Según la finalidad del análisis.

- Analítica: para identificar y/o cuantificar
- Preparativa: para obtener cantidades apreciables de un compuesto, para luego ser utilizado o
sea, purificación de un compuesto.
De forma general:
También se puede hablar de 3 clases de cromatografía:
a) C. liquida
b) C. Gases
c) C. Fluidos Supercríticos
O como:
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Cromatografía Plana FE FM mecanismo
Partición o reparto (diferencia solubilidad
C. Papel liquido (H2O) liquido
entre 2 fases)
Adsorción (retención en la superficie de
CCD sólido liquido
la FE del soluto)

Esta cromatografía plana se utiliza fundamentalmente con fines identificativos por ser
muy simple.
Cromatografía en
FE FM mecanismo
Columna
C. Columna sólido liquido Adsorción
sólido gas Adsorción
C. Gases
liquido gas Partición o reparto
sólido liquido Adsorción, Intercambio Iónico
HPLC
liquido liquido Partición o reparto

La cromatografia de columna se utiliza para separar y cuantificar, ofrece una amplia gama de
FEs.
La CG y HPLC requieren de equipamiento mas desarrollados, por tanto dan una alta resolución
y posibilitan una eficiente separación y cuantificación de cantidades muy pequeñas de sustancias.

Ténica de separación cromatográfica

Por técnicas de separación cromatográficas se entienden las formas de poner en contacto las muestras
problema con la fase móvil y estacionaria, la más habitual es la técnica de elución. La cromatografía de
elución consiste en que una única porción de la muestra disuelta en la fase móvil se introduce en la parte
superior de la columna (donde se encuentra la fase estacionaria), después de lo cual la mezcla se distribuyen
entre ambas fases.
Seguidamente, se agrega de forma continua fase móvil (eluyente), lo que hace avanzar
columna abajo a las muestras en una serie de transiciones entre la fase móvil y estacionaria. El
movimiento de los solutos (componentes de la mezcla) tiene lugar sólo en la fase móvil y la velocidad media
de avance depende del tiempo que el soluto permanece en esta fase.
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